Name: micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides
Uploaded: 2013-05-23T17:00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 655) og Den Europæiske Union (Zf-sundhed).

1.. Forberedelse af Injection Mixture <ol><li> Brug vivo morpholinos som celler internalisere dem mere effektivt end normale morpholinogrupper molekyler. Se fabrikantens oplysninger for detaljer (Tabel 1: reagenser og materialer). </li><li> Brug en fluorescerende sporing farvestof (f.eks CellTracker Red CMTPX, Invitrogen) til at visualisere nøjagtigheden af injektionen. Dette farvestof metaboliseres i cellen og bliver fluorescerende kun i cellen efter optagelsen. Derfor er dette trin er afgørende at fastlægge de celler, der effektivt er omfattet af den cerebroventricular mikroinjektion. </li><li> Forbered phosphatpufret saltvand (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH: 7,4) til fortynding morpholino løsning. Hvis en udvanding af morpholino løsning er påkrævet, altid bruge PBS. </li><li> Forbered 10 ul af injektionen blandes ved tilsætning 9 pi morpholino opløsningen og 1 pi af the cell tracker farvestof (fortyndet eller ufortyndet Bestanden koncentration af morpholino opløsningen er 500 pM Vores tidligere resultater 22 indikerer, at flere forskellige doser af morfolino -.. fra 50 pM til 500 pM - resultere i forskellige niveauer af knockdown fra et effektivt knockdown til hypomorphic fænotyper). 1 ml af opløsningen er nok til injektion i en zebrafisk hjerne. </li><li> Bland godt og opbevares ved stuetemperatur, indtil injektionen. </li></ol> 2.. Forberedelse af injektionsapparatet <ol><li> Forbered glas injektion kapillærer hjælp af en nål aftrækker. Brug følgende parametre: Varme cyklus værdi: 463, trække cyklus værdi: 230, Hastighed: 1,5 sek, tid: 75 msek. </li><li> Tænd trykkilden og justere trykindstillinger til 50 psi eller 3,5 barer. </li><li> Juster microinjector indstillingerne på følgende måde: Hold tryk 20 psi, eject tryk 10 psi, periode værdi på 2,5 og 100 msek vifte af gating. </li><li> Drejpå ringen belysningen og find ring over mikroskopbordet. </li><li> Anbring kapillære indehaver til en passende position ved siden af ​​mikroskopet. </li><li> Sæt glaskapillar i holderen. Juster injektion vinkel til 45 grader. </li><li> Bræk spidsen af ​​glaskapillar med en fin-end pincet og kalibrere trykket outputtet fra åbningen. Dette skal afprøves ved at nedsænke spidsen af ​​nålen ind i fisken vand og give en kontinuerlig trykimpuls. Luftboblerne opstår kun bør være én række, hvilket er en indikation af optimalt tryk / åbning størrelse. Se videoen for demonstration af denne kalibrering. </li><li> Indlæse glaskapillar med injektionen løsning uden fældefangst luftbobler. </li><li> Påfør tryk for at fjerne luften mellem spidsen af ​​glaskapillar og den belastede injektionsopløsning. </li></ol> 3.. Anæstesi <ol><li> Forbered stamopløsning af de bedøvelsesmidler (0,1% MESAB - ethyl-m-aminobenzoat methansulfonat). </li><li> Fjern ønskede antal fisk fra deres tanke i plast mus bure eller anden transportbeholder med tilstrækkelig mængde vand. </li><li> Forbered bedøvelse opløsning i en lille plastkasse ved at blande 200 ml fisk vand med 5 ml af bedøvelsesmidler stamopløsning. Slutkoncentration af bedøvelsesmidler: 0,0025% (v / v). </li><li> Half-fylde en plastik petriskål med anæstetika. Brug denne parabol til injektioner. </li><li> Inkuber fiskene i bedøvelsesmidler indtil fisken slæber. </li></ol> 4.. Incision og Cerebroventricular Mikroinjektion <ol><li> Tag fisken ud af kassen ved hjælp af en fiskenet og læg det i petriskålen. </li><li> Hold forsigtigt fisken med pincet og orientere hovedet på en måde, at det vipper lidt nedad. Dette vil lette indsnit. </li><li> Generer en lille slids på kraniet ved hjælp af en 30 gauge pigtråd ende nål. Brug kun spidsen af ​​nålen og penetrerer ikke mere endnok ind i hjernen, da dette vil forårsage skader på hjernevævet og vil manifestere sig som blødning. </li><li> Holde holde fisk og spidsen af ​​glasset kapillar gennem snittet webstedet. </li><li> Orientere spidsen af ​​glaskapillar mod telencephalon. Undgå at berøre hjernevævet som dette skaber vævsskade og forhindrer også dispersion af den injicerede opløsning. </li><li> Injicer opløsningen. Væsken spreder umiddelbart efter injektion. </li></ol> 5.. Inddrivelse og Analysere Injection Nøjagtighed <ol><li> Tag fisk fra injektionen setup og anbringes i en plastboks med frisk fisk vand. </li><li> Tillad opsving. </li><li> Re-bedøve fisken med 0,0025% MESAB kortvarigt og tjek fiskene under fluorescens mikroskop. En grundig dispersion af rød fluorescens er en indikation af udbredelse af den injicerede væske. </li><li> Sæt fisken tilbage til plastboks. </li><li> Slut plastboks til than cirkulationssystem at ilte fisk og fastholdes i længere perioder. </li><li> Bruge fisk til ønskede formål, såsom adfærdsmæssige analyser eller ofre dyrene på ønskede tidspunkter efter injektionen for at forberede vævsprøver til yderligere analyser (histologiske farvninger, immunhistokemi, osv.). De følgende referencer giver eksempler på, hvordan man analyserer den voksne zebrafisk hjerne: 9,11,17-20,24-27. Den hurtigste tid til at observere et effektivt knockdown (mere end 50% knockdown) var 12 timer i vores studier 22. </li></ol> 6.. Foreslåede Videnskabelige Controls <ol><li> Brug en mismatch morpholino molekyle, som ikke forventes at forårsage nogen fænotype som en negativ kontrol. Brug enten en standard morpholino molekyle eller specifikt design morpholinogrupper styringer til hvert gen af ​​interesse. Derudover vil opløsningsmidlet (i dette tilfælde PBS) som en yderligere negativ kontrol for at vurdere de ikke-specifikke virkninger eller toksicitet af mismeatch / styre morpholinogrupper injektioner. </li><li> Brug PCNA morpholinos beskrevet tidligere 22 som positive kontroller. Denne morpholino forårsager effektiv knockdown i den voksne zebrafisk hjernen (75-95% knockdown effektivitet inden for 1 dag injektion) 22. </li></ol>

<ol>
	<li>Stocum, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Regenerative Biology and Medicine. , (2006).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nat. Rev. Genet. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Doetsch, F., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+for+brain+repair:+insights+from+adult+neurogenesis+in+birds+and+mammals.">Challenges for brain repair: insights from adult neurogenesis in birds and mammals.</a> Brain Behav. Evol. 58 (5), 306-322 (2001).</li><li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Grandel, H., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+adult+neural+stem+cell+activity+in+vertebrates.">Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates.</a> Dev. Genes Evol. , (2013).</li><li>Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Adult Neurogenesis 2: Stem Cells and Neuronal Development in the Adult Brain. , (2010).</li><li>Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+the+astroglial+lineage+are+neural+stem+cells.">Cells in the astroglial lineage are neural stem cells.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 179-191 (2008).</li><li>Grandel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain:+origin,+proliferation+dynamics,+migration+and+cell.">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell.</a> 295 (1), 263-277 (2006).</li><li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+non-mammalian+vertebrates.">Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates.</a> Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).</li><li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon.">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).</li><li>Byrd, C. A., Brunjes, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish.">Neurogenesis in the olfactory bulb of adult zebrafish.</a> Neuroscience. 105 (4), 793-801 (2001).</li><li>Pellegrini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+aromatase-positive+radial+glial+cells+as+progenitor+cells+in+the+ventricular+layer+of+the+forebrain+in+zebrafish.">Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).</li><li>Lam, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish.">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish.</a> 238 (2), 475-486 (2009).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Wnt-responsive+cells+in+the+zebrafish+hypothalamus.">Identification of Wnt-responsive cells in the zebrafish hypothalamus.</a> Zebrafish. 6 (1), 49-58 (2009).</li><li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+adult+zebrafish+cerebellum:+initiation+and+maintenance+of+a+novel+stem+cell+niche.">Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche.</a> J. Neurosci. 29 (19), 6142-6153 (2009).</li><li>Ganz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+Fgf+dependence+of+adult+neural+progenitors+in+the+zebrafish+telencephalon.">Heterogeneity and Fgf dependence of adult neural progenitors in the zebrafish telencephalon.</a> Glia. 58 (11), 1345-1363 (2010).</li><li>M&#228;rz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58 (7), 870-888 (2010).</li><li>Rothenaigner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+by+distinct+viral+vectors+identifies+bona+fide+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+telencephalon+and+characterizes+their+division+properties+and+fate.">Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate.</a> Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).</li><li>Kroehne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Dev. Biol. 342 (1), 26-38 (2010).</li><li>Kizil, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebroventricular+microinjection+(CVMI)+into+adult+zebrafish+brain+is+an+efficient+misexpression+method+for+forebrain+ventricular+cells.">Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells.</a> PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).</li><li>Morcos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vivo-Morpholinos:+a+non-peptide+transporter+delivers+Morpholinos+into+a+wide+array+of+mouse+tissues.">Vivo-Morpholinos: a non-peptide transporter delivers Morpholinos into a wide array of mouse tissues.</a> Biotechniques. 45 (6), 613-614 (2008).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+receptor+cxcr5+regulates+the+regenerative+neurogenesis+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain.</a> Neural Dev. 7, 27 (2012).</li><li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=her5+expression+reveals+a+pool+of+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+midbrain.">her5 expression reveals a pool of neural stem cells in the adult zebrafish midbrain.</a> Development. 133 (21), 4293-4303 (2006).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+neurogenesis+from+neural+progenitor+cells+requires+injury-induced+expression+of+Gata3.">Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3.</a> Developmental Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).</li><li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).</li><li>Rosen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li><li>Rikin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse+genetic+approach+to+test+functional+redundancy+during+embryogenesis.">A reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis.</a> J. Vis. Exp. (42), e2020 (2010).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Den metode, vi beskriver her giver nem og hurtig administration af morpholinos i den voksne zebrafisk hjerne. Vi har vist, at vores injektion metode effektivt blokerer genekspression i ventrikulære celler og resulterer i funktionelle konsekvenser i neurogenese respons. Der er vigtige punkter at være forsigtig, mens udførelsen af ​​cerebroventricular mikroinjektion. For eksempel afhænger virkningen af ​​morpholino molekyler på den anvendte koncentration. Denne fusion skal bestemmes af slutbrugeren. Vi anbefaler at starte med stamopløsningen (500 uM) og udføre serielle fortyndinger, og ideelt til at pre-test ved injektion i embryoner ved hjælp af standard embryo injektion protokoller 28-30. Tidligere opnåede vi forskellige niveauer af knockdown effektivitet med koncentrationer af morpholinos fra 50 pM til 500 pM 22. For det andet bør åbningen i glaskapillar ikke large da dette vil føre til omfattende væske indstrømning i hjernen efter injektionen. Ligeledes må åbningen ikke være for snæver, da dette vil forhindre tilstrækkelig injektion. Man kan bestemme det optimale dyse-tryk kombination ved at pumpe luft ind i en petriskål med vand. Boblerne opstår bør være i en enkelt række, men ikke i flere rækker. Vi demonstrere dette i videoen. Tredje inkubere fisk i bedøvelsesmidler er kritisk. Fiskene bør ikke opbevares længere end 2 min i bedøvelsesmidler. Dette vil hæmme recovery rate efter injektionen. Fjerde, placeringen af ​​indsnit er kritisk for grundigt at dispergere den indsprøjtede væske. Ventrikulære region i den optiske Tectum er større over midterlinjen og bliver smallere sideværts. Derfor bør forsøgslederen generere slidsen i kraniet tæt på midterlinien og lige caudale til kraniet plade dækker telencephalic region. En af fordelene ved den cerebroventricular injection (CVMI) metode er dens rapidness. CVMI er en hurtig fremgangsmåde til analyse genfunktion. Denne funktion er vigtig og nyttig i forhold til generation af transgene linjer til funktionelle undersøgelser, som generelt tager flere måneder. Derudover CVMI fører til ensartet fordeling af den indsprøjtede væske og giver derfor en relativt grundig manipulation af genaktivitet, sammenlignet med fokale injektioner eller elektroporation. Med CVMI, kan flere gener slået ned samtidigt ved at forberede injektionen blander indeholdende multiple morpholinos oligonukleotid. CVMI kan anvendes til at injicere forskellige koncentrationer af en given morpholino oligonukleotider, og derfor kan bruges til at analysere hypomorphic fænotyper. Endelig er denne indsprøjtning paradigme ikke forårsage toksicitet eller kompromittere overlevelsen af ​​dyrene. Den CVMI teknik kan blive udvidet til andre typer af undersøgelser såsom injektion af modulatoriske peptider, narkotika, plasmid DNA eller modulerende RNA molecules eller andre stoffer, der kan påvirke fysiologien af ​​cellerne. Analyse kombination af molekyler og udføre dosis-respons analyser er muligt ved hjælp af vores metode, så studerer hypomorphic fænotyper. Med disse egenskaber, viser CVMI at være en hurtig og nem assay til ekspressionsundersøgelser i den voksne zebrafisk hjerne, og åbner op hurtig screening og funktionelle analyser. Den voksne zebrafisk hjerne kan konstitutivt producere nye neuroner langs hele rostrocaudal akse og det kan også regenerere efter traumatiske skader. Dette er i skarp kontrast til pattedyr hjerner med begrænset neurogenese og hvis overhovedet, temmelig fattig regenerationsevne. Sådanne udbredt stamceller aktivitet og rekreation evne gør zebrafisk en nyttig model organisme for at forstå de molekylære programmer, der kræves for centralnervesystemet regeneration, som i øjeblikket stort set ukendt. Derfor undersøge den molekylære basis for den regenerative egnethed zebrafish hjerne er en interessant realm af forskning, der kan forklare den grundlæggende forskel, hvor fisk og pattedyr hjerner reagerer efter en skade, og også udstyre muligheder for regenerativ medicinske behandlinger hos mennesker. For at forstå den molekylære infrastruktur hvirveldyr hjernens plasticitet og regenerering, gliaceller tjene som et vigtigt forskningsområde, da de er de neurogene stamfædre 3,8,20. Således bruger CVMI teknik til at ændre gen funktion i de radiale gliaceller i zebrafisk hjerne er medvirkende til at belyse, hvordan fisk hjernen kan par stamfader aktivitet effektiv voksen neurogenese og regenererende respons. Vi har for nylig vist inddragelse og kravet om flere faktorer og signalveje i den regenerative neurogenese reaktion af den voksne zebrafisk hjerne 24,26,27, og disse undersøgelser blev muliggjort ved anvendelse af CVMI metode. Alt i alt kan den viden, vi får fra zebrafisk hjernen udnyttes til at pålægge regenerationsrative evne til pattedyr gliaceller, der reagerer på skader og vil således hjælpe designe kliniske behandlinger for menneskelige neurologiske lidelser og akutte skader.

Voksen neurogenese er et fælles træk for hvirveldyr, men graden af udbredelse og effektivitet varierer med fylogeni 1,2,3,4,5,6. For eksempel indeholder voksne pattedyr hjerner stamceller regioner stort set begrænset til forhjernen 7,8, mens teleost zebrafisk indeholder seksten forskellige stamceller domæner og tilhørende neurogene zoner i hele sin hjerne 4,5,9,10. Denne variation mellem pattedyr og zebrafisk kan afspejle en forskel i de mekanismer i stamceller vedligeholdelse og neurogene kapacitet progenitorcellerne. Den livslange kompetence zebrafisk til at producere neuroner i hjernen kan også udgøre kliniske forgreninger som de molekylære mekanismer ansat af zebrafisk hjerne kunne udnyttes til terapeutiske applikationer til at tackle de neurodegenerative sygdomme hos mennesker. Adskillige stamceller zoner af voksne zebrafisk hjernen er blevet analyseret, og det er blevet vist, atcellerne foring ventrikulære overflade af disse regioner tjener som progenitorceller 9,11-20. Detaljerede analyser i zebrafisk telencephalon, for eksempel, der er konstateret de radiale gliaceller, der afgrænser den ventrikulære overflade af denne hjerne region for at være neurogene progenitorer 19, 20. Dette gælder for andre regioner såsom lillehjernen og den optiske Tectum, hvor ventrikulær placeret neuroepitelceller giver den neurogene input 16,21. Til dette formål kræver forståelse af de molekylære mekanismer, der styrer den udbredte neurogene kompetence hos voksne zebrafisk hjerne manipulation af genekspression i stamceller. Forskellige metoder blev tidligere beskrevet til modulering genfunktion i zebrafisk. Disse omfatter generering af betingede transgene linier, der udtrykker ønskede varianter af et enkelt protein, plasmid-baserede fokale injektioner koblet til elektroporation eller kemiske behandlinger. Vi har tidligere udviklet enmetode til indgivelse forskellige stoffer, herunder morpholino oligonukleotider eller proteiner i den voksne zebrafisk hjerne hjælp cerebroventricular mikroinjektion som en hurtig og effektiv måde modulere genfunktion i ventrikulære celler i den voksne zebrafisk forhjerne 22.. I vores undersøgelser blev vivo morpholinos anvendes på grund af deres kemi involverer morpholino covalent bundet til arginin rige levering peptider, som muliggør effektiv levering til cellerne af interesse uden behov for ekstra permeabilisering såsom elektroporation 23.. Dette ville give en grundig målretning af det ønskede væv efter injektion, ligesom hvad vi observeret hos voksne zebrafisk telencephalon 22.. Anvendelse af vivo morpholinos er derfor bedre end allerede eksisterende metoder til vævsmålretning såsom elektroporation eller fokal injektion af DNA-molekyler. Her viser vi visuelt, hvordan vi udfører denne operation og give entrin-for-trin-protokollen. Vi starter med at forklare fremstillingen af ​​injektionen blandingen og fisk, der skal injiceres, og fortsæt ved at vise, hvordan injektionen Apparatet opstilles. Vi giver en beskrivelse af cerebroventricular injektion metode, som indebærer at generere et snit i kraniet og indsprøjtning af morpholinos hjælp microinjector. Vi har også uddybe de kritiske punkter man skal være forsigtig med under hele proceduren ved at erklære dem som optimering eller fejlfinding guider.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Red CMTPX</td>
 <td>Life Technologies, Invitrogen</td>
 <td>C34552</td>
 <td>Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A5040</td>
 <td>For anesthetizing the fish</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>821,472</td>
 <td>For handling the fish during injection and imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate-buffered saline</td>
 <td>Life Technologies, GIBCO</td>
 <td>10010-056</td>
 <td>As sterile dilution medium</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vivo morpholinos</td>
 <td>Gene Tools Inc.</td>
 <td>Customized</td>
 <td>More info on vivo morpholinos: <a href="http://www.gene-tools.com" target="_blank">www.gene-tools.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbed-end needle</td>
 <td>Becton-Dickinson</td>
 <td>305178</td>
 <td>To generate the incision in the skull</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting microscope</td>
 <td>Olympus, Leica, Zeiss </td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>Part of the whole injection setup</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont Tweezers</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501985</td>
 <td>To snap off the tip of the glass capillary</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescence camera</td>
 <td>Zeiss, Nikon, Leica</td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>To visualize the fluorescence after injection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gillies Dissecting Forceps</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501265</td>
 <td>To hold the fish in position</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass injection capillaries</td>
 <td>World Precision Instruments </td>
 <td>TWF10 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PicoNozzle kit (microinjector holder)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>5430-12</td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pneumatic PicoPump (microinjector)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-PV820 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring illuminator; Ring Light Guide</td>
 <td>Parkland Scientific</td>
 <td>ILL-RLG </td>
 <td>For illuminating the specimen</td>
 </tr>
	</tbody>
 </table>

micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides

Manipulation af genekspression i væv er nødvendig for at udføre funktionelle undersøgelser. I dette papir viser vi cerebroventricular mikroinjektion (CVMI) teknik som et middel til at modulere genekspression i den voksne zebrafisk hjerne. Ved at bruge CVMI kan stofferne administreres i cerebroventricular væske og grundigt fordelt langs rostrocaudal akse af hjernen. Vi især fokusere på brugen af antisense morpholino oligonukleotider, som er potente værktøjer til at vælte genekspression in vivo. I vores fremgangsmåde, når den anvendes, er morpholino molekyler optages af cellerne foring ventrikulære overflade. Disse celler indbefatter de radiale gliaceller, der fungerer som neurogene progenitorer. Derfor bankede ned genekspression i de radiale gliaceller er af allerstørste betydning for at analysere den udbredte neurogenesis respons i zebrafisk, og ville også give indsigt i, hvordan hvirveldyr kunne bære voksne NeurogenESIS respons. En sådan forståelse ville også hjælpe indsatsen for kliniske anvendelser i humane neurodegenerative sygdomme og centralnervesystemet regenerering. Således præsenterer vi cerebroventricular mikroinjektionen metoden som en hurtig og effektiv måde til at ændre genekspression og neurogenesis reaktion i den voksne zebrafisk forebrain. Vi tilbyder også tip til fejlfinding og andre nyttige oplysninger om, hvordan at udføre CVMI procedure.

Cerebroventricular mikroinjektion medfører udbredelse af den injicerede løsning Ved hjælp af workflow og tekniske opbygning af cerebroventricular mikroinjektion afbildet i figur 1, administreret vi morpholinogrupper oligonukleotider i de voksnes zebrafisk hjerne. En nøjagtig injektion protokol medfører en spredning af den injicerede væske i hele hjernen og effektiv målretning af cellerne tæt på den ventrikulære overflade (figur 2A). Injektioner hvor glaskapillar spidder hjernevæv vil have en tæt fluorescerende signal ved punktet for injektion (figur 2B). Hvis det injicerede beløb ikke er nok, vil svagt fluorescerende signal observeret (figur 2C). Cerebroventricular mikroinjektion kan bruges til at vælte genekspression på den ventrikulære region af den voksne zebrafisk hjerne Vi har vist thpå vivo morpholinos kan trænge et par cellediametre inde i ventrikulære overflade og dermed effektivt kan målrette ventrikulære celler (figur 3A, 3B). Morpholino injektion kan knockdown genekspression, da det vil lette produktionen af det tilsvarende protein (et eksempel er PCNA som vist i figur 3C, 3D). Vi har tidligere vist, at vælte gener ved hjælp af denne teknik fører til funktionelle konsekvenser i løbet af voksne neurogenese (figur 3E, 3F), eller regenerering respons (figur 3G, 3H). Vi viste, at den effektive knockdown rækkevidde (mere end 50% knockdown) opnås ca 12 timer efter injektion af morpholinos 22.. Vi har også observeret, at en effektiv knockdown periode indtil cirka 5 dage efter injektion for PCNA protein 22. Mere end 70% knockdown blev set indtil 3 dage efter injektionen 22.. De knockdown kurver er afhængige on niveauet af ekspressionen af ​​de endogene proteiner og effektiviteten af ​​de morpholinogrupper molekylerne, og skal bestemmes for hvert gen af ​​forsøgslederen. I vores undersøgelser har vi ikke se, at CVMI procedure kompromitterer overlevelsen af ​​dyret, sandsynligvis fordi administrationen af ​​de morpholinogrupper molekylerne er lokal og ikke forårsager en systemisk toksicitet. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1.jpg" /> Figur 1. Skematisk repræsentation af cerebroventricular injektionsteknik. (A) indsprøjtning udføres fra dorsale af den voksne zebrafisk (1) på niveau med optisk Tectum (ot, 2). Et snit er lavet over den optiske tectal kraniet plade med en 30-gauge kanyle (3). Brug glaskapillarer er morpholino molekyler injiceres i ventrikulære væske (4). En grundig dispersion er enchieved øjeblikkeligt (5). (B) Kanylen og dens barbed-ende er vist i stor forstørrelse. (C) Orienteringen af nålen før snittet. (D) Incisionen cirkel og skitseret med stiplede linier. (E) Injektionen kapillar ligger som vist og injektion udføres. Alle paneler blev tilpasset fra ref. 22.. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig2.jpg" /> Figur 2. Sammenligning af injektion effektivitet og nøjagtighed. (A) En god injektion fører til målretning af cellerne tæt på ventrikulære overflade. (B) Hvis glaskapillar indsættes i hjernevævet, vil dette generere en centralt placeret fluorescenssignal. (C </sTrong&gt;) Hvis mængden af ​​injektionen er lav, vil dette føre til svagere fluorescens signal. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3.jpg" /> Figur 3. . Morpholino penetration, effektivitet gen knockdowns og funktionelle konsekvenser (A) GFP immunfarvning på telencephalic tværsnit af kontrol morpholino-injicerede Tg (H2A: GFP) transgen linje viser GFP-positive kerner. (B) GFP immunfarvning på telencephalic tværsnit af GFP antisense morpholino-injiceret Tg (H2A: GFP) transgen linje viser GFP-positive kerner. Bemærk forskellen i GFP-signalet ved den ventrikulære region. v: ventrikel. (C) PCNA immunfarvning for kontrol morpholino-injicerede hjerner viser udbredelse af PCNA-positive celler. ( <strong&gt; D) PCNA immunfarvning på PCNA antisense morpholino-injicerede hjerner viser signifikant reducerede mængder af PCNA-positive celler, der viser, at CVMI can Knockdown endogene gener. (E) BrdU og HUC / D immunfarvning på kontrol morpholino-injicerede hjerner at bestemme nyfødte neuroner efter en BrdU pulssporingsforsøg beskrevet før 22.. (F) BrdU og HUC / D immunfarvning på PCNA antisense morpholino-injicerede hjerner at bestemme nyfødte neuroner efter en BrdU pulssporingsforsøg beskrevet før 22.. (G) Banker-down PCNA fører til betydelig reduktion i generering af nyfødte neuroner, hvilket indikerer, at CVMI kan bruges til at Knockdown endogene gener, som giver anledning til funktionelle konsekvenser. Alle paneler blev tilpasset fra ref. 22. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides at JoVE.com

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

I denne artikel, viser vi en fremgangsmåde til manipulation af genekspression i ventrikulære celler i den voksne zebrafisk telencephalon hjælp antisense morpholino oligonukleotider. Vi præsenterer denne metode som en effektiv og hurtig protokol, der kan anvendes til funktionelle undersøgelser i den voksne hvirveldyr hjernen.

Mikromanipuleringer af genekspression i Adult zebrafisk Brain Brug Cerebroventricular mikroinjektion af Morpholino oligonukleotider

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Høj opløsning Live-Imaging af celle adfærd i udviklingslandene neuroepitel

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Optimeret Analyse af DNA methylering og genekspression fra små, anatomisk definerede områder af hjernen

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Stereotaktisk kirurgi for excitotoksiske læsion af specifikke områder i hjernen i den voksne rotte

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektrofysiologiske optagelse i hjernen af ​​intakte Voksen Zebrafisk

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Analyse af genekspression Ændringer i rottehippocampus Efter Deep Brain Stimulation af den forreste thalamiske Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modellering Amyloid-β42 toksicitet og Neurodegeneration i voksen zebrafisk hjerne

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Overvågning af døgnrytmen ur genekspression i mus Suprachiasmatic kernen bruger fluorescens journalister

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Brug af Near-Infrared fluorescens og høj opløsning scanning til at måle protein Expression i gnaver hjernen

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...