Name: micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides
Uploaded: 2013-05-23T17:00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (SFB 655) והאיחוד האירופי (ZF-בריאות).

1. הכנת תערובת הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש morpholinos vivo כתאים להפנים אותם ביעילות רבה יותר מאשר מולקולות morpholino נורמליות. ראה מידע של היצרן לפרטים (טבלת 1: ריאגנטים וחומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בצבע ניאון מעקב (למשל CellTracker האדום CMTPX, Invitrogen) כדי להמחיש את רמת הדיוק של הזריקה. צבע זה חילוף חומרים בתא והופך ניאון רק בתא לאחר הספיגה. לכן, שלב זה הוא קריטי כדי לקבוע את התאים הממוקדות ביעילות על ידי microinjection cerebroventricular. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פוספט שנאגרו מלוח (PBS) (137 מ&quot;מ NaCl, 2.7 מ&quot;מ KCl, 10mm Na 2 HPO 4, מ&quot;מ KH 2 PO 4 2, pH: 7.4) לדילול פתרון morpholino. אם יש צורך בדילול של פתרון morpholino, תמיד להשתמש PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 μl של תמהיל ההזרקה על ידי הוספת 9 μl של פתרון morpholino וμl 1 של הדואר תא גשש צבע (בדילול או חי ריכוז המניות של פתרון morpholino הוא 500 מיקרומטר התוצאות הקודמות שלנו מצביעות על כך שכמה 22 מנות של morpholino שונים -.. הנעות בין 50 מיקרומטר עד 500 מיקרומטר - תוצאה ברמות שונות של מציאה מיעילה מציאה לפנוטיפים hypomorphic). μl 1 של פתרון הוא מספיק להזרקה לתוך המוח של דג הזברה אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב ולאחסן בטמפרטורת חדר עד להזרקה. </li></ol> 2. הכנת מנגנון הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כוס הזרקת נימים באמצעות חולץ מחט. השתמש בפרמטרים הבאים: ערך מחזור חימום: 463, מושך ערך מחזור: 230, המהירות: 1.5 שניות, הזמן: 75 msec. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור הלחץ ולהתאים את ההגדרות ללחץ 50 psi או 3.5 ברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הגדרות microinjector כדלקמן: מחזיק 20 psi לחץ, להוציא לחץ 10 PSI, ערך תקופה של 2.5 ו 100 אלפיות טווח של gating. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפנותנורת ה-הטבעת ולאתר את הטבעת על הבמה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את בעל הנימים לעמדה מתאימה בסמוך למיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את נימי הזכוכית לתוך המחזיק. התאם את זווית הזריקה ל -45 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את הקצה של נימי הזכוכית באמצעות מלקחי קנס-end ולכייל את תפוקת לחץ מהפתח. זה חייב להיבדק על ידי טבילת קצה המחט לתוך המים והדגים נותנים דופק לחץ מתמשך. בועות האוויר הנובעות צריכה להיות רק שורה אחת, שהיא אינדיקציה ללחץ אופטימלי / גודל פתח. אנא ראה את הווידאו להפגנה של הכיול הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את נימי זכוכית עם פתרון ההזרקה ללא לכידת בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל לחץ כדי להסיר את האוויר בין הקצה של פתרון ההזרקה הטעון נימי הזכוכית ו. </li></ol> 3. הרדמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון המניות של ההרדמה (0.1% MESAB - אתילמ-aminobenzoate methanesulphonate). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המספר רצוי של דגים מהטנקים שלהם לתוך כלובי פלסטיק עכבר או המכל הובלה אחר עם כמות מספקת של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון עבור ההרדמה בקופסא פלסטיק קטנה על ידי ערבוב 200 מיליליטר מים דגים עם 5 מ&quot;ל של פתרון מניות הרדמה. ריכוז סופי של הרדמה: 0.0025% (V / V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חצי למלא צלחת פטרי פלסטיק עם הרדמה. השתמש במנה הזו לזריקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הדגים בהרדמה עד לsubdues הדגים. </li></ol> 4. חתך וMicroinjection Cerebroventricular <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הדגים מהתיבה באמצעות נטו דגים ולמקם אותו בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להחזיק את הדג עם המלקחיים ולכוון את הראש באופן שבו נוטה מעט כלפי מטה. זה יקל את החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור חריץ קטן בגולגולת באמצעות מחט דוקרנית קצה 30 מד. השתמש רק בקצה המחט ולא לחדור יותר ממספיק לתוך המוח כמו זה יגרום לניזק לרקמת המוח, ויביא לידי ביטוי כדימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך להחזיק את הדגים והכניסו את הקצה של נימי הזכוכית דרך אתר החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוריינט קצה נימי הזכוכית לכיוון telencephalon. הימנע מלגעת ברקמת המוח כמו זה יוצר נזק לרקמות וגם מונע פיזור של התמיסה המוזרקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את הפתרון. הנוזל מפזר מייד לאחר הזרקה. </li></ol> 5. שחזור וניתוח של דיוק הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הדגים מהתקנת ההזרקה והמקום לתוך קופסא פלסטיק עם מים דגים טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר התאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-לטשטש את הדגים עם 0.0025% MESAB בקצרה ולבדוק את הדגים מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי. פיזור יסודי של אדום הקרינה הוא אינדיקציה להפצה נרחבת של הנוזל המוזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את הדגים לקופסא הפלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את קופסא הפלסטיק לtמערכת זרימתו לחמצן את הדגים ולשמור לתקופות זמן ארוכות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדגים למטרות רצויות כגון ניתוחים התנהגותיים או להקריב בעלי החיים בנקודתי זמן רצויים לאחר ההזרקה להכין דגימות רקמה לניתוח נוסף (stainings היסטולוגית, אימונוהיסטוכימיה, וכו &#39;). בהערות הבאות לתת דוגמאות כיצד לנתח את מוח דג הזברה המבוגר: 9,11,17-20,24-27. הזמן המהיר ביותר להתבונן מציאה יעילה (יותר מ -50% מציאה) היה 12 שעות במחקרים שלנו 22. </li></ol> 6. בקרה מדעית שהציע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מולקולת morpholino אי התאמה שאינה אמורה לגרום לכל פנוטיפ כביקורת שלילית. השתמש באחת מולקולת morpholino סטנדרטית או דווקא בקרות morpholino עיצוב לכל גן של עניין. בנוסף לכך, להשתמש בחומר ממס (במקרה זה PBS) כביקורת שלילית נוספת כדי להעריך את ההשפעות רעילות או שאינן ספציפיות של mismatch / לשלוט זריקות morpholino. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש PCNA morpholinos תואר קודם לכן 22 כפקדים חיוביים. זה גורם morpholino מציאה יעילה במוח דג הזברה המבוגר (75-95% יעילות מציאה בתוך יום 1 של הזרקה) 22. </li></ol>

<ol>
	<li>Stocum, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Regenerative Biology and Medicine. , (2006).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nat. Rev. Genet. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Doetsch, F., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+for+brain+repair:+insights+from+adult+neurogenesis+in+birds+and+mammals.">Challenges for brain repair: insights from adult neurogenesis in birds and mammals.</a> Brain Behav. Evol. 58 (5), 306-322 (2001).</li><li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Grandel, H., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+adult+neural+stem+cell+activity+in+vertebrates.">Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates.</a> Dev. Genes Evol. , (2013).</li><li>Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Adult Neurogenesis 2: Stem Cells and Neuronal Development in the Adult Brain. , (2010).</li><li>Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+the+astroglial+lineage+are+neural+stem+cells.">Cells in the astroglial lineage are neural stem cells.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 179-191 (2008).</li><li>Grandel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain:+origin,+proliferation+dynamics,+migration+and+cell.">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell.</a> 295 (1), 263-277 (2006).</li><li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+non-mammalian+vertebrates.">Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates.</a> Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).</li><li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon.">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).</li><li>Byrd, C. A., Brunjes, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish.">Neurogenesis in the olfactory bulb of adult zebrafish.</a> Neuroscience. 105 (4), 793-801 (2001).</li><li>Pellegrini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+aromatase-positive+radial+glial+cells+as+progenitor+cells+in+the+ventricular+layer+of+the+forebrain+in+zebrafish.">Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).</li><li>Lam, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish.">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish.</a> 238 (2), 475-486 (2009).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Wnt-responsive+cells+in+the+zebrafish+hypothalamus.">Identification of Wnt-responsive cells in the zebrafish hypothalamus.</a> Zebrafish. 6 (1), 49-58 (2009).</li><li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+adult+zebrafish+cerebellum:+initiation+and+maintenance+of+a+novel+stem+cell+niche.">Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche.</a> J. Neurosci. 29 (19), 6142-6153 (2009).</li><li>Ganz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+Fgf+dependence+of+adult+neural+progenitors+in+the+zebrafish+telencephalon.">Heterogeneity and Fgf dependence of adult neural progenitors in the zebrafish telencephalon.</a> Glia. 58 (11), 1345-1363 (2010).</li><li>M&#228;rz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58 (7), 870-888 (2010).</li><li>Rothenaigner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+by+distinct+viral+vectors+identifies+bona+fide+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+telencephalon+and+characterizes+their+division+properties+and+fate.">Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate.</a> Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).</li><li>Kroehne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Dev. Biol. 342 (1), 26-38 (2010).</li><li>Kizil, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebroventricular+microinjection+(CVMI)+into+adult+zebrafish+brain+is+an+efficient+misexpression+method+for+forebrain+ventricular+cells.">Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells.</a> PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).</li><li>Morcos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vivo-Morpholinos:+a+non-peptide+transporter+delivers+Morpholinos+into+a+wide+array+of+mouse+tissues.">Vivo-Morpholinos: a non-peptide transporter delivers Morpholinos into a wide array of mouse tissues.</a> Biotechniques. 45 (6), 613-614 (2008).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+receptor+cxcr5+regulates+the+regenerative+neurogenesis+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain.</a> Neural Dev. 7, 27 (2012).</li><li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=her5+expression+reveals+a+pool+of+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+midbrain.">her5 expression reveals a pool of neural stem cells in the adult zebrafish midbrain.</a> Development. 133 (21), 4293-4303 (2006).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+neurogenesis+from+neural+progenitor+cells+requires+injury-induced+expression+of+Gata3.">Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3.</a> Developmental Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).</li><li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).</li><li>Rosen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li><li>Rikin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse+genetic+approach+to+test+functional+redundancy+during+embryogenesis.">A reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis.</a> J. Vis. Exp. (42), e2020 (2010).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

השיטה שאנו מתארים כאן מאפשרת ניהול קל ומהיר של morpholinos לתוך מוח דג הזברה המבוגר. אנחנו הוכחנו כי שיטת ההזרקה שלנו ביעילות חוסמת את ביטוי הגנים בתאי חדריות והתוצאות בהשלכות תפקודיות בתגובת neurogenesis. ישנן נקודות חשובות להיות זהיר לגבי אילו ביצוע microinjection cerebroventricular. לדוגמה, ההשפעה של מולקולות morpholino תלויה בריכוז בשימוש. יש ריכוז זה שייקבע על ידי משתמש הקצה. אנו ממליצים להתחיל עם פתרון המניות (500 מיקרומטר) וביצוע דילולים סידוריים, ואידיאליים למבחן מראש על ידי הזרקה לעוברי תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטי 28-30 הזרקת עובר. קודם לכן, השגנו רמות של יעילות מציאה שונות עם ריכוזים של morpholinos הנע בין 50 מיקרומטר עד 500 מיקרומטר 22. שנית, פתח של נימי הזכוכית לא צריך להיות largדואר כמו זה יוביל לגל נרחב נוזל לתוך המוח לאחר ההזרקה. כמו כן, הפתיחה לא חייבת להיות צרה מדי כמו זה ימנע הזרקה הולמת. אפשר לקבוע את שילוב האופטימלי פתח בלחץ אוויר על ידי שאיבה לתוך צלחת פטרי עם מים. הבועות הנובעות צריכה להיות בשורה אחת, אך לא במספר שורות. אנו מדגימים את זה בוידאו. שלישית, דוגרים הדגים בהרדמה הוא קריטי. הדגים לא צריכים להיות כל הזמן יותר מ -2 דקות בהרדמה. הדבר שיפגע בקצב ההתאוששות לאחר ההזרקה. רביעית, את מיקומו של החתך הוא קריטי עבור יסודיות פיזור הנוזל המוזרק. אזור חדרית מעל tectum האופטי הוא גדול יותר מעל קו האמצע ומקבל צרים רוחבי. לכן, הנסיין צריך ליצור סדק בגולגולת הקרובה לקו האמצע ורק הזנב לצלחת הגולגולת המכסה את אזור telencephalic. אחד היתרונות של injectio cerebroventricularשיטת N (CVMI) היא rapidness שלה. CVMI היא שיטה מהירה לassaying תפקוד גן. תכונה זו חשובה ושימושית בהשוואה לדור של קווים מהונדסים ללימודים פונקציונליים, אשר בדרך כלל לוקחים כמה חודשים. בנוסף, CVMI מוביל להתפלגות אחידה של הנוזל המוזרק ולכן מספק מניפולציה מעמיקה יחסית של פעילות גן, בהשוואה לזריקות מוקד או electroporation. עם CVMI, ניתן הפילו גנים מרובים בו זמנית על ידי הכנת תערובות המכילה הזרקת oligonucleotide morpholinos מרובה. CVMI יכול לשמש גם כדי להזרים ריכוזים של oligonucleotides morpholino ניתנו שונים, ולכן ניתן להשתמש בו לניתוח פנוטיפים hypomorphic. לבסוף, הפרדיגמה הזרקה זו אינה גורמת לרעילות או לסכן את הישרדותם של בעלי החיים. טכניקת CVMI עשויה להיות מורחבת לסוג אחר של מחקרים כגון הזרקת פפטידים modulatory, סמים, פלסמיד דנ&quot;א או רנ&quot;א modulatory מוlecules או חומרים אחרים שעשויים להשפיע על הפיסיולוגיה של התאים. Assaying שילוב של מולקולות וביצוע ניתוחי מינון תגובה אפשרית משתמשים בשיטה שלנו, המאפשרת לימוד פנוטיפים hypomorphic. עם מאפיינים אלה, CVMI מוכיח להיות assay מהיר וקל לביטוי במחקרים במוח דג הזברה המבוגר, ופותח סינון מהיר וניתוחים תפקודיים. מוח דג הזברה המבוגר constitutively יכול לייצר נוירונים חדשים לאורך ציר rostrocaudal השלם וזה גם יכול להתחדש לאחר פציעות טראומטיות. זאת בניגוד גמור למוחם של יונקים עם neurogenesis המוגבל, ואם בכלל, יכולת התחדשות ולא עניה. פעילות מסוג זה נפוץ בתאי גזע ויכולת החלמה הופכים דג הזברה אורגניזם מודל שימושי להבנת התוכניות המולקולריות הנדרשות להתחדשות מערכת עצבים מרכזית, אשר נמצאות כיום במידה רבה, לא ידועים. לכן, חוקר את הבסיס המולקולרי של כשרון ההתחדשות של zeמוח brafish הוא תחום מעניין של מחקר שעשוי להסביר את ההבדל המהותי איך המוח של דגים ויונקים מגיב אחרי פציעה, וגם להעניק אפיקים לטיפולים רפואיים משובי בבני אדם. על מנת להבין את התשתית המולקולרית של גמישות מוחית חוליות והתחדשות, תאי גלייה לשמש כתחום מחקר חשוב כפי שהם אבות neurogenic 3,8,20. לפיכך, שימוש בטכניקת CVMI כדי לשנות את תפקוד הגנים בתאי גלייה רדיאלי של מוח דג הזברה הוא סייעה בהבהרה איך המוח של דגים יכולה בני זוג לפעילות אב neurogenesis למבוגרים יעיל ותגובת רגנרטיבית. יש לנו לאחרונה הראינו מעורבות והדרישה של מספר גורמים ומסלולי איתות בתגובת neurogenesis משובי של מוח דג הזברה המבוגר 24,26,27, ומחקרים אלה מתאפשרים על ידי השימוש בשיטת CVMI. בסך הכל, אנו רוכשים ידע ממוח דג הזברה יכול להיות רתום להטיל regeneיכולת rative לתאי גלייה היונקים המגיבים לפציעות ולכן לעזור בעיצוב טיפולים קליניים להפרעות נוירולוגיות אדם ופציעות חריפות.

neurogenesis למבוגרים הוא תכונה המשותפת לבעלי חוליות, עם זאת מידת השכיחות והיעילות שלו משתנה עם תולדות הגזע 1,2,3,4,5,6. לדוגמה, המוח של יונקים בוגרים מכילים תאי גזע במידה רבה אזורים המוגבלים למוח הקדמי 7,8, בעוד דג הזברה החוליות מכילה שש עשרה תחומים שונים בתאי גזע ואזורים במוח הקשורים neurogenic כל 4,5,9,10. זו וריאציה בין יונקים ודג זברה עשויה לשקף פער במנגנונים של תחזוקת תאי גזע והיכולת העצבית של תאי האב. היכולת לכל החיים של דג הזברה כדי לייצר תאי עצב במוח גם יכולה להוות השלכות קליניות כפי שניתן היו לרתום את המנגנונים המולקולריים המועסקים על ידי מוח דג הזברה ליישומים טיפוליים להתמודדות עם הפרעות ניווניות בבני אדם. אזורי תאי גזע של המוח כמה דג הזברה המבוגר כבר ניתחו וזה כבר הראה כיתאים המצפים את פני השטח של חדרית אזורים אלה משמשים כתאים 9,11-20. ניתוחים מפורטים בtelencephalon דג הזברה, למשל, זיהו את תאי גלייה רדיאלי, המשרטטים את פני השטח חדרית של האזור הזה במוח להיות אבות neurogenic 19, 20. זה נכון גם לגבי אזורים אחרים כגון המוח הקטן וtectum האופטי, שבו ממוקם תאי ventricularly-neuroepithelial לספק את הקלט העצבי 16,21. לשם כך, הבנת המנגנונים המולקולריים השולטים במיומנות העצבית הנרחבת במוח של דג הזברה מבוגר דורשת מניפולציה של ביטוי גנים בתאי האב. שיטות שונות שתוארו קודם לכן לויסות תפקוד גן בדג הזברה. אלה כוללים דור של קווים מהונדסים מותנים מבטאים גרסאות רצויות של חלבון זריקות מוקד יחיד, המבוססים על פלסמיד מצמידים את טיפולי electroporation או כימיים. עיצבנו בעברשיטה לניהול חומרים שונים, כולל oligonucleotides morpholino או חלבונים לתוך מוח דג הזברה המבוגר באמצעות microinjection cerebroventricular כדרך מהירה ויעילה של ויסות תפקוד גן בתאי חדריות של דג הזברה המבוגר המוח הקדמי 22. במחקרים שלנו, morpholinos vivo שמשו בגלל הכימיה שלהם מעורבת מולקולת morpholino קשורה קוולנטית לארגינין פפטידים משלוח עשיר, המאפשרים אספקה ​​יעילה לתאים של עניין ללא צורך בpermeabilization הנוסף כגון electroporation 23. היכולת זו תאפשר מיקוד יסודי של הרקמה הרצויה לאחר הזרקה, בדיוק כמו מה שאנו נצפו במבוגרי דג הזברה telencephalon 22. שימוש בmorpholinos vivo לכן הם עדיפים על שיטות קיימות כבר מיקוד של רקמה כגון electroporation או הזרקת מוקד של מולקולות DNA. הנה, אנחנו מדגימים איך אנחנו חזותי לבצע פעולה זו ולספקפרוטוקול צעד אחר צעד. אנחנו מתחילים עם הסבר הכנת תערובת ההזרקה והדגים להיות מוזרק, ולהמשיך על ידי המדגים כיצד מנגנון ההזרקה מוגדר. אנו מספקים תיאור של שיטת הזרקת cerebroventricular, הכולל יצירת חתך בגולגולת וההזרקה של morpholinos באמצעות microinjector. אנחנו גם להרחיב את הדיבור על הנקודות הקריטיות אחד צריך להיות זהיר בעת ההליך כולו באומרו להם כמו אופטימיזציה, או מדריכים לפתרון בעיות.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Red CMTPX</td>
 <td>Life Technologies, Invitrogen</td>
 <td>C34552</td>
 <td>Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A5040</td>
 <td>For anesthetizing the fish</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>821,472</td>
 <td>For handling the fish during injection and imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate-buffered saline</td>
 <td>Life Technologies, GIBCO</td>
 <td>10010-056</td>
 <td>As sterile dilution medium</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vivo morpholinos</td>
 <td>Gene Tools Inc.</td>
 <td>Customized</td>
 <td>More info on vivo morpholinos: <a href="http://www.gene-tools.com" target="_blank">www.gene-tools.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbed-end needle</td>
 <td>Becton-Dickinson</td>
 <td>305178</td>
 <td>To generate the incision in the skull</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting microscope</td>
 <td>Olympus, Leica, Zeiss </td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>Part of the whole injection setup</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont Tweezers</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501985</td>
 <td>To snap off the tip of the glass capillary</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescence camera</td>
 <td>Zeiss, Nikon, Leica</td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>To visualize the fluorescence after injection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gillies Dissecting Forceps</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501265</td>
 <td>To hold the fish in position</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass injection capillaries</td>
 <td>World Precision Instruments </td>
 <td>TWF10 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PicoNozzle kit (microinjector holder)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>5430-12</td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pneumatic PicoPump (microinjector)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-PV820 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring illuminator; Ring Light Guide</td>
 <td>Parkland Scientific</td>
 <td>ILL-RLG </td>
 <td>For illuminating the specimen</td>
 </tr>
	</tbody>
 </table>

micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides

מניפולציה של ביטוי גנים ברקמות נדרש לבצע מחקרים תפקודיים. במאמר זה, אנו מדגימים את טכניקת microinjection (CVMI) cerebroventricular כאמצעי לווסת ביטוי גנים במוח דג הזברה המבוגר. באמצעות CVMI, יכולים להינתן חומרים לתוך נוזל cerebroventricular ולהיות מופצים באופן יסודי לאורך ציר rostrocaudal של המוח. אנו מתמקדים בעיקר על השימוש בoligonucleotides morpholino antisense, שהם כלים חזקים לדריסת ביטוי גנים בגוף חי. בשיטה שלנו, כאשר מיושם, מולקולות morpholino נתפסות על ידי התאים המצפים את פני השטח של החדר. תאים אלה כוללים תאי גלייה רדיאלי, אשר פועלים כאבות neurogenic. לכן, מפיל את ביטוי הגנים בתאי גלייה רדיאלי הוא בעל חשיבות עליונה כדי לנתח את תגובת neurogenesis הנפוצה בדג הזברה, וגם יספק תובנות לגבי אופן שחוליות יכולים לקיים אב עצבים מבוגריםתגובת esis. הבנה כזו תהיה גם לסייע במאמצים ליישומים קליניים בהפרעות ניווניות אדם והתחדשות מערכת עצבים מרכזית. לפיכך, אנו מציגים את שיטת microinjection cerebroventricular כדרך מהירה ויעילה כדי לשנות ביטוי גנים ותגובת neurogenesis במוח הקדמי דג הזברה המבוגר. כמו כן אנו מספקים עצות לפתרון בעיות ומידע שימושי נוסף על איך לבצע את הליך CVMI.

microinjection Cerebroventricular מוביל להפצה נרחבת של הפתרון המוזרק באמצעות תכנית העבודה וטכנית של microinjection cerebroventricular המתואר באיור 1, אנו מנוהלים oligonucleotides morpholino לתוך מוח דג הזברה המבוגר. פרוטוקול הזרקה מדויק מוביל לפיזור הנוזל מוזרק בכל המוח והיעיל מיקוד של התאים הקרובים לפני שטח חדרית (איור 2 א). זריקות שבו נימי זכוכית impales רקמת המוח תהיה אות ניאון צפופה בנקודת ההזרקה (איור 2). אם הכמות המוזרקת זה לא מספיק, אות ניאון חלשה יקויימו (איור 2 ג). microinjection Cerebroventricular יכול לשמש לדריסת ביטוי גנים באזור חדרית של מוח דג הזברה המבוגר הראנו הבmorpholinos vivo יכול לחדור כמה קטרים ​​סלולריים בתוך פני החדר, ולכן יעילות יכול למקד את תאי חדרית (3A מספרים, 3 ב). הזרקת morpholino יכולה ביטוי מציאה גן כפי שהוא יהיה להקל את ייצורו של החלבון המתאים (דוגמה לכך היא PCNA כפי שמוצג באיורים 3C, 3D). אנחנו הוכחנו בעבר כי להרוס את הגנים באמצעות טכניקה זו מובילה לתוצאות תפקודיות במהלך neurogenesis למבוגרים (איורים 3E, 3F) או תגובת התחדשות (3G דמויות, 3H). אנחנו הראינו כי מגוון מציאה היעילה (יותר מ -50% מציאה) מושגת כ -12 שעות לאחר הזרקה של morpholinos 22. אנחנו גם ציינו כי תקופת מציאה יעילה היא עד כ 5 ימים לאחר ההזרקה לחלבון PCNA 22. % מציאה יותר מ -70 הייתה לראות עד 3 ימים לאחר הזרקת 22. עקומות מציאה הן O התלויn את רמת הביטוי של החלבונים אנדוגניים והיעיל של מולקולות morpholino; ויש שייקבע לכל גן על ידי הנסיין. במחקרים שלנו, אנחנו לא רואים שהליך CVMI פוגע בהישרדותו של בעל החיים, כנראה בגלל שהממשל של מולקולות morpholino הוא מקומי ואינו גורם לרעילות מערכתית. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1.jpg" /> איור 1. ייצוג סכמטי של טכניקת הזרקת cerebroventricular. () ההזרקה מבוצעת מהגב של דג הזברה המבוגר (1) ברמה של tectum האופטי (OT, 2). מבצעים חתך מעל צלחת גולגולת tectal אופטית עם מחט 30 מד (3). שימוש בזכוכית נימים, מולקולות morpholino מוזרקות לתוך נוזל חדרית (4). פיזור יסודי הואchieved באופן מיידי (5). (ב) הסר את הבלוטות ודוקרניות-end שלה מוצג בהגדלה גבוהה. (ג) הנטייה של המחט לפני החתך. (ד &#39;) החתך הקיפה ומתוארת על ידי קווים מקווקווים. (ה) הזרקת נימי ממוקמת כמוצג והזרקה מבוצעת. כל הלוחות הותאמו מנ&quot;צ. 22. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig1large.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig2.jpg" /> איור 2. השוואה של יעילות הזרקה ודיוק. () זריקה טובה מובילה לפגיעה בתאים הקרובים אל פני השטח של החדר. (ב) אם נימי הזכוכית מוכנסת לתוך רקמת המוח, זה יפיק אות הקרינה במיקום מרכזי. (ג </sטרונג&gt;) אם כמות ההזרקה היא נמוכה, זה יוביל לאות הקרינה חלשה יותר. <img alt="איור 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3.jpg" /> איור 3. . חדירת morpholino, יעילות של knockdowns גנים והשלכות תפקודיות () GFP immunostaining על חתכי telencephalic שליטה morpholino-מוזרק Tg (H2A: GFP) קו מהונדס מראה גרעיני GFP חיוביים. (ב) GFP immunostaining על חתכי telencephalic של ה-GFP antisense morpholino-הזריק Tg (H2A: GFP) קו מראה גרעיני GFP חיוביים מהונדס. שים לב להיבדל באות ה-GFP, באזור החדרים. V: חדר. (ג) PCNA immunostaining על שליטת morpholino-מוזרק מוח מראה הפצה נרחבת של תאי PCNA-חיוביים. ( <strong&gt; ד) PCNA immunostaining במוחה morpholino הזרקת antisense PCNA מראה באופן משמעותי כמויות מופחתות של תאי PCNA חיוביים, מראה כי CVMI יכולים גני אנדוגניים מציאה. (ה) וBrdU HUC / D immunostaining על שליטת morpholino-הזריק מוח כדי לקבוע נוירונים יילוד לאחר ניסוי דופק מרדף BrdU תאר לפני 22. (F) BrdU וHUC / D immunostaining במוחה morpholino-מוזרק PCNA antisense לקבוע נוירונים יילוד לאחר ניסוי דופק מרדף BrdU תאר לפני 22. (ז) דופק למטה PCNA מוביל לירידה משמעותית בדור של נוירונים יילוד, המציין כי CVMI יכול לשמש למציאת גני אנדוגניים, שהביא לתוצאות תפקודיות. כל הלוחות הותאמו מנ&quot;צ. 22 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig3large.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides at JoVE.com

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

במאמר זה, אנו מדגימים שיטה למניפולציה של ביטוי גנים בתאי חדריות של telencephalon דג הזברה המבוגר באמצעות oligonucleotides morpholino antisense. אנו מציגים שיטה זו כפרוטוקול יעיל ומהיר שיכול לשמש למחקרים תפקודיים במוח החולייתנים המבוגר.

מיקרומניפולציה של ביטוי גנים במוח דג הזברה למבוגר באמצעות Microinjection Cerebroventricular של oligonucleotides morpholino

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

חוט השדרה Electrophysiology II: ייצור תאי אלקטרודה יניקה

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

ניתוח אופטימיזציה של מתילציה דנ&quot;א ביטוי גנים מ, אזורים קטנים אנטומית מוגדרים של המוח

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

ניתוח Stereotaxic על הנגע Excitotoxic של אזורי מוח ספציפיים עכברוש למבוגרים בלבד

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

הקלטת אלקטרו במוח של דג הזברה למבוגר שלמה

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

ניתוח שינויי ביטוי הגנים בהיפוקמפוס העכברוש לאחר Deep Brain Stimulation של Anterior התלמוס הגרעין

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

ביטוי גנים מסוג התא ספציפי באמצעות סלולארי קרינה המופעל מיון לבדיקת רקמות במוח החולדה

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

מידול עמילואיד-β42 רעילות, הקשורים ניוון מוחיים במוח דג זברה למבוגרים

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

אין ויוו פיקוח על ביטוי גנים שעון היממה בתצלובתי העכבר באמצעות קרינה פלואורסצנטית כתבים

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

שימוש בקרוב-אינפרא אדום פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה סריקה למדוד חלבון הביטוי במוח מכרסם

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...