Name: micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides
Uploaded: 2013-05-23T17:00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 655) och Europeiska unionen (Zf-hälsa).

Ett. Beredning av insprutningsblandningen <ol><li> Använd vivo morpholinos som celler internalisera dem mer effektivt än vanliga morfolinogrupper molekyler. Se tillverkarens information för detaljer (Tabell 1: Reagens och material). </li><li> Använd en fluorescerande spårning färgämne (t.ex. CellTracker Red CMTPX, Invitrogen) för att visualisera noggrannheten av injektionen. Detta färgämne metaboliseras i cellen och blir fluorescerande endast i cellen efter upptag. Därför är detta steg viktigt att fastställa de celler som effektivt riktar av cerebroventricular mikroinjektion. </li><li> Förbered fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH: 7,4) för spädning morfolino lösning. Om en utspädning av morpholino lösning krävs, alltid använda PBS. </li><li> Förbered 10 il av injektionen genom att tillsätta 9 il av morpholino lösningen och ett pl av the cell tracker färgämne (utspädd eller outspädd Beståndet koncentration av morpholino lösningen är 500 iM Våra tidigare resultat 22 indikerar att flera olika doser av morfolino -.. som sträcker sig från 50 pm till 500 pm - resulterar i olika nivåer av knockdown från en effektiv knockdown till hypomorphic fenotyper). 1 pl lösning är tillräckligt för injektion i en zebrafisk hjärnan. </li><li> Blanda väl och förvara vid rumstemperatur tills injektionen. </li></ol> 2. Framställning av injektionsanordningen <ol><li> Förbered glaset injektion kapillärerna hjälp av en nål avdragare. Använd följande parametrar: Uppvärmning cykel värde: 463, drar cykel Värde: 230, hastighet: 1,5 sek, tid: 75 ms. </li><li> Slå på trycket källan och justera tryckinställningarna till 50 psi eller 3,5 bar. </li><li> Justera microinjector inställningarna enligt följande: Håll trycket 20 psi, eject tryck 10 psi, period värde av 2,5 och 100 ms utbud av slussning. </li><li> Svängpå ringen belysningen och placera ringen över mikroskop scenen. </li><li> Placera kapillära innehavaren till en lämplig position bredvid mikroskopet. </li><li> Sätt i glaskapillär i hållaren. Justera insprutningsvinkel till 45 grader. </li><li> Snap off spetsen på glaskapillär med hjälp av en fin-end pincett och kalibrera trycket som matas ut från öppningen. Detta måste testas genom att sänka ner spetsen på nålen i fisken vattnet och ger ett kontinuerligt tryck puls. De luftbubblor uppstår bör vara en enda rad, vilket är en indikation på optimalt tryck / hålstorlek. Se video för demonstration av denna kalibrering. </li><li> Ladda glaskapillär med injektionslösningen utan droppa luftbubblor. </li><li> Applicera tryck för att avlägsna luft mellan spetsen av glaskapillären och den laddade injektionslösningen. </li></ol> Tre. Anestesi <ol><li> Förbered stamlösning av anestetika (0,1% MESAB - etyl-m-aminobensoat metansulfonat). </li><li> Ta önskat antal fisk från sina tankar i plast mus burar eller annan transport behållare med tillräcklig mängd vatten. </li><li> Förbered för narkos lösning i en liten plastlåda genom att blanda 200 ml av fisk vatten med 5 ml anestetika stamlösning. Slutlig koncentration av anestetika: 0,0025% (volym / volym). </li><li> Half-fylla en plast petriskål med bedövningsmedel. Använd denna maträtt för injektioner. </li><li> Inkubera fisken i bedövningsmedel tills fisken dämpar. </li></ol> 4. Snitt och Cerebroventricular mikroinjektion <ol><li> Ta ut fisken ur lådan med hjälp av en fisk nät och placera den i petriskål. </li><li> Håll försiktigt fisken med pincett och orientera huvudet på ett sätt att det lutar något nedåt. Detta kommer att underlätta snittet. </li><li> Skapa en liten skåra på skallen med en 30 gauge taggar-end nål. Använd bara toppen av nålen och inte penetrerar mer ännog in i hjärnan eftersom detta kommer att orsaka skador på hjärnvävnaden och kommer att manifesteras som blödning. </li><li> Fortsätt att hålla fisken och in spetsen på glaset kapillär genom snittet webbplatsen. </li><li> Orient spetsen på glas kapillär mot telencefalon. Undvik att vidröra hjärnvävnad det därmed ger vävnadsskada och förhindrar även dispersion av den injicerade lösningen. </li><li> Injicera lösningen. Vätskan dispergerar omedelbart efter injektion. </li></ol> Fem. Återvinning och Analysera Injection Noggrannhet <ol><li> Ta ut fisken ur injektionen inställning och plats i en plastlåda med färsk fisk vatten. </li><li> Tillåt återhämtning. </li><li> Re-söva fisken med 0,0025% MESAB kortvarigt och kontrollera fisken under fluorescensmikroskop. En grundlig dispersion av röd fluorescens är en indikation på utbredd fördelning av den injicerade vätskan. </li><li> Lägg fisken tillbaka till plastlådan. </li><li> Anslut plastlådan till than cirkulationssystem att syresätta fisk och underhålla under längre tidsperioder. </li><li> Använd fisken för önskade ändamål såsom beteendemässiga analyser eller offra djuren vid önskade tidpunkter efter injektionen för att förbereda vävnadsprover för vidare analys (histologiska färgningar, immunohistokemi, etc.). Följande referenser ger exempel på hur man analyserar den vuxna zebrafisk hjärnan: 9,11,17-20,24-27. Den snabbaste tiden att observera en effektiv knockdown (mer än 50% knockdown) var 12 tim i våra studier 22. </li></ol> 6. Föreslagna Vetenskapliga Kontroller <ol><li> Använd en mismatch morfolinogrupp molekyl som inte är tänkt att orsaka någon fenotyp som en negativ kontroll. Använd antingen en vanlig morpholino molekyl eller specifikt konstruktion morfolinogrupper kontroller för varje gen av intresse. Dessutom använder lösningsmedlet (i detta fall PBS) som ytterligare en negativ kontroll för att bedöma de icke-specifika effekter eller toxicitet av mismatch / styra morfolinogrupper injektioner. </li><li> Använd PCNA morpholinos beskrivits tidigare 22 som positiva kontroller. Denna morfolino orsakar effektiv knockdown i den vuxna zebrafisk hjärnan (75-95% ÖVERVÄLDIGANDE effektivitet inom 1 dag injektion) 22. </li></ol>

<ol>
	<li>Stocum, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Regenerative Biology and Medicine. , (2006).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nat. Rev. Genet. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Doetsch, F., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+for+brain+repair:+insights+from+adult+neurogenesis+in+birds+and+mammals.">Challenges for brain repair: insights from adult neurogenesis in birds and mammals.</a> Brain Behav. Evol. 58 (5), 306-322 (2001).</li><li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Grandel, H., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+adult+neural+stem+cell+activity+in+vertebrates.">Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates.</a> Dev. Genes Evol. , (2013).</li><li>Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Adult Neurogenesis 2: Stem Cells and Neuronal Development in the Adult Brain. , (2010).</li><li>Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+the+astroglial+lineage+are+neural+stem+cells.">Cells in the astroglial lineage are neural stem cells.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 179-191 (2008).</li><li>Grandel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain:+origin,+proliferation+dynamics,+migration+and+cell.">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell.</a> 295 (1), 263-277 (2006).</li><li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+non-mammalian+vertebrates.">Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates.</a> Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).</li><li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon.">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).</li><li>Byrd, C. A., Brunjes, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish.">Neurogenesis in the olfactory bulb of adult zebrafish.</a> Neuroscience. 105 (4), 793-801 (2001).</li><li>Pellegrini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+aromatase-positive+radial+glial+cells+as+progenitor+cells+in+the+ventricular+layer+of+the+forebrain+in+zebrafish.">Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).</li><li>Lam, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish.">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish.</a> 238 (2), 475-486 (2009).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Wnt-responsive+cells+in+the+zebrafish+hypothalamus.">Identification of Wnt-responsive cells in the zebrafish hypothalamus.</a> Zebrafish. 6 (1), 49-58 (2009).</li><li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+adult+zebrafish+cerebellum:+initiation+and+maintenance+of+a+novel+stem+cell+niche.">Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche.</a> J. Neurosci. 29 (19), 6142-6153 (2009).</li><li>Ganz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+Fgf+dependence+of+adult+neural+progenitors+in+the+zebrafish+telencephalon.">Heterogeneity and Fgf dependence of adult neural progenitors in the zebrafish telencephalon.</a> Glia. 58 (11), 1345-1363 (2010).</li><li>M&#228;rz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58 (7), 870-888 (2010).</li><li>Rothenaigner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+by+distinct+viral+vectors+identifies+bona+fide+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+telencephalon+and+characterizes+their+division+properties+and+fate.">Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate.</a> Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).</li><li>Kroehne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Dev. Biol. 342 (1), 26-38 (2010).</li><li>Kizil, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebroventricular+microinjection+(CVMI)+into+adult+zebrafish+brain+is+an+efficient+misexpression+method+for+forebrain+ventricular+cells.">Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells.</a> PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).</li><li>Morcos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vivo-Morpholinos:+a+non-peptide+transporter+delivers+Morpholinos+into+a+wide+array+of+mouse+tissues.">Vivo-Morpholinos: a non-peptide transporter delivers Morpholinos into a wide array of mouse tissues.</a> Biotechniques. 45 (6), 613-614 (2008).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+receptor+cxcr5+regulates+the+regenerative+neurogenesis+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain.</a> Neural Dev. 7, 27 (2012).</li><li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=her5+expression+reveals+a+pool+of+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+midbrain.">her5 expression reveals a pool of neural stem cells in the adult zebrafish midbrain.</a> Development. 133 (21), 4293-4303 (2006).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+neurogenesis+from+neural+progenitor+cells+requires+injury-induced+expression+of+Gata3.">Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3.</a> Developmental Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).</li><li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).</li><li>Rosen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li><li>Rikin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse+genetic+approach+to+test+functional+redundancy+during+embryogenesis.">A reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis.</a> J. Vis. Exp. (42), e2020 (2010).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Den metod som vi beskriver här tillåter enkel och snabb administrering av morpholinos i den vuxna zebrafisk hjärnan. Vi har visat att vårt injektion metod effektivt blockerar genuttryck i ventrikulära celler och resulterar i funktionella konsekvenser i neurogenesisen svar. Det finns viktiga punkter att vara försiktig när du exekverar cerebroventricular mikroinjektion. Exempelvis beror verkan av morfolino molekyler på den använda koncentrationen. Denna koncentration måste bestämmas av slutanvändaren. Vi rekommenderar att du börjar med stamlösning (500 M) och utföra spädningar, och helst till förtest genom injektion i embryon med hjälp av standard embryo injektion protokoll 28-30. Tidigare fick vi olika nivåer av knockdown effektivitet med koncentrationer av morpholinos från 50 um till 500 iM 22. Andra bör mynningen hos glaskapillär inte large eftersom detta kommer att leda till omfattande flytande inflöde in i hjärnan efter injektionen. På liknande sätt måste öppningen inte vara för snäv eftersom detta kommer att förhindra tillräcklig injektion. Man kan bestämma den optimala öppningen-tryck kombination genom att pumpa in luft i en Petri-skål med vatten. Bubblorna som uppstår bör vara i en enda rad, men inte i flera rader. Vi visar detta i videon. Tredje, inkubering av fisk i anestetika är kritisk. Fisken ska inte sparas längre än 2 min i bedövningsmedel. Detta kommer att hämma återhämtningen hastigheten efter injektionen. Fjärde, är platsen för snittet avgörande för grundligt dispergera den injicerade vätskan. Den ventrikulära regionen under den optiska tectum är större ovanför mittlinjen och blir smalare i sidled. Därför bör försöksledaren generera slitsen i skallen nära mittlinjen och bara kaudalt om skallen plattan täcker telencephalic regionen. En av fördelarna med det cerebroventricular injection (CVMI)-metoden är dess rapidness. CVMI är en snabb metod för att analysera geners funktion. Den här funktionen är viktig och användbar vid jämförelse med generering av transgena linjer för funktionella studier, som i allmänhet tar flera månader. Dessutom leder CVMI till likformig fördelning av den injicerade vätskan och därför ger en relativt noggrann manipulation av genaktivitet, vid jämförelse med fokala injektioner eller elektroporering. Med CVMI, kan flera gener slås ned samtidigt genom att förbereda injektionen blandar innehåller flera morpholinos oligonukleotid. CVMI kan användas för att injicera olika koncentrationer av en given morfolino oligonukleotider, och kan därför användas för att analysera hypomorphic fenotyper. Slutligen orsakar denna injektion paradigm inte toxicitet eller äventyra överlevnaden hos djuren. Den CVMI Tekniken kan utvidgas till andra typer av studier såsom injektion av modulatoriska peptider, droger, plasmid-DNA eller modulerande RNA molecules eller andra ämnen som kan påverka fysiologin av cellerna. Testmetoder kombination av molekyler och utföra analyser dos-respons är möjligt med vår metod, vilket studerar hypomorphic fenotyper. Med dessa egenskaper, visar CVMI att vara en snabb och enkel analys för uttryck studier i den vuxna zebrafisk hjärnan, och öppnar upp snabb screening och funktionella analyser. Den vuxna zebrafisk hjärnan kan konstitutivt producera nya neuroner längs hela rostrocaudal axeln och det kan också regenerera efter traumatiska skador. Detta står i skarp kontrast till däggdjurshjärnor med begränsad neurogenesisen och om alls, ganska dålig regenerativ förmåga. Sådan utbredd stamceller aktivitet och återhämtning förmåga gör zebrafisk en användbar modell organism för att förstå de molekylära program som krävs för centrala nervsystemet regenerering, som för närvarande till stor del okända. Därför undersöker molekylära grunden för regenerativ lämplighet zebrafish hjärnan är en intressant värld av forskning som skulle kunna förklara den grundläggande skillnaden hur fisk och däggdjur hjärnor reagerar efter en skada, och även förse vägar för regenerativa medicinska behandlingar hos människor. För att förstå den molekylära infrastruktur av ryggradsdjur hjärnans plasticitet och regeneration, gliaceller fungerar som ett viktigt forskningsområde, eftersom de är de neurogena stamfäder 3,8,20. Således, med hjälp CVMI teknik för att förändra geners funktion i de radiella gliaceller i zebrafisk hjärnan är avgörande för att belysa hur fiskar hjärnan kan par stamfader aktivitet till effektiv vuxen neurogenes och regenerativ respons. Vi har nyligen visat att involvera och kravet på flera faktorer och signalvägar i den regenerativa neurogenes svaret hos vuxna zebrafisk hjärnan 24,26,27, och dessa studier har möjliggjorts genom användning av CVMI metod. Sammantaget kan den kunskap vi får från zebrafisk hjärnan utnyttjas för att införa regenerative förmåga att däggdjurs gliaceller som reagerar på skador och kommer därmed att hjälpa designa kliniska terapier för mänskliga neurologiska sjukdomar och akuta skador.

Adult neurogenes är ett gemensamt drag för ryggradsdjur, men graden av förekomst och effektivitet varierar med fylogeni 1,2,3,4,5,6. Till exempel, vuxna däggdjur hjärnor innehåller regioner stamceller i stort sett begränsad till framhjärnan 7,8, medan teleost zebrafisk innehåller sexton olika domäner stamceller och tillhörande neurogena zoner i hela hjärnan 4,5,9,10. Denna variation mellan däggdjur och zebrafisk kan spegla en skillnad i mekanismerna för stamceller underhåll och den neurogena kapacitet stamceller. Den livslånga kompetens zebrafisk att producera nervceller i hjärnan kan också innebära kliniska följder som de molekylära mekanismer som zebrafisk hjärnan skulle kunna utnyttjas för terapeutiska tillämpningar för att ta itu med de neurodegenerativa sjukdomar hos människor. Flera stamceller zoner av den vuxna zebrafisk hjärnan har analyserats och det har visats attceller som kantar ventrikulära ytan av dessa regioner fungerar som stamceller 9,11-20. Detaljerade analyser i zebrafisk telencefalon, till exempel, identifieras de radiella gliaceller, som avgränsar den ventrikulära ytan av denna hjärnregion att vara neurogena progenitorer 19, 20. Detta gäller för andra regioner såsom lillhjärnan och optiken tectum, där ventricularly-läge neuroepitelceller ger neurogen ingång 16,21. För detta ändamål, att förstå de molekylära mekanismer som styr den utbredda neurogen kompetens i vuxen zebrafisk hjärnan kräver manipulation av genuttryck i stamceller. Olika metoder har tidigare beskrivits för att modulera geners funktion i zebrafisk. Dessa inkluderar generering av villkorade transgena linjer som uttrycker önskade varianter av ett enda protein, plasmid-baserade fokala injektioner kopplade till elektroporation eller kemiska behandlingar. Vi konstruerade tidigare ettmetod för administrering av olika substanser inklusive morfolino oligonukleotider eller proteiner i den vuxna zebrafisk hjärnan med cerebroventricular mikroinjektion som ett snabbt och effektivt sätt att modulera genfunktion i ventrikulära cellerna hos vuxna zebrafisk framhjärnan 22. I våra studier, var vivo morpholinos användas på grund av deras kemi som involverar morpholino-molekylen kovalent bunden till arginin rika leverans peptider, vilka möjliggör effektiv leverans till cellerna av intresse utan behov av extra permeabilization såsom elektroporation 23. Detta skulle möjliggöra en noggrann inriktning av den önskade vävnaden efter injektionen, precis vad vi observerade i vuxen zebrafisk telencephalon 22. Användning av vivo morpholinos är därför överlägsna redan existerande metoder för vävnad riktar såsom elektroporation eller fokal injektion av DNA-molekyler. Här visar vi visuellt hur vi utför denna operation och ge ensteg-för-steg-protokoll. Vi börjar med att förklara beredning av injektion blandning och fisken som ska injiceras, och fortsätt genom att påvisa hur injektionen apparaturen sätts upp. Vi tillhandahåller en beskrivning av cerebroventricular injektion metod, som innebär generering av ett snitt i skallen och injektion av morpholinos använder microinjector. Vi utarbetar också på de kritiska punkter man måste vara försiktig med under hela proceduren genom att ange dem som optimering eller felsökning guider.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Red CMTPX</td>
 <td>Life Technologies, Invitrogen</td>
 <td>C34552</td>
 <td>Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A5040</td>
 <td>For anesthetizing the fish</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>821,472</td>
 <td>For handling the fish during injection and imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate-buffered saline</td>
 <td>Life Technologies, GIBCO</td>
 <td>10010-056</td>
 <td>As sterile dilution medium</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vivo morpholinos</td>
 <td>Gene Tools Inc.</td>
 <td>Customized</td>
 <td>More info on vivo morpholinos: <a href="http://www.gene-tools.com" target="_blank">www.gene-tools.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbed-end needle</td>
 <td>Becton-Dickinson</td>
 <td>305178</td>
 <td>To generate the incision in the skull</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting microscope</td>
 <td>Olympus, Leica, Zeiss </td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>Part of the whole injection setup</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont Tweezers</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501985</td>
 <td>To snap off the tip of the glass capillary</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescence camera</td>
 <td>Zeiss, Nikon, Leica</td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>To visualize the fluorescence after injection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gillies Dissecting Forceps</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501265</td>
 <td>To hold the fish in position</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass injection capillaries</td>
 <td>World Precision Instruments </td>
 <td>TWF10 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PicoNozzle kit (microinjector holder)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>5430-12</td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pneumatic PicoPump (microinjector)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-PV820 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring illuminator; Ring Light Guide</td>
 <td>Parkland Scientific</td>
 <td>ILL-RLG </td>
 <td>For illuminating the specimen</td>
 </tr>
	</tbody>
 </table>

micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides

Manipulering av genuttryck i vävnader krävs för att utföra funktionella studier. I denna uppsats visar vi cerebroventricular mikroinjektion (CVMI) teknik som ett sätt att modulera genuttryck i den vuxna zebrafisk hjärnan. Genom att använda CVMI kan substanser administreras in i cerebroventricular vätskan och noggrant fördelade längs rostrocaudal axel av hjärnan. Vi fokuserar särskilt på användningen av antisens morfolinogrupper oligonukleotider, som är potenta verktyg för att knacka ner genuttryck in vivo. I vår metod, när den tillämpas, är morfolinogrupper molekyler tas upp av celler som kantar ventrikulära ytan. Dessa celler innefattar de radiella gliaceller, som fungerar som neurogena progenitorer. Därför, knacka ner genuttryck i de radiella gliaceller är av yttersta vikt att analysera den utbredda neurogenesen respons i zebrafisk, och skulle också ge insikt i hur ryggradsdjur kunde tåla vuxen NeurogenESIS svar. En sådan förståelse skulle också hjälpa de insatser för kliniska tillämpningar inom mänskliga neurodegenerativa sjukdomar och centrala nervsystemet förnyelse. Därför presenterar vi cerebroventricular mikroinjektion metoden som ett snabbt och effektivt sätt att förändra genuttryck och neurogenes svar i den vuxna zebrafisk framhjärnan. Vi erbjuder även felsökningstips och annan användbar information om hur man kan genomföra det CVMI förfarandet.

Cerebroventricular mikroinjektion leder till utbredd fördelning av den injicerade lösningen Använda arbetsflöde och tekniska system för cerebroventricular mikroinjektion visas i figur 1, administrerade vi morpholino oligonukleotider i den vuxna zebrafisk hjärnan. En korrekt injektionsprotokoll leder till spridning av den injicerade vätskan i hela hjärnan och effektiv målinriktning av cellerna nära den ventrikulära yta (Figur 2A). Injektioner där glaskapillär spetsar hjärnvävnaden kommer att ha en tät fluorescerande signal vid punkten för injektion (Figur 2B). Om den injicerade mängden är inte tillräckligt, kommer svag fluorescerande signal observeras (figur 2C). Cerebroventricular mikroinjektion kan användas för att knacka ner genuttryck vid ventrikel-regionen av den vuxna zebrafisk hjärnan Vi har visat thvid vivo morpholinos kan penetrera några celldiametrar inuti ventrikulära ytan och därmed kan effektivt rikta ventrikulära celler (Figur 3A, 3B). Morfolino injektion kan knockdown genuttryck, eftersom det kommer att minska produktionen av det motsvarande proteinet (ett exempel är PCNA såsom visas i figurerna 3C, 3D). Vi har tidigare visat att knacka ner gener med användande denna teknik leder till funktionella konsekvenser under den vuxna neurogenes (figurerna 3E, 3F) eller regenerering respons (figur 3G, 3H). Vi visade att den effektiva knockdown intervall (mer än 50% knockdown) uppnås ca 12 timmar efter injektion av morpholinos 22. Vi observerade också att en effektiv knockdown period är förrän cirka 5 dagar efter injektion för PCNA protein 22. Mer än 70% knockdown sågs förrän 3 dagar efter injektionen 22. De knockdown kurvorna är beroende on graden av uttryck av endogena proteiner och effektiviteten av morpholino molekylerna, och måste bestämmas för varje gen av försöksledaren. I våra studier har vi inte se att det CVMI förfarandet äventyrar överlevnaden för djuret, förmodligen därför att administrationen av morpholino molekylerna är lokal och inte orsakar en systemisk toxicitet. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1.jpg" /> Figur 1. Schematisk representation av cerebroventricular injektionsteknik. (A) Injektionen utförs utgående från dorsala av den vuxna zebrafisk (1) i nivå av optisk tectum (ot, 2). Ett snitt görs över optiken tectal skallen plattan med en 30-gauge nål (3). Använda glaskapillärer, är morfolino molekyler injiceras i den ventrikulära vätska (4). En noggrann dispergering är enchieved momentant (5). (B) Kanylen och dess hullingförsedda-ände visas i hög förstoring. (C) Orienteringen av nålen innan snittet. (D) Snittet är inringat och beskrivs med streckade linjer. (E) Injektionen kapillär är placerad såsom visas och injektion utförs. Alla paneler var anpassade från ref. 22. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig2.jpg" /> Figur 2. Jämförelse av injektion effektivitet och noggrannhet. (A) En bra injektion leder till inriktning av cellerna nära den ventrikulära ytan. (B) Om glaset kapillär sätts in i hjärnvävnaden, kommer detta att generera ett centralt beläget fluorescenssignal. (C </strong&gt;) Om mängden injektionen är låg, kommer detta att leda till svagare fluorescens signal. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3.jpg" /> Figur 3. . Morfolino penetration, effektivitet gen knockdowns och funktionella konsekvenser (A) GFP immunfärgning på telencephalic tvärsnitt kontroll morfolino-injicerade Tg (H2A: GFP) transgen linje visar GFP-positiva kärnor. (B) GFP immunfärgning på telencephalic tvärsnitt av GFP antisens morfolino-injicerade Tg (H2A: GFP) transgen linje visar GFP-positiva kärnor. Notera skillnaden i GFP-signalen vid den ventrikulära regionen. v: ventrikeln. (C) PCNA immunfärgning på kontroll morfolino-injicerade hjärnor visar utbredd distribution av PCNA-positiva celler. ( <strong&gt; D) PCNA immunfärgning på PCNA antisens morfolino-injicerade hjärnor visar signifikant minskade mängder av PCNA-positiva celler, som visar att CVMI can knockdown endogena gener. (E) BrdU och Huc / D immunoinfärgning på kontroll morfolino-injicerade hjärnor att avgöra nyfödda nervceller efter en BrdU puls-chase experiment beskrivits tidigare 22. (F) BrdU och Huc / D immunoinfärgning på PCNA antisens morfolino-injicerade hjärnor att avgöra nyfödda nervceller efter en BrdU puls-chase experiment beskrivits tidigare 22. (G) knacka-down PCNA leder till betydande minskning av generering av nyfödda nervceller, vilket indikerar att CVMI kan användas för att knockdown endogena gener, som ger upphov till funktionella konsekvenserna. Alla paneler var anpassade från ref. 22 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides at JoVE.com

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

I denna artikel, visar vi en metod för manipulering av genuttryck i ventrikulära celler av vuxna zebrafisk telencefalon med antisens morfolinogrupper oligonukleotider. Vi presenterar denna metod som ett effektivt och snabbt protokoll som kan användas för funktionella studier i vuxen ryggradsdjur hjärnan.

Mikromanipulation av genuttryck i vuxna zebrafisk hjärnan med Cerebroventricular mikroinjektion av Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Ryggmärgen Elektrofysiologi II: Extracellulär Sug elektrod Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Högupplöst Live avbildning av cellens beteende i utvecklingsländerna neuroepitelet

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Optimerad Analys av DNA-metylering och Gene Expression från små, anatomiskt definierade områden i hjärnan

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Stereotaktisk kirurgi för excitotoxisk skada av specifika områden i hjärnan i vuxen råtta

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektrofysiologiska inspelning i hjärnan i Intact vuxna zebrafisk

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Analys av genuttryck Förändringar i Rat Hippocampus Efter Deep Brain Stimulation av Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Använda Fluorescensaktiverad cellsortering för att Undersök Cell-Type-Specific Gene Expression i råtthjärnvävnad

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modellering Amyloid-β42 toxicitet och Neurodegeneration i vuxna zebrafiskar hjärnan

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Övervakning av dygnsrytm klocka genuttryck i mus suprachiasmatiska kärnan med hjälp av fluorescens reportrar

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Använda Near-infraröd Fluorescence och hög upplöst skanning för att mäta protein uttryck i gnagare Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...