Name: imaging and 3d reconstruction of cerebrovascular structures in embryonic zebrafish
Uploaded: 2014-04-22T13:45:00
Duration: 8 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish at JoVE.com

Forfatterne takker tidligere og nuværende medlemmer af vores laboratorier, der hjalp med at udvikle disse teknikker. Delvis finansiering til DE af en bevilling fra California Institute til regenerativ medicin / CIRM (RN1-00538).

1.. Zebrafisk dyrehold, Embryo Generation og behandling <ol><li> Foretag følgende zebrafisk protokoller under vejledning af en institutionel dyrepleje og brug udvalg (IACUC), og inden dyrepleje retningslinjer for NIH eller andre regulerende organer / retningslinjer. </li><li> Zebrafisk stammer, der udtrykker fluorescerende proteiner i specifikke væv, celler eller organer er tilgængelige fra zebrafisk International Resource Center (Zirc). For eksempel Tg (KDR: EGPF) s843 udtrykker EGFP i vaskulære endotelceller 6, som kan anvendes til at fremstille hele 3D vaskulære strukturer, som vist i denne protokol. Andre linjer af transgene zebrafisk er tilgængelige fra Zirc. </li><li> Hus voksen zebrafisk i et passende akvakultur, der overvåger pH, saltholdighed, temperatur, opløst ilt, lys og andre miljømæssige faktorer 7.. Den her viste zebrafisk blev opstaldet i en Aquaneering Inc.-system (San Diego, CA) ved 28,5 ° C med en 14 timers Light/10 timers mørke cyklus. Feed voksen zebrafisk en afbalanceret kost af saltlage rejer og NRD 4/6 Fiskefoder (artemia Direct, Ogden, Utah). </li><li> Voksne mandlige og kvindelige zebrafisk avl alder bør huses særskilt at stige parring succes. </li><li> Stimulere æglægning og befrugtning ved at placere kvinder (2-4) og mænd (4-6) sammen i en parring beholder, der har en maske bund med huller store nok til, at æggene kan falde igennem, men for lille til zebrafisk voksne til at passere . Opsætning parringer aftenen før; æg er lagt nær daggry, som regel mens dagtimerne lys cyklus langsomt stiger i intensitet (daggry). Check for æg på bunden af ​​parring beholder hver 15-30 minutter. </li><li> Indsamle æg ved hjælp af en mesh si og ren med E3-buffer (5 mM NaCl, 0,17 mM KCI, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4). Overfør æggene til 100 mm dyrkningsplader fyldt med E3 buffer og opbevares i en 28 ° C inkubator. </li><li> For at undersøge kemikalier der ændrer CERebrovascular forgrening tilføje ønskede kemiske koncentrationer. For eksempel neovasular forgrening kan induceres med γ-sekretase hæmmer (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butylester) solubiliseret i DMSO 4, begyndende 24 timer efter befrugtning (HPF). Dengang-point embryoner er stadig inden chorion, og mange kemikalier kan passere gennem det 8.. Hvis en behandling tilstand har neurale eller motoriske effekter, som kan nedsætte evnen af embryoner til at bryde fri af chorion, så embryoner skal være de-chorionated mellem 24 og 48 HPF, hvilket kan gøres med enten pincet pronase 2. Embryoner vist i billederne leveret blev dechorionated ved forsigtigt at snuppe chorion med to skærpet pincet og rive det åbent. </li><li> Hvis det er nødvendigt / ønsket pigment dannelse kan inhiberes ved tilsætning af 0,003% N-phenylthiourinstof (PTU) til E3 buffer ved 24 HPF. </li></ol> 2.. Konfokal Imaging cerebrovaskulær Structninger i faste zebrafisk embryoner <ol><li> Sacrifice embryoner i 250 mg / L tricaine methanesulfonate, og derefter fastsætte dem ved nedsænkning i 2 - 4% paraformaldehyd natten over ved 4 ° C. Beholdere med fluorescerende embryoner skal pakkes ind i folie. Når faste, bør embryoner opbevares i PBS ved 4 ° C indtil filmede - EGFP fluorescensintensitet bliver mindre løst efter ca en uge, men morfologi (set i lyse område) er bevaret meget længere. </li><li> Forbered dig på at montere foster ved først at fjerne det ene øje ved hjælp af en skærpet wolfram nål. Skær omkring det væv, der forbinder øjet først derefter skæres musklerne, og endelig skar synsnerven at fortrænge øjet. (Bemærk: Hvis billeddannelse begge sider ønskes fjernes begge øjne.) </li><li> Når øjet er fjernet, monteres embryoet på et dækglas bruge en dråbe på 3% methylcellulose. Vend embryoet, så den side med det fjernede øje vender mod dækglas og er så tæt på glasset som muligt. Dæk hele foster med methyllcellulose at forhindre udtørring under billedbehandling. </li><li> Billede monteret embryo straks med et omvendt konfokal mikroskop er udstyret med en høj kvalitet 20x Plan Apo målsætning (blændetal = 0,75 eller bedre). Denne konfiguration er at foretrække frem for en ikke-inverteret mikroskop, der ville kræve sandwiching embryo mellem to glasplader fly, og trykke på embryo mod top glas. </li><li> Saml optiske skiver i 1 um trin ved hjælp af en indstilling mellemstor eller stor blænde. Større trin på 2,5 um kan også anvendes, men det kan være mere vanskeligt at bestemme den rumlige orden mindre objekter. Små åbninger producere skarpere detaljer, men de længere scanninger kræves kan blege EGFP og også begrænse dybden af ​​billeddannelse i embryonet, der kan opnås. En konfokal mikroskop giver mulighed for billedbehandling omkring halvvejs gennem et foster. </li><li> Hvis der ønskes billeddannelse af hele fisk, fjerne begge øjne i starten (se note i trin 3.2), drej embryo efter imaging den ene side, og gentag trin 2,3-2,5 til den modsatte side. </li></ol> 3.. 3D Rekonstruktion af Embryonale zebrafisk Cerebrovasculature <ol><li> Brug Fiji fordeling 3 af open source ImageJ (http://fiji.sc), som er optimeret til 3D-gengivelser, gratis, og kompatibel med PC, Mac og Linux computere. </li><li> Importer konfokal stakke til Fiji ved at gå til Plugins&gt; Loci&gt; BioFormats Importør 9 derefter vælge den konfokal fil, f.eks name.ids Nikon stakke (figur 2A). Vælg Vis stak med Hyperstack, farvetilstand: gråtoner, check autoscale, check split kanaler. </li><li> Disse valg vil åbne fire separate kanal paneler; for EGFP kun én vil være behov for, som regel den tredje en ned. Luk de andre tre paneler (rød, blå og alfa) forlader 16-bit billede med et langt navn, efterfulgt af C = 1 (figur 2A). </li><li> Juster tærskel ved at scanne selvom billedet ved hjælp af scroll tab langs bunden for at finde en skive der har regionen eller strukturen af interesse, så gå til Image&gt; Juster&gt; Threshold (figur 2C). </li><li> I panelet, der kommer op, skal du skubbe den øverste bar (sort niveau) til venstre, så strukturen kan ses ganske godt over baggrunden, og lad den nederste slide (hvid), hvor det er (Figur 2D). Vælg B &amp; W, skal du vælge mørk baggrund. Vælg ikke beregne Tærskel for hvert billede, medmindre kræves der forskellige justeringer for hver skive, skal du vælge sort baggrund. Denne proces skaber en ny 8-bit billede. </li><li> ADVARSEL: Threshold kan ikke fortrydes eller gemmes i ImageJ, så konfokal stak skal genindlæses, hver gang der er behov for en ændring. Skriv ned numre og prøve forskellige indstillinger, indtil det ønskede resultat er opnået. </li><li> Gå til Plugins&gt; 3D Viewer&gt; Threshold 0, resampling faktor 1 (bedst) eller 2 (god), fravælge de røde og blå farve kasser for at gøre en grøn 3D udgang - ellers er det will producere en hvid gengivelse - Vælg Anvend (ikke Auto) (Figur 2E). </li><li> Rotere, spin og zoome 3D-billedet ved hjælp af mus og tastatur kontrol (figur 2F). </li><li> Gem stillbilleder på ethvert punkt ved hjælp af capture i menuen. Størrelsen af ​​billedet boks på skærmen dikterer pixel dimensioner på billedet er produceret, så hvis en høj opløsning billede ønskes gøre kassen større ved at trække i nederste højre hjørne. </li><li> Opret en spinning 3D-film ved at vælge Vis&gt; Optag 360 grader rotation (figur 2G). Rotation standard er 2 grader pr skridt, men det kan ændres til 5 grader for eksempel, som vil skabe meget mindre filstørrelser, men kan tilføje livagtigt til animationen. </li><li> Gem filen i et af flere tilgængelige formater til senere visning med medieafspillere, uploade til internettet, eller bruge i PowerPoint-præsentationer. Den open source medieafspiller, VLC ( <a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">ht</a>tp :/ / www.videolan.org / VLC / index.html), er gratis og håndterer disse videoer meget godt. </li></ol>

<ol>
	<li>Staudt, D., Stainier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+molecular+and+cellular+mechanisms+of+heart+development+using+the+zebrafish.">Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 46, 397-418 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Cameron, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's-related+peptide+amyloid-&#946;+plays+a+conserved+role+in+angiogenesis.">Alzheimer's-related peptide amyloid-&#946; plays a conserved role in angiogenesis.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Cunvong, K., Huffmire, D., Ethell, D. W., Cameron, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-&#946;+increases+capillary+bed+density+in+the+adult+zebrafish+retina.">Amyloid-&#946; increases capillary bed density in the adult zebrafish retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, 1516-1521 (2013).</li><li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+husbandry+of+zebrafish+(Danio+rerio):+a+review.">The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review.</a> Aquaculture. 269, 1-20 (2007).</li><li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+major+permeability+barrier+in+the+zebrafish+embryo.">Characterization of a major permeability barrier in the zebrafish embryo.</a> Biol Reprod. 59, 1240-1250 (1998).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Opitz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+zebrafish+illuminate+the+dynamics+of+thyroid+morphogenesis+and+its+relationship+to+cardiovascular+development.">Transgenic zebrafish illuminate the dynamics of thyroid morphogenesis and its relationship to cardiovascular development.</a> Dev Biol. 372, 203-216 (2012).</li><li>Gleave, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroanatomical+phenotyping+of+the+mouse+brain+with+three-dimensional+autofluorescence+imaging.">Neuroanatomical phenotyping of the mouse brain with three-dimensional autofluorescence imaging.</a> Physiol Genomics. 44, 778-785 (2012).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Markaki, Y., Smeets, D., Cremer, M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+applications+for+super-resolution+3D+structured+illumination+microscopy.">Fluorescence in situ hybridization applications for super-resolution 3D structured illumination microscopy.</a> Methods Mol Biol. 950, 43-64 (2013).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. 68, e4272 (2012).</li></ol>

Der er ikke noget at afsløre.

De her beskrevne metoder giver et fundament for visuelle undersøgelser af det vaskulære system i udviklingslandene zebrafisk. Levende enheder kan bruges til at vurdere fysiologiske parametre, såsom puls og hjerte slagtilfælde volumen, mens faste prøver kan bruges til høj opløsning konfokal billedbehandling. Drosophila og C. elegans mulighed for hele kroppen, men her zebrafisk er hvirveldyr og giver en nyttig model for vertebrate væv, herunder en endotelcelle-foret vaskulære system. Disse undersøgelser kan omfatte betydelige transgene linjer og genomiske ressourcer fra zebrafisk forskningsmiljø. 3D rekonstruktion og gengivelse af konfokal billeder fra embryonale zebrafisk, som beskrevet her, give mulighed for en systembiologi tilgang til vaskulær forgrening og blodkar tæthed der ikke er muligt med større dyremodeller, såsom rotter og mus. Yderligere, da amniotes zebrafisk udvikle sig i en modificerbare miljø (E3 buffer), hvor man kan nemt tilføje chemicals der hæmmer specifikke enzymer eller andre processer, der påvirker vaskulær udvikling. Koncentrationen og timingen af ​​kemiske levering kan ændres, således at forskeren at finjustere behandling forhold. 1. Ændringer og fejlfinding Modifikationer til dette system kan inkorporere transgene linjer af zebrafisk, der udtrykker EGFP eller andre fluorescerende proteiner i en lang række væv, organ eller en region specifikke mønstre 10. Endvidere har analyse af neovaskulære ændringer i zebrafisk nethinden for nylig blevet publiceret 5.. Problemer med pigmentering i ældre fostre og voksne zebrafisk kan kompenseres ved at krydse med transgene linier, der ikke producerer skala pigmenter eller retinal pigment. Problemer med formindsket fluorescens typisk resultere fra upassende fikseringen forhold. Paraformaldehyd (4%) i 1 dag er optimal, men stærkere fikseringsmidler, såsom glutaraldehyd, osmiumtetroxid eller alkohol, kanødelægge EGFP fluorescens. Efter fiksering bør embryoner opbevares i PBS ved 4 ° C og altid er beskyttet mod direkte sollys. 2. Begrænsninger af denne teknik Den kvalitet og opløsning af 3D-gengivelser produceret med denne protokol afhænger af kvaliteten af ​​billeder, der genereres. Lysgennemtrængning gennem disse embryoner er begrænset til midten Sagittalplan hjælp af en standard konfokal mikroskop. Dette aspekt af imaging begrænser dybden af ​​billeddannelse i ældre fostre og voksne, men mere avancerede multi-foton mikroskopi-systemer giver mulighed for billedbehandling på større dybder. 3.. Betydning i forhold til de eksisterende metoder Denne protokol giver en tilgang til analysen af ​​blodkarrenes netværk på uddannelsessystemerne, der kan inkorporere en hel dyr. Tidligere fremstillinger af disse data ofte påberåbte serie af billeder, der ud sammen, men 3D-rendering giver bedre opløsning af det rumlige forholdverandører involveret. 4.. Fremtidige anvendelser Ny udvikling i billedbehandling og vævsbehandlingen vil give mange nye applikationer til disse metoder, der kan omfatte at gøre ældre fostre eller voksne gennemsigtig 11-14. Øget gennemsigtighed vil i høj grad øge vævspenetration ved konfokal og multi-foton lasere. Yderligere, da hastigheden af kameraer og fotomultiplikatorrør øge det kan snart være muligt at producere 3D-gengivelser af fisk i realtid, hvilket giver en 4. dimension af analysen. 5.. Kritiske trin Et afgørende skridt i denne protokol er forberedelse til billedbehandling, som omfatter korrekt fiksering. Billeddiagnostik bør ske så hurtigt som muligt efter fiksering med høj kvalitet mål, der har de bedste numeriske åbninger til rådighed. Opløsning afhænger af det billeddannende system, der anvendes, så systemer af høj kvalitet er generelt bedre. Generering 3D-gengivelser er hukommelse intensivfor så nyere, high-end computere med en stor mængde hukommelse og god grafik-processorer anbefales. Den visuelle biologi her beskrevne system er blevet optimeret til transgene zebrafisk, der udtrykker EGFP i vaskulære endotelceller, selv om disse fremgangsmåder kan tilpasses til transgene embryoner, der udtrykker GFP eller andre fluorescerende proteiner, i populationer af neuroner, muskler, kirtler eller en række andre celler. Den største fordel i at arbejde med dette system er evnen til at studere, hvad der sker i hele embryo på noget tidspunkt i løbet af denne udviklingsmæssige periode, i faste og / eller levende dyr.

Zebrafisk giver et kraftfuldt system til at studere udviklingsmæssige biologi, og den relative gennemsigtighed i deres embryoner er modtagelig for imaging-baserede undersøgelser 1.. Zebrafisk er nu blevet anvendt som en model for vertebrat udvikling i årtier. Benfisk, herunder zebrafisk, har et forenklet hvirveldyr vaskulære system, der ikke har nogen rimelig homolog i hvirvelløse dyr. Pumpes blodet fra det forreste kammer i en to-kamret hjertet gennem gæller, hvor det oxygenerede. Blod fra gællerne konvergerer på ryggens aorta og passerer gennem arterierne, der gren i mindre og mindre fartøjer, til sidst nå kapillærer i orgel væv. Inden kapillærer ilt frigives og kuldioxid absorberes. På den venøse side af kapillærer blod strømmer ind i større og større vener og er endelig trukket ind i bageste kammer i hjertet, hvor cyklus gentager. En voksen zebrafisk kan lægge 200 eller flere æg ad gangen, og once befrugtet, udvikler de hurtigt 2. Inden for én dag kroppen aksen er veludviklet, herunder muskler, kontrakt og flytte fosteret rundt inde i chorion membran. Fra 2-7 dage efter befrugtningen (DPF) de fleste af kroppens systemer udvikler sig, herunder øjne og en central nervesystem, der kan koordinere svømme mod mad eller væk fra stærkt lys. Op til 7 dpf embryoner er små nok til at muliggøre visualisering med mikroskopi. Transgene linier, der udtrykker fluorescerende proteiner kan afbildes med konfokal eller fluorescensmikroskopi. Konfokal imaging kan parres med open source-software 3 for at skabe 3D-gengivelser af komplette vaskulære strukturer i zebrafisk embryoner, der giver en systembiologi perspektiv af vaskulær udvikling. Undersøgelser beskæftiger sig med ændringer i vaskulær og cerebrovaskulær kompleksitet vil drage fordel af denne protokol, da det giver mulighed for en systemniveau analyse af vaskulære netværk 4,5. En samling af metoder og ressourcer er at gived for at give mulighed for nem vedtagelse og af disse teknikker til undersøgelser, der kræver billedbehandling af vaskulære strukturer i embryonale zebrafisk. Omkostningseffektivitet zebrafisk som en dyremodel er at kombinere med nye imaging teknologier til at levere nye platforme til at vurdere, angiogene effekter af molekylære veje i hvirveldyr udvikling og homeostase.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="889">
	<tbody>
		<tr>
			<td>N &#8211; Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, catalog #41972</td>
			<td></td>
			<td>0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Mat-Tek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSI IX/DAPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates&#160;</td>
			<td>Becton-Dickinson, cat# 351147</td>
			<td></td>
			<td>BD Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>VWR,&#160; cat #414004-001</td>
			<td></td>
			<td>VWR disposable transfer pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-cellulose&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, cat#43146</td>
			<td></td>
			<td>3% in E3 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRD 4/6 Fish food&#160;</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Dried</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine shrimp</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Live</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire&#160;</td>
			<td>Small Parts # TW-016-60</td>
			<td></td>
			<td>0.016&#8221; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>VWR # 101107-950</td>
			<td></td>
			<td>Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and 3d reconstruction of cerebrovascular structures in embryonic zebrafish

Zebrafisk er et kraftfuldt værktøj til at studere udviklingsmæssige biologi og patologi in vivo. Den lille størrelse og relative gennemsigtighed i zebrafisk embryoner gør dem særligt anvendelige til visuel undersøgelse af processer såsom hjerte-kar-udvikling. I flere nylige undersøgelser transgene zebrafisk, der udtrykker EGFP i vaskulære endotelceller blev brugt til billede og analysere komplekse vaskulære netværk i hjernen og nethinden, ved hjælp af konfokal mikroskopi. Beskrivelser er forudsat at forberede, behandle og image zebrafisk embryoner, der udtrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP), og derefter generere omfattende 3D-gengivelser af det cerebrovaskulære system. Protokoller omfatte behandling af embryoner, konfokal billedbehandling, og fiksering protokoller, der bevarer EGFP fluorescens. Endvidere er nyttige tips om at få billeder af cerebrovaskulære strukturer, såsom fjernelse øjet uden at beskadige nærliggende neurale væv af høj kvalitet til rådighed. Potentielle faldgrubermed konfokal imaging diskuteres sammen med de nødvendige foranstaltninger til at generere 3D-rekonstruktioner fra konfokal billedstakke bruger frit tilgængelige open source software trin.

3D rekonstruktion af vaskulære strukturer giver en omfattende og visuelt interessant perspektiv af zebrafisk udvikling. Figur 1 og 2 viser metoder, som de typisk sker. Figur 3 viser flere vinkler af vaskulære strukturer i en 6 dpf zebrafisk foster, der udtrykte EGFP i endotelceller. Med en solid grøn eller hvid farve kan det være svært at værdsætte signal intensitet; pseudo-farve giver billedet intensitet fra en look-up-bord og giver en bedre dybde perception når strukturer overlapper hinanden. Et eksempel på en pseudo-farvet 3D-billede af vaskulaturen i en 6 dpf zebrafisk er tilvejebragt i figur 4. Kan Fluorescens billeddannelse af levende embryoner anvendes til at studere de fysiologiske egenskaber, der indbefatter øjet og kropsbevægelse, og hjerteaktivitet. Figur 3 og 4 viser repræsentative resultater opnået med disse metoder, ved hjælp af transgene zebrafisk linje<html> beskrevet. Imaging beslutning afhænger mikroskop egenskaber, men lysstyrken EGFP signal er tilstrækkelig til god billedkvalitet med de fleste kommercielle systemer. Genopbygning og rendering af 3D-repræsentationer er konsekvent og muligheder inden for denne open-source software giver konsekvent gode resultater. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" /> Figur 1.. Eye fjernelse. A) En fast 3 dpf embryo med en wolfram behov placeret ved siden af øjet. Væv skæres omkring øjet fra denne position. B) Øjet er falder ud, og de ​​underliggende okulære muskler og synsnerven skæres. Den tomme øjenhulen indikeret med stiplede cirkel. C) Det samme embryo vendes og monteret med methyl-cellulose, med det intakte øjet opad.<html> hres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" /> Figur 2.. Trin-for-trin 3D rekonstruktion af en konfokal billedstak. A) Åbn fil (4104.1.ids) indlæst i Fiji ved hjælp af plugins&gt; Loci&gt; Bioformat at vælge. B) Efter at have fundet en skive med regionen af interesse, er tærskel justering valgt som vist. C) Threshold justeres til 214 bruge den øverste skyderen og anvende er valgt. D) 3D-fremviseren kaldes som vist. e) 3D-rekonstruktion er vist af en zebrafisk med øjet intakt, til orientering. F) Billedet er zoomet og roteres. G) Et 360 graders rotation film er fremstillet som vist.<html> res.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. <img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" /> Figur 3.. Perspektiver fra 3D-rekonstruktion. A) Medial perspektiv på 6 dpf embryo filmede med 10x objektiv, munden er til højre, ikke gæller inde munden. B) Lateral samme embryo, note finne er en sløjfe i midten. C) Samme embryo filmede med 20x objektiv, mediale perspektiv note gælle opløsning. D) Lateral perspektiv på 20x objektiv billeddannelse. Finnen er på højre kant af panelet. E) Antero-mediale syn på 20x objektiv billeddannelse, note gæller inde munden. F) Abdomen af samme embryo filmede med et 20x objektiv, leder det til højre. Bemærk vaskulatur på blommesækken nederst til højre.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" /> Figur 4.. Intensitet forskelle i 6 dpf foster. Billede af en 6 dpf rekonstruktion ved hjælp af en pseudo-look-up-table for signal intensitet. Munden, hjerne, gæller og blommesæk er mærket til orientering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" /> Figur 5.. Movie af rekonstrueret vaskulære system i en 4 dpf zebrafisk. Fisken blev afbildet på 2,5 mM. Billederne varfra imaging ene halvdel af embryoet. Sammenlign vaskulære strukturer med strukturer i et GSI behandlet zebrafisk tilvejebragt i fig. 6. Bemærk lavere tæthed af blodkar i hovedet og større gæller. (Se &quot;Zfish_spin.avi&quot; supplerende fil under Downloads) <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" /> Figur 6.. 3D film af karsystemet i en GSI behandlet foster ved 4 dpf. Fisken blev afbildet på 2,5 um igennem fra lateral til midterlinjen. Sammenlign karstrukturer med kontrollen 4 dpf fisk er vist i fig. 5. Den buede tilbage og mindre størrelse er typisk i embryoner, der er behandlet med dette kemikalie. (Se &quot;GSI-treated_4dpf_fish.avi&quot; supplerende fil under Downloads)

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish at JoVE.com

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Billeddannelse af cerebrovaskulær udvikling i larvernes zebrafisk er beskrevet. Teknikker til at lette 3D billedbehandling og ændre cerebrovaskulær udvikling ved hjælp af kemiske behandlinger også.

Imaging og 3D Genopbygning cerebrovaskulær Strukturer i embryonale zebrafisk

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Immunfarvning af dissekerede zebrafisk Embryonale Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Et system til<em&gt; Ex vivo</em&gt; Dyrkning af embryonale Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-Påført skade af zebrafisk Embryonale skeletmuskulatur

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analyse af embryonale og larvestadiet Zebrafisk Skeletal myofibre fra Dissocierede Forberedelser

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravital mikroskopi af Imaging Subcellulære Strukturer Live mus, der udtrykker fluorescerende proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...