Name: imaging and 3d reconstruction of cerebrovascular structures in embryonic zebrafish
Uploaded: 2014-04-22T13:45:00
Duration: 8 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish at JoVE.com

המחברים מודים לחברים בעבר ובהווה של המעבדות שלנו שעזרו לפתח את הטכניקות הללו. מימון חלקי שנמסר לי DE על ידי מענק ממכון קליפורניה לרפואת רגנרטיבית / CIRM (RN1-00538).

1. דג הזברה בעלי, דור עובר, וטיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל פרוטוקולי דג הזברה הבאים תחת הדרכתו של ועדה מוסדית טיפול בבעלי החיים ושימוש (IACUC) ובמסגרת הנחיות טיפול בבעלי חיים של NIH או גופים / הנחיות רגולטוריות אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זני דג הזברה שמבטאים חלבוני ניאון ברקמות ספציפיות, תאים או איברים זמינים ממרכז המשאבים הבינלאומי דג הזברה (Zirc). לדוגמא, Tg (KDR: EGPF) s843 להביע EGFP בתאי אנדותל כלי דם 6, אשר יכול לשמש לייצור מבני כלי דם 3D מלאים כפי שמוצג בפרוטוקול זה. קווים אחרים של דג הזברה מהונדס זמינים Zirc. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דג הזברה מבוגר בית במערכת חקלאות ימית מתאימה המנטרת את רמת חומציות, מליחות, טמפרטורה, חמצן מומס, אור, וגורמים סביבתיים אחרים 7. דג הזברה מוצגת כאן שוכנו במערכת Aquaneering Inc (סן דייגו, קליפורניה) בשעה 28.5 ° C עם lig 14 שעהמחזור כהה ht/10 שעה. להאכיל את דג הזברה מבוגר דיאטה מאוזנת של ארטמיה ומזון NRD 4/6 דגים (ארטמיה ישירה, אוגדן, יוטה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכר בוגר ודג זברת נקבה בגיל פוריות צריך להיות שוכנו בנפרד כדי להגדיל מוצלח הזדווגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר הטלת ביצים והפריה על ידי הצבת נקבות (2-4) וגברים (4-6) יחד במכל הזדווגות שיש לו תחתית רשת עם חורים גדולים מספיק לביצים ליפול דרך, אבל קטן מדי עבור המבוגרים דג הזברה לעבור . הגדרת הזדווגויות הערב לפני; ביצים מוטלות ליד שחר, בדרך כלל בזמן מחזור שעות היום האור מגביר לאט בעצימות (שחר). בדוק עבור ביצים בחלק התחתון של מיכל ההזדווגות כל 15-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ביצים באמצעות מסננת רשת ונקיה עם חיץ E3 (5 mM NaCl, 0.17 מ&quot;מ KCl, 0.33 מ&quot;מ CaCl 2, 0.33 מ&quot;מ MgSO 4). מעביר את הביצים ל100 תרבות צלחות מ&quot;מ מלא בחיץ E3 וחנות בחממה 28 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללמוד כימיקלים שמשנים CERebrovascular הסתעפות להוסיף ריכוזים כימיים הרצויים. לדוגמא הסתעפות neovasular יכולה להיגרם עם מעכבי γ-secretase (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)] אסתר-S-phenylglycinet-בוטיל) solubilized ב4 DMSO, החל 24 שעות שלאחר הפריה (hpf). באותו הזמן עובר נקודה הם עדיין בתוך סיסי, וכימיקלים רבים יכולים לעבור את זה 8. אם מצב טיפול יש השפעות עצביות או מנוע שעלול לפגוע ביכולתם של עוברים להשתחרר מסיסי, ולאחר מכן עובר צריך להיות דה chorionated בין 24 ו48 hpf, אשר יכול להיעשות גם עם מלקחיים של pronase 2. עוברים שמוצגים בתמונות שסופקו היו dechorionated בעדינות על ידי תופס סיסית עם שני מלקחיים מחודדים וקורע אותה פתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך / רצוי, היווצרות פיגמנט יכולה להיות מעוכבת על ידי הוספת 0.003% N-Phenylthiourea (PTU) למאגר שE3 ב24 hpf. </li></ol> 2. Confocal הדמיה של כלי הדם במוח Structures בעוברי דג הזברה קבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העוברים ב250 methanesulfonate Tricaine מ&quot;ג / ליטר, ולאחר מכן לתקן אותם על ידי טבילה ב2 - paraformaldehyde 4% בין לילה ב 4 ° C. מכולות עם עוברי ניאון צריכה להיות עטופות בנייר כסף. קבוע פעם אחת, צריכים להיות מאוחסנים עוברי PBS ב 4 מעלות צלזיוס עד צילמו - עוצמת הקרינה EGFP הופכת פחות נפתרה לאחר כשבוע, אבל מורפולוגיה (כפי שנצפו בשדה בהיר) נשמרה הרבה זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לעלות את העובר על ידי הסרת עין אחת הראשון באמצעות מחט טונגסטן חידדה. לחתוך סביב רקמת חיבור העין ראשונה ולאחר מכן לחתוך את השרירים ולבסוף חתך את עצב הראייה כדי לעקור את העין. (הערה: להסיר אם ההדמיה שני הצדדים הוא רצוי בשתי העיניים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע העין מוסרת, הר העובר על coverglass באמצעות ירידה של methylcellulose 3%. לכוון את העובר כך שהצד עם העין שהוסרה עומד בפני coverglass וקרוב לזכוכית ככל האפשר. לכסות את כל העובר עם methylcellulose כדי למנוע התייבשות במהלך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת העובר רכוב באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך מצויד מטרת 20x תכנית Apo באיכות גבוהה (צמצם מספרי = 0.75 או יותר) באופן מיידי. תצורה זו עדיפה על מיקרוסקופ שאינו הפוך שיחייב הרבדה העובר בין שני מטוסי זכוכית, ולחיצה על העובר על הזכוכית העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף פרוסות אופטיות במרווחים של 1 מיקרומטר באמצעות הגדרת צמצם בינונית או גדולה. גם צעדים גדולים יותר של 2.5 מיקרומטר ניתן להשתמש בם, אבל זה עלול להיות קשה יותר כדי לקבוע את הסדר המרחבי של אובייקטים קטנים יותר. פתחים קטנים לייצר פירוט חדים יותר, אך הסריקות נדרשות עוד יכולות להלבין EGFP וגם להגביל את העומק של הדמיה לעובר שניתן להשיג. מיקרוסקופ confocal מאפשר הדמיה על חצי דרך עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הדמיה של כל הדגים היא רצויה, להסיר את שני העיניים בתחילת הדרך (ראה הערה בשלב 3.2), לסובב את העובר לאחר לדמייןצד אחד גרם וחזור על השלבים 2.3-2.5 לצד הנגדי. </li></ol> 3. 3D שחזור עוברי דג הזברה Cerebrovasculature <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהפצת פיג&#39;י 3 של ImageJ קוד פתוח (http://fiji.sc), אשר מותאמת במיוחד עבור הדמיות 3D, ללא תשלום, ותואמת עם מחשבי PC, Mac ו-Linux. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערימות יבוא confocal לפיג&#39;י ידי הולך BioFormats לוקוסים&gt; יבואן 9 לאחר מכן בחר תוספים&gt; קובץ confocal, למשל name.ids לערימות של ניקון (איור 2 א). בחר צפו במחסנית עם מצב hyperstack, צבע: גווני אפור, בדוק autoscale, לבדוק ערוצים לפצל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירות אלה יפתחו ארבעה פנלי ערוץ נפרדים; לEGFP רק אחד יהיה צורך, בדרך כלל אחד למטה השלישי. סגור שלושה לוחות האחרים (אדום, כחול ואלפא) והשאיר את התמונה 16 סיביות עם שם ארוך ואחריו (איור 2 א) C = 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם סף על ידי סריקה אם כי את התמונה באמצעות הגלילה taב בחלק התחתון כדי למצוא הפרוסה שיש לו את האזור או מבנה של עניין, ואז ללכת לתמונה&gt; התאם&gt; סף (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפנל שעולה, חלק את הסרגל העליון (רמה שחורה) משמאל, כך שהמבנה ניתן לראות היטב על רקע, ולהשאיר את השקופית התחתונה (ברמה לבנה) שבו הוא (איור 2 ד). בחר B &amp; W, בחר רקע כהה. אל תבחר סף לחשב עבור כל תמונה, אלא אם כן התאמות שונות הנדרשות לכל פרוסה, בחרו רקע שחור. תהליך זה יוצר תמונה של 8 ביט חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזהרה: סף לא ניתן לבטל או נשמר בImageJ, אז ערימת confocal תצטרך להיות מחדש בכל פעם שיש צורך בשינוי. רשום את המספרים ולנסות הגדרות שונות עד לתוצאה הרצויה מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לתוספים&gt; 3D Viewer&gt; סף 0, דגימה מחדש של גורם 1 (הטוב ביותר) או 2 (טוב), בטל את התיבות בצבע אדום והכחולים כדי להפוך את פלט 3D ירוק - אחר זה will לייצר לבן טיוח - בחר החל (לא אוטומטי) (2E איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב, ספין וזום תמונת 3D באמצעות העכבר ומקשי מקלדת (איור 2F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירת תמונות סטילס בכל נקודה על ידי שימוש באפשרות ללכוד בתפריט. גודל תיבת התמונה על המסך מכתיב ממדי פיקסל של התמונה מיוצרים על כך שאם תמונה ברזולוציה גבוהה היא רצויה להפוך את התיבה גדולה יותר על ידי גרירת הפינה ימנית התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור סרט 3D ספינינג על ידי בחירת סיבוב תצוגה&gt; שיא 360 מעלות (איור 2G). ברירות המחדל של סיבוב עד 2 מעלות לכל צעד, אבל זה יכול להיות שונה עד 5 מעלות לדוגמא, אשר ייצרו גדלי קובץ קטנים בהרבה, אבל עשוי להוסיף עצבנות לאנימציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הקובץ באחד מכמה פורמטים זמינים לשימוש מאוחר יותר צפייה עם נגני מדיה, העלאה לאינטרנט, או באמצעות במצגות PowerPoint. נגן המדיה בקוד הפתוח, VLC <a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">(ht</a>TP :/ / www.videolan.org / vlc / index.html), הנו ללא תשלום ומטפל בסרטונים האלה טובים מאוד. </li></ol>

<ol>
	<li>Staudt, D., Stainier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+molecular+and+cellular+mechanisms+of+heart+development+using+the+zebrafish.">Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 46, 397-418 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Cameron, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's-related+peptide+amyloid-&#946;+plays+a+conserved+role+in+angiogenesis.">Alzheimer's-related peptide amyloid-&#946; plays a conserved role in angiogenesis.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Cunvong, K., Huffmire, D., Ethell, D. W., Cameron, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-&#946;+increases+capillary+bed+density+in+the+adult+zebrafish+retina.">Amyloid-&#946; increases capillary bed density in the adult zebrafish retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, 1516-1521 (2013).</li><li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+husbandry+of+zebrafish+(Danio+rerio):+a+review.">The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review.</a> Aquaculture. 269, 1-20 (2007).</li><li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+major+permeability+barrier+in+the+zebrafish+embryo.">Characterization of a major permeability barrier in the zebrafish embryo.</a> Biol Reprod. 59, 1240-1250 (1998).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Opitz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+zebrafish+illuminate+the+dynamics+of+thyroid+morphogenesis+and+its+relationship+to+cardiovascular+development.">Transgenic zebrafish illuminate the dynamics of thyroid morphogenesis and its relationship to cardiovascular development.</a> Dev Biol. 372, 203-216 (2012).</li><li>Gleave, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroanatomical+phenotyping+of+the+mouse+brain+with+three-dimensional+autofluorescence+imaging.">Neuroanatomical phenotyping of the mouse brain with three-dimensional autofluorescence imaging.</a> Physiol Genomics. 44, 778-785 (2012).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Markaki, Y., Smeets, D., Cremer, M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+applications+for+super-resolution+3D+structured+illumination+microscopy.">Fluorescence in situ hybridization applications for super-resolution 3D structured illumination microscopy.</a> Methods Mol Biol. 950, 43-64 (2013).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. 68, e4272 (2012).</li></ol>

אין מה לחשוף.

השיטות שתוארו כאן לספק בסיס ללימודים חזותיים של מערכת כלי הדם בפיתוח דג הזברה. דגימות בשידור חי ניתן להשתמש כדי להעריך את פרמטרים פיסיולוגיים, כגון קצב לב ונפח פעימת לב, ואילו דגימות קבועות יכולות לשמש לconfocal הדמיה ברזולוציה גבוהה. דרוזופילה וג elegans לאפשר הדמיה של כל גוף, אבל דג הזברה הן בעלי חוליות ולספק מודל שימושי לרקמות חוליות, כולל מערכת כלי דם מרופד תא האנדותל. מחקרים אלה יכולים לשלב קווים מהונדסים משמעותיים ומשאבים הגנומי מהקהילה מחקר דג הזברה. שחזור 3D ו טיוח של תמונות confocal מדג הזברה עוברית, כפי שתואר כאן, מאפשר גישת ביולוגיה של מערכות להסתעפות של כלי דם וצפיפות כלי דם שאינה אפשרי עם מודלים של בעלי חיים גדולים כמו חולדות ועכברים. יתר על כן, כamniotes דג הזברה מתפתחת בסביבה לשינוי (חיץ E3), שבו אפשר להוסיף בקלות גhemicals המעכבים אנזימים ספציפיים או תהליכים אחרים המשפיעים על התפתחות של כלי דם. הריכוז ועיתוי המשלוח כימי ניתן לשנות, מה שמאפשר לחוקר תנאי טיפול לכוונן. 1. שינויים ופתרון בעיות שינויים במערכת זו יכולה לשלב קווים מהונדסים של דג הזברה שמבטאים חלבוני ניאון EGFP או אחרים במגוון רחב של דפוסי רקמות ספציפיים, איבר או אזור 10. יתר על כן, ניתוח של שינויי neovascular ברשתית דג הזברה באחרונה פורסם 5. בעיות עם פיגמנטציה בעוברים ודג זברה מבוגרים יותר יכולות להיות מתוגמלות על ידי מעבר עם קווים מהונדסים, שאינו מייצרים פיגמנטים בקנה מידה או פיגמנט של רשתית. בעיות עם הקרינה מופחתת בדרך כלל כתוצאה מתנאי קיבעון לא הולמים. Paraformaldehyde (4%) ליום 1 הוא אופטימלי, אבל fixatives חזק יותר, כגון glutaraldehyde, tetroxide אוסמיום או אלכוהול, עלוללהרוס הקרינה EGFP. לאחר קיבוע, צריך להיות כל הזמן עובר בPBS ב 4 ° C ותמיד מוגן מפני אור שמש ישיר. 2. מגבלות של טכניקה זו האיכות והרזולוציה של הדמיות 3D מיוצרות עם פרוטוקול זה תלויות באיכות של תמונות שנוצרו. חדירת אור דרך עוברים אלה מוגבלים למישור אמצע sagittal-באמצעות מיקרוסקופ confocal סטנדרטי. היבט זה של הדמיה מגביל את העומק של הדמיה בעוברים ומבוגרים, אבל מערכות מיקרוסקופיה רב פוטון מתקדמות יותר מאפשרות הדמיה בעומקים גדולים יותר. 3. משמעות ביחס לשיטות קיימות פרוטוקול זה מספק גישה לניתוח של רשתות כלי דם ברמה מערכות שיכולים לשלב כל בעלי חיים. ייצוגים קודמים של נתונים כאלה לעתים קרובות הסתמכו על סדרה של תמונות ערוכים יחד, אבל טיוח 3D מספק רזולוציה טובה יותר של רלה המרחביתtionships מעורב. 4. יישומים עתידיים פיתוחים חדשים בתחום הדמיה ועיבוד רקמות יספק יישומים חדשים רבים לשיטות אלה, שעשויים לכלול מה שהופך את עוברים או מבוגרים 11-14 שקוף מבוגרים יותר. שקיפות משופרת תגדיל חדירה לרקמות מאוד על ידי לייזרי פוטונים רב confocal ו. יתר על כן, כמו המהירות של מצלמות וצינורות מכפיל להגדיל זה עשוי להיות אפשרי בקרוב לייצר הדמיות 3D של דגים בזמן אמת, ומספק ממד ה -4 של ניתוח. 5. צעדים קריטיים שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא הכנה להדמיה, הכולל קיבוע נכון. הדמיה צריך להיעשות בהקדם האפשרי לאחר קיבוע עם יעדים באיכות גבוהה שיש להם הפתחים המספריים הטובים ביותר הזמינים. החלטה תלויה במערכת ההדמיה משמשת, מערכות איכות כל כך גבוהה הן בדרך כלל טוב יותר. יצירת הדמיות 3D היא זיכרון אינטנסיבילכך מחשבים עם כמות גדולה של זיכרון ומעבדי גרפיקה טובים יותר, high-end מומלץ. מערכת הביולוגיה החזותית שתוארה כאן כבר מותאמת לדג זברה מהונדס המבטא EGFP בתאי האנדותל של כלי דם, אם כי יכולים להיות מותאמות בשיטות אלה לעוברים מהונדסים המבטאים את ה-GFP, או חלבוני ניאון אחרים, באוכלוסיות של תאי עצב, שרירים, בלוטות או כל מספר של תאים אחרים. היתרון העיקרי בעבודה עם מערכת זו הוא היכולת ללמוד מה שקורה בכל העובר בכל עת במהלך תקופת התפתחותי זה, בבעלי חיים קבועים ו / או בשידור חי.

דג הזברה לספק מערכת רבת עוצמה כדי לחקור ביולוגיה התפתחותית, והשקיפות היחסית של העוברים שלהם ניתנת למחקרים מבוססי הדמיה 1. החברה דג הזברה שמשה כמודל לפיתוח חוליות במשך עשרות שנים. Teleosts, כוללים דג הזברה, יש מערכת כלי דם חוליות פשוטה שאין לו הומולוג סביר בחסרי חוליות. דם נשאב מהלשכה הקדמית של לב שני תאיים דרך זימים, שם הוא מחומצן. דם מהזימים מתכנס באב העורקים הגב ועובר דרך עורקי הסניף לתוך כלי קטן יותר ויותר, בסופו נימי לכת ברקמות איברים. בתוך חמצן נימים הוא שוחרר ופחמן דו חמצני נספג. בצד הוורידים של נימי דם זורם לורידים גדולים יותר ויותר ולבסוף נשאב לתוך התא האחורי של הלב, שבו המחזור חוזר. דג הזברה מבוגר יכולה להניח 200 או יותר ביצים בכל פעם, וoncדואר מופרה, שהם מפתחים במהירות 2. בתוך יום אחד ציר הגוף מפותח, כולל שרירים שחוזה ולהעביר את העובר סביב בתוך קרום כוריוני. מ2-7 ימים לאחר הפריה (DPF) רוב מערכות הגוף לפתח, כולל עיניים ומערכת עצבים מרכזיות שיכולים לתאם שוחה לעבר מזון או הרחק מאור בהיר. עד 7 עוברי DPF הם קטנים מספיק כדי לאפשר הדמיה עם מיקרוסקופ. קווים מהונדסים המבטאים את חלבוני ניאון ניתן הדמיה עם מיקרוסקופיה confocal או הקרינה. ההדמיה confocal ניתן לזווג עם תוכנות קוד פתוח 3 כדי ליצור הדמיות 3D של מבני כלי דם מלאים בעוברי דג הזברה המספקים נקודת מבט ביולוגיה מערכות של התפתחות כלי דם. מחקרים העוסקים בשינויים במורכבות כלי דם וכלי דם במוח ייהנו מפרוטוקול זה כפי שהוא מאפשר ניתוח ברמת מערכות של רשתות כלי דם 4,5. אוסף של שיטות ומשאבים הם לספקד, כדי לאפשר אימוץ קל ושל טכניקות אלה ללימודים שדורשים הדמיה של מבני כלי דם בדג זברה עוברית. יעילות העלות של דג הזברה כמודל חיה היא שילוב עם טכנולוגיות הדמיה המתעוררות לספק פלטפורמות חדשות שבה להעריך את השפעות angiogenic של מסלולים מולקולריים בהתפתחות חוליות והומאוסטזיס.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="889">
	<tbody>
		<tr>
			<td>N &#8211; Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, catalog #41972</td>
			<td></td>
			<td>0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Mat-Tek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSI IX/DAPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates&#160;</td>
			<td>Becton-Dickinson, cat# 351147</td>
			<td></td>
			<td>BD Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>VWR,&#160; cat #414004-001</td>
			<td></td>
			<td>VWR disposable transfer pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-cellulose&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, cat#43146</td>
			<td></td>
			<td>3% in E3 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRD 4/6 Fish food&#160;</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Dried</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine shrimp</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Live</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire&#160;</td>
			<td>Small Parts # TW-016-60</td>
			<td></td>
			<td>0.016&#8221; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>VWR # 101107-950</td>
			<td></td>
			<td>Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and 3d reconstruction of cerebrovascular structures in embryonic zebrafish

דג הזברה הוא כלי רב עוצמה כדי ללמוד ביולוגיה התפתחותית ופתולוגיה בגוף חי. הגודל הקטן ושקיפות היחסית של עוברי דג הזברה להפוך אותם שימושי במיוחד לבדיקה ויזואלית של תהליכים כגון לב והתפתחות כלי דם. בכמה מחקרים שנעשה לאחרונה דג הזברה מהונדס המבטא EGFP בתאי האנדותל של כלי דם שימשו לתמונה ולנתח את רשתות כלי דם מורכבות במוח וברשתית, באמצעות מיקרוסקופיה confocal. תיאורים מסופקים להכין, לטפל ותמונה עוברי דג הזברה שמבטאים את החלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP), ולאחר מכן ליצור הדמיות 3D מקיפות של מערכת כלי הדם במוח. פרוטוקולים כוללים את הטיפול בעוברים, הדמיה confocal, ופרוטוקולי קיבעון שלשמר הקרינה EGFP. יתר על כן, עצות שימושיות על קבלת תמונות באיכות גבוהה של מבני כלי דם במוח, כגון הסרת עין ללא רקמה עצבית סמוכה מזיקה מסופקות. בעיות פוטנציאליותעם ההדמיה confocal הם דנו, יחד עם הצעדים הדרושים כדי ליצור 3D שחזורים מארובות תמונת confocal באמצעות תוכנת קוד פתוח זמינה באופן חופשי.

שחזור 3D של מבני כלי דם מספק נקודת מבט מקיפה ומעניינת מבחינה ויזואלית של פיתוח דג הזברה. איורים שיטות מופע 1 ו -2 כפי שהם בדרך כלל עשו. איור 3 מציג כמה זוויות של מבני כלי דם ב6 DPF עובר דג הזברה שהביע EGFP בתאי האנדותל. עם צבע ירוק או לבן מוצק זה יכול להיות קשה להעריך את עוצמת אות; פסאודו צביעה לספק עוצמת תמונה מלהסתכל למעלה שולחנות ומאפשרת תפיסת עומק טובה יותר כאשר מבנים חופפים. דוגמא לתמונת 3D פסאודו בצבע של כלי הדם ב6 DPF דג הזברה מסופקת באיור 4. דימות פלואורסצנטי של עוברים חיים יכולה לשמש כדי לחקור מאפיינים פיסיולוגיים הכוללים את העין ותנועת גוף, ופעילות לב. איורים 3 ו -4 להראות תוצאות שהושגו עם נציג שיטות אלה, תוך שימוש בקו דג הזברה המהונדס<html> תאר. הדמיה ברזולוציה תלויה במאפייני מיקרוסקופ, אבל הבהירות של אות EGFP מספיק עבור איכות תמונה טובה עם רוב המערכות מסחריות. שיקום וטיוח של ייצוגי 3D הוא עקביים ואפשרויות בתוך תוכנת קוד פתוח זו מספקות תוצאות טובות באופן עקבי. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" /> איור 1. הסרת עין. א) העובר DPF 3 קבועים עם צורך טונגסטן ממוקם בסמוך לעין. רקמה היא לחתוך מסביב לעין מזו עמדה. B) העין היא נופל החוצה ושרירי העין הבסיסיים ועצב ראייה נחתכים. שקע העין הריק מסומן בעיגול מקווקו. C) אותו העובר התהפך ועלה עם מתיל תאית, בעין ללא פגע פונה כלפי מעלה.<html> hres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" /> איור 2. צעד אחר צעד שחזור 3D של ערימת תמונת confocal. א) פתח קובץ (4104.1.ids) הטעון בתוך פיג&#39;י באמצעות תוספים&gt; לוקוסים&gt; Bioformat לבחור. ב &#39;) לאחר מציאת פרוסה עם האזור של עניין, התאמת סף נבחרה כפי שמוצגת. C) סף מותאם ל214 משתמש העליון מחוון ולהחיל נבחר. צופה 3D D) נקרא כפי שמוצג. E) שחזור 3D מוצג של דג הזברה עם עין שלמה, להתמצאות. F) התמונה כבר מוגדלת ומסובבת. G) סרט סיבוב של o360 הוא עשה כפי שמוצג.<html> res.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" /> איור 3. פרספקטיבות משחזור 3D. א) נקודת מבט המדיאלי של 6 העובר DPF צילם עם 10x אובייקטיבי, פה הוא בצד הימין, ולא זימים בתוך פה. ב &#39;) לרוחב של אותו העובר, סנפיר פתק הוא לולאה באמצע.) אותו העובר C צילם עם 20x אובייקטיבי, נקודת מבט המדיאלי, רזולוציה זימים פתק. ד) נקודת מבט רוחבית של 20x הדמיה אובייקטיבית. הסנפיר הוא בקצה הימני של הפנל.) תצוגה Antero-E המדיאלי של 20x הדמיה אובייקטיבית, זימי פתק בתוך הפה של בטן. F) מאותו העובר צילם עם 20x אובייקטיבי, ראשו לצד הימין. שים לב כלי דם בצק החלמון בפינה הימנית התחתונה.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" /> איור 4. הבדלי עוצמה ב6 עובר DPF. תמונה של שיקום 6 DPF באמצעות להסתכל למעלה שולחנות pseudocolor לעוצמת אות. פה, מוח, זימים וצק חלמון מסומנים להתמצאות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" /> איור 5. הסרט של מערכת כלי דם משוחזרת בדג זברת DPF 4. הדגים היו צילם ב2.5 מיקרומטר. התמונות היומהדמית חצי אחד של העובר. השוואת מבני כלי דם עם מבנים בדג זברה שטופל GSI סיפקו באיור 6. שים לב לצפיפות נמוכה יותר של כלי דם בראש ובזימים גדולים יותר. (ראה קובץ משלים &quot;Zfish_spin.avi&quot; תחת הורדות) <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" /> איור 6. 3D סרט של מערכת כלי דם בעובר שטופל ב-GSI בDPF 4. הדגים היו צילם ב2.5 מיקרומטר באמצעות מרוחב לקו אמצע. השוואת מבני כלי דם עם השליטה DPF 4 דגים שמוצגים באיור 5. הגב המקומר והגודל קטן יותר אופייניים בעוברים שטופלו בחומר כימי זה. (ראה קובץ משלים &quot;GSI-treated_4dpf_fish.avi&quot; תחת הורדות)

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish at JoVE.com

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

הדמיה של כלי דם במוח בפיתוח דג הזברה זחל הוא תאר. טכניקות כדי להקל על ההדמיה 3D ולשנות התפתחות כלי דם במוח באמצעות טיפולים כימיים גם מסופקות.

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

ממוקד רקמות מפלצות עובריים: דג הזברה Gastrula השתלת תאים

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Microdissection של רקמות דג הזברה העין עובריים

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

פגיעת הליזר הביא על שריר שלד עוברי דג זברה

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

ניתוח של עוברי וזחל myofibers שלד דג הזברה מהכנות ניתקו

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...