Name: coupled assays for monitoring protein refolding in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2013-07-09T12:00:00
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Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Institutes of Health (NIGMS-074696) pour KAM et un American Society of Microbiology Robert D. Watkins Graduate Fellowship de recherche des étudiants à JLA Nous remercions aussi John Glover à l&#39;Université de Toronto pour fournir la FFL -GFP source de plasmide.

1. Construction de souches contenant FFL-GFP plasmide Pour cette étude, la souche Saccharomyces cerevisiae BY4741 (MAT a, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) a été utilisé avec une souche de suppression HSP104 de la collection de finale de levure (Open Biosystems / Thermo Scientific). La suppression a été confirmée en utilisant un anticorps spécifique pour Hsp104 analyse Western blot. FFL-GFP a été exprimée à...

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	<li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adapting+proteostasis+for+disease+intervention.">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li><li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104.">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).</li><li>Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+diffraction+studies+of+firefly+luciferase+from+Photinus+pyralis.">Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li><li>Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp104,+Hsp70,+and+Hsp40:+a+novel+chaperone+system+that+rescues+previously+aggregated+proteins.">Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins.</a> Cell. 94, 73-82 (1998).</li><li>Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+folding.">Mechanisms of protein folding.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 70-82 (2001).</li><li>Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+in+vivo+of+a+newly+translated+yeast+cytosolic+enzyme+is+mediated+by+the+SSA+class+of+cytosolic+yeast+Hsp70+proteins.">Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).</li><li>Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+binding+in+the+axial+channel+of+Hsp104.+Insights+into+the+mechanism+of+protein+unfolding.">Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding.</a> J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).</li><li>Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+bioluminescence:+a+mechanistic+approach+of+luciferase+catalyzed+reactions.">Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions.</a> IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+systems+biology+of+proteotoxic+stress+in+aging+and+disease.">The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).</li><li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence.">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li><li>Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+functions+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hsp90+chaperone.">In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).</li><li>Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+disaggregation+mediated+by+heat-shock+protein+Hsp104.">Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104.</a> Nature. 372, 475-478 (1994).</li><li>Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+stability+of+recombinant+green+fluorescent+protein+(GFPuv)+at+various+pH+values.">Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).</li><li>Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spectral+Distribution+of+Firefly+Light.">The Spectral Distribution of Firefly Light.</a> J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).</li><li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+disaggregase+machinery:+Hsp110+synergizes+with+Hsp70+and+Hsp40+to+catalyze+protein+disaggregation+and+reactivation+in+a+cell-free+system.">The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system.</a> PLoS One. 6, e26319 (2011).</li><li>Tkach, J. M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocytoplasmic+trafficking+of+the+molecular+chaperone+Hsp104+in+unstressed+and+heat-shocked+cells.">Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells.</a> Traffic. 9, 39-56 (2008).</li><li>Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Hsp70+subfamily,+Ssa,+in+protein+folding+in+yeast+cells,+seen+in+luciferase-transformed+ssa+mutants.">Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants.</a> Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).</li><li>Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+heat+shock+response+and+protein+chaperones:+budding+yeast+(Saccharomyces+cerevisiae)+as+a+model+system.">Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).</li></ol>

Dans cet article, la protéine modèle FFL-GFP a été utilisé pour montrer que le disaggregase de levure, Hsp104 contribue à la protéine re-solubilisation et de réparation. Les dosages enzymatiques et la microscopie interrogés de façon différentielle l&#39;état de la même protéine substrat pour déterminer l&#39;efficacité et le rendement de repliement. Les résultats des tests de récupération enzymatiques suggèrent que non seulement la récupération maximale de la souche mutante hsp104D ineffic...

Chez les humains, les maladies neurodégénératives, notamment la maladie d&#39;Alzheimer, de Parkinson, et la maladie de Huntington ont été liés à des mauvais repliement des protéines et de l&#39;agrégation 10. Les cellules utilisent des chaperons moléculaires pour empêcher le piégeage cinétique des protéines cellulaires dans les structures inactives mal repliées 6. Chaperons participer à des réseaux d&#39;interactions complexes au sein de la cellule, mais il n&#39;est pas complètement compris comment la somme de ces interactions contribue à proteostasis organismal. L&#39;un des principaux accompagnateurs responsables de la majorité du repliement des protéines cytosolique est le kD protéine de choc thermique 70 (Hsp70) de la famille 19. Il a été montré que la perte de la levure de Hsp70 diminue la capacité de plier naissante FFL exprimée de manière hétérologue et de replier la protéine endogène, ornithine transcarbamoylase, in vivo 18, 7. La capacité d&#39;analyser pliant avec résolution en temps quasi réel facilitera la compréhension comment supplémentaire facteurs cellulaires contribute à ce processus Hsp70-dépendante. En outre, le pliage / repliage des réactions peut ne pas être totalement dépendant de ces protéines qui contribuent, de sorte que les essais doivent être suffisamment sensible pour détecter à la fois petits et grands changements dans la cinétique et l&#39;efficacité. Le disaggregase de cellules de levure, Hsp104, joue un rôle essentiel dans la réparation de protéines mal repliées agrégées. Bien Hsp104 homologues ont été identifiés dans des champignons et des plantes, cette famille semble être absent chez les métazoaires. Il a été proposé que d&#39;autres chaperons comme ceux de la famille Hsp110 effectuer certaines des activités Hsp104 connus chez les mammifères 16. Hsp104 est un +, complexe protéique hexamérique AAA qui fonctionne dans la levure à des agrégats de protéines de remodeler, contribuant à repliement et la réparation 13. Hsp104, en même temps que la levure Hsp70, SSA1, et la levure Hsp40, Ydj1, est nécessaire pour la récupération du FFL dénaturé dans des cellules de levure 5, 8. La petite protéine de choc thermique, HSP26, a également été montré pour être exirouge pour désagrégation Hsp104 médiée par des FFL 2. FLP est une protéine à deux domaines qui se lie au substrat luciférine dans le site actif et à la suite d&#39;un changement de conformation qui nécessite l&#39;ATP et de l&#39;oxygène, décarboxyle le substrat libérant oxyluciférine, le dioxyde de carbone (CO 2), l&#39;adénosine monophosphate (AMP), et la lumière 11, 9, 3. Le substrat disponible dans le commerce FFL, D-luciférine, se traduit par l&#39;émission de lumière entre 550-570 nm qui peuvent être détectés à l&#39;aide d&#39;un luminomètre 15. FFL est extrêmement sensible à la dénaturation de traitements chimiques ou à la chaleur et agrégats rapidement au déploiement. Exposée à des températures entre 39-45 ° C FFL est réversible déplié et inactivé 12. En revanche, la GFP et ses dérivés sont très résistantes à la protéine déroulement contraintes 14. Par conséquent fusion de ces deux protéines permet FFL à fonctionner comme une entité expérimentale labile capable de cibler G fonctionnelFP intracellulaire dépôts qui peuvent être visualisées par microscopie de fluorescence à la fois la population et les niveaux de cellules individuelles. Application du dosage enzymatique dans un lecteur de plaque multimode semi-automatisé couplé à la microscopie automatisée permet une évaluation simultanée sans précédent de la cinétique et le rendement de repliement réactions. En outre, la génétique moléculaire faciles du modèle eucaryote Saccharomyces cerevisiae permet à la fois une manipulation précise du réseau de contrôle de la qualité des protéines et de la possibilité d&#39;adopter des approches basées sur la découverte d&#39;identifier de nouveaux acteurs qui contribuent à la réponse au stress cellulaire et proteostasis. Dans cette étude, les souches de type sauvage (WT) et HSP104 suppression exprimant FFL-GFP sont soumis à un choc thermique dénaturation des protéines. FFL-GFP repliement est contrôlé à la fois par un dosage enzymatique et la microscopie en lecture proxy pour la réparation du protéome exprimé sur un parcours de temps de récupération. Par rapport aux cellules WT, nous montrons ee souche de suppression Hsp104 est environ 60% moins efficace au repliement FFL-GFP, en soutenant les conclusions antérieures établissant un rôle à jouer dans la réactivation de Hsp104 dénaturé FFL 2.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Synergy MX Microplate Reader</td>
 <td>BioTek</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope</td>
 <td>Olympus, Tokyo Japan</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lumitrac 200 white 96-well plates</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SlideBook 5.0 digital microscopy software</td>
 <td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP152-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(LiAc) Lithium Acetate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L6883</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG (polyethelene glycol)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP233-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP120-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Malinckrodt</td>
 <td>4948</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1300-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC-URA</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1306-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cycloheximide</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>357420050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-luciferin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L9504</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>low melt agarose</td>
 <td>NuSieve</td>
 <td>50082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>immersion oil</td>
 <td>Cargille</td>
 <td>16484</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

coupled assays for monitoring protein refolding in saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, défini comme l&#39;association de processus de repliement des protéines / biogenèse, le repliement / réparation, et la dégradation, est un équilibre cellulaire délicate qui doit être maintenu pour éviter des conséquences néfastes 1. Les facteurs externes ou internes qui perturbent cet équilibre peut conduire à l&#39;agrégation des protéines, la toxicité et la mort cellulaire. Chez les humains, cela est un facteur majeur contribuant à des symptômes associés à des troubles neurodégénératifs tels que la maladie de Huntington, la maladie de Parkinson et la maladie d&#39;Alzheimer 10. Il est donc essentiel que les protéines impliquées dans le maintien de proteostasis être identifiés afin de développer des traitements pour ces maladies débilitantes. Cet article décrit les techniques de surveillance dans le repliement des protéines in vivo avec une résolution en temps quasi-réel en utilisant le modèle de la protéine luciférase de luciole fusionnée à la protéine fluorescente verte (FFL-GFP). FFL-GFP est une protéine chimérique de modèle unique que le groupement FLE est très sensible au stress induit par misfolding et l&#39;agrégation, qui inactive l&#39;enzyme 12. L&#39;activité luciférase est contrôlée au moyen d&#39;un dosage enzymatique, et la partie GFP propose une méthode de visualisation FFL soluble ou agrégées en utilisant la microscopie automatisée. Ces méthodes couplées intègrent deux approches parallèles et techniquement indépendant pour analyser à la fois le repliement et la réactivation de fonctionnement d&#39;une enzyme après un stress. reprise d&#39;activité peut être directement corrélée avec une cinétique de désagrégation et re-solubilisation de mieux comprendre comment les facteurs de contrôle de la qualité des protéines telles que des protéines chaperons collaborent pour remplir ces fonctions. En outre, la délétion de gènes ou des mutations peuvent être utilisés pour tester les contributions des protéines spécifiques ou des sous-unités protéiques à ce processus. Dans cet article, nous examinons les contributions de la protéine disaggregase Hsp104 13, connu sous le nom de s&#39;associer avec le facteur d&#39;échange Hsp40/70/nucleotide (NEF) système 5 repliement, de repliement des protéines pour valider cette approche.

La levure est dépendante de la disaggregase, Hsp104 se replier efficacement des protéines dénaturées par la chaleur. L&#39;activité des FFL-GFP a été contrôlé après un choc thermique de 25 min, en utilisant un dosage flash luminescence Figure 1. Les résultats de ce test automatisé montre la figure 2 ont révélé une augmentation progressive de l&#39;activité de plus de 90 min qui a finalement conduit à une récupération&gt; 80% des cellules WT. La souche hsp104Δ</em...

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Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Cet article décrit l&#39;utilisation d&#39;une protéine de fusion GFP-luciférase Firefly pour enquêter<em&gt; In vivo</em&gt; Le repliement des protéines à<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. L&#39;utilisation de ce réactif, le repliement d&#39;un modèle de protéine dénaturée par la chaleur peut être surveillé simultanément par microscopie à fluorescence, et un dosage enzymatique pour sonder les rôles des éléments du réseau de proteostasis dans le contrôle de la qualité des protéines.

Les analyses couplées pour la surveillance protéines repliement<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

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