Name: coupled assays for monitoring protein refolding in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2013-07-09T12:00:00
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इस काम KAM और हम भी FFL प्रदान करने के लिए टोरंटो विश्वविद्यालय में जॉन ग्लोवर धन्यवाद JLA को माइक्रोबायोलॉजी रॉबर्ट डी. वाटकिंस ग्रेजुएट छात्र रिसर्च फैलोशिप के एक अमेरिकी सोसायटी के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIGMS-074696) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया -GFP के स्रोत प्लाज्मिड.

1. प्लाज्मिड FFL-GFP युक्त खींच का निर्माण इस अध्ययन के लिए, Saccharomyces cerevisiae तनाव BY4741 (मेट एक, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) खमीर पीटकर संग्रह (ओपन Biosystems / थर्मो वैज्ञानिक) से एक HSP104 विलोपन तनाव के साथ इस्तेमाल ...

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	<li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adapting+proteostasis+for+disease+intervention.">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li><li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104.">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).</li><li>Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+diffraction+studies+of+firefly+luciferase+from+Photinus+pyralis.">Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li><li>Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp104,+Hsp70,+and+Hsp40:+a+novel+chaperone+system+that+rescues+previously+aggregated+proteins.">Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins.</a> Cell. 94, 73-82 (1998).</li><li>Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+folding.">Mechanisms of protein folding.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 70-82 (2001).</li><li>Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+in+vivo+of+a+newly+translated+yeast+cytosolic+enzyme+is+mediated+by+the+SSA+class+of+cytosolic+yeast+Hsp70+proteins.">Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).</li><li>Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+binding+in+the+axial+channel+of+Hsp104.+Insights+into+the+mechanism+of+protein+unfolding.">Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding.</a> J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).</li><li>Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+bioluminescence:+a+mechanistic+approach+of+luciferase+catalyzed+reactions.">Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions.</a> IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+systems+biology+of+proteotoxic+stress+in+aging+and+disease.">The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).</li><li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence.">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li><li>Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+functions+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hsp90+chaperone.">In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).</li><li>Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+disaggregation+mediated+by+heat-shock+protein+Hsp104.">Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104.</a> Nature. 372, 475-478 (1994).</li><li>Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+stability+of+recombinant+green+fluorescent+protein+(GFPuv)+at+various+pH+values.">Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).</li><li>Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spectral+Distribution+of+Firefly+Light.">The Spectral Distribution of Firefly Light.</a> J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).</li><li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+disaggregase+machinery:+Hsp110+synergizes+with+Hsp70+and+Hsp40+to+catalyze+protein+disaggregation+and+reactivation+in+a+cell-free+system.">The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system.</a> PLoS One. 6, e26319 (2011).</li><li>Tkach, J. M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocytoplasmic+trafficking+of+the+molecular+chaperone+Hsp104+in+unstressed+and+heat-shocked+cells.">Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells.</a> Traffic. 9, 39-56 (2008).</li><li>Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Hsp70+subfamily,+Ssa,+in+protein+folding+in+yeast+cells,+seen+in+luciferase-transformed+ssa+mutants.">Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants.</a> Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).</li><li>Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+heat+shock+response+and+protein+chaperones:+budding+yeast+(Saccharomyces+cerevisiae)+as+a+model+system.">Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).</li></ol>

इस अनुच्छेद में मॉडल प्रोटीन FFL-GFP के खमीर disaggregase, Hsp104 प्रोटीन पुनः solubilization और मरम्मत के लिए योगदान देता है कि दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. एंजाइमी assays और माइक्रोस्कोपी विभिन्न refolding दक्षता और उपज का निर्ध?...

मनुष्यों में अल्जाइमर, पार्किंसंस और Huntington रोग सहित neurodegenerative विकारों प्रोटीन misfolding और एकत्रीकरण 10 से जोड़ा गया है. कोशिकाओं misfolded निष्क्रिय संरचनाओं 6 में सेलुलर प्रोटीन की गतिज फँसाने को रोकने के लिए आणविक संरक्षिकाओं रोजगार. संरक्षिकाओं कोशिका के भीतर जटिल बातचीत नेटवर्क में भाग लेते हैं, लेकिन यह पूरी तरह से इन संबंधों का योग जीवधारी Proteostasis का योगदान करने के लिए कैसे समझ नहीं है. साइटोसोलिक प्रोटीन तह के बहुमत के लिए जिम्मेदार मुख्य संरक्षक से एक 70 केडी गर्मी झटका प्रोटीन (Hsp70) परिवार के 19 है. यह दिखाया गया है कि Hsp70 घटने के खमीर नुकसान नवजात heterologously व्यक्त FFL गुना करने के लिए और इन विवो 18, 7 में अंतर्जात प्रोटीन, ओर्निथिन transcarbamoylase, refold करने की क्षमता में. लगभग वास्तविक समय संकल्प के साथ तह विश्लेषण करने की क्षमता को समझने की सुविधा होगी कैसे अतिरिक्त सेलुलर कारकों ऑनइस Hsp70 पर निर्भर प्रक्रिया को ribute. इसके अलावा, तह / प्रतिक्रियाओं refolding इन योगदान प्रोटीन पर पूरी तरह से निर्भर नहीं हो सकता, इसलिए assays के कैनेटीक्स और दक्षता में बड़े और छोटे परिवर्तन दोनों का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील होना चाहिए. खमीर सेल disaggregase, Hsp104, एकत्रित misfolded प्रोटीन की मरम्मत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. Hsp104 homologs फफूंद और पौधों में पहचान की गई है, इस परिवार मेटाजोअन में अनुपस्थित होना प्रतीत होता है. यह ऐसी Hsp110 परिवार के उन लोगों के रूप में अन्य संरक्षिकाओं स्तनधारियों 16 में ज्ञात Hsp104 गतिविधियों के कुछ है कि प्रदर्शन को प्रस्तावित किया गया है. Hsp104 एक एएए +, hexameric प्रोटीन जटिल है कि फिर से तैयार प्रोटीन समुच्चय के लिए खमीर में काम करता है, refolding और मरम्मत के 13 में योगदान दे. Hsp70 खमीर, Ssa1, और खमीर Hsp40, Ydj1 साथ Hsp104, खमीर कोशिकाओं 5, 8 में विकृत FFL की वसूली के लिए आवश्यक है. छोटे गर्मी झटका प्रोटीन, Hsp26, भी requi होना दिखाया गया हैFFL 2 की Hsp104 की मध्यस्थता disaggregation के लिए लाल. FFL सब्सट्रेट सक्रिय साइट में luciferin और एटीपी और ऑक्सीजन, decarboxylates की आवश्यकता है कि एक गठनात्मक परिवर्तन के बाद कि बांध एक दो डोमेन प्रोटीन है oxyluciferin, कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ 2), adenosine monophosphate (एएमपी), और प्रकाश 11, रिहा सब्सट्रेट 9, 3. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध FFL सब्सट्रेट, डी luciferin, एक luminometer 15 का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है कि 550-570 एनएम के बीच प्रकाश उत्सर्जन में परिणाम है. FFL खुलासा होने पर रासायनिक या गर्मी उपचार और तेजी से समुच्चय से विकृतीकरण को exquisitely संवेदनशील है. 39-45 के बीच तापमान के संपर्क में डिग्री सेल्सियस FFL reversibly सामने आया और निष्क्रिय 12 है. इसके विपरीत, GFP और उसके डेरिवेटिव तनावों 14 खुलासा प्रोटीन के लिए प्रतिरोधी रहे हैं. इसलिए इन दो प्रोटीनों के विलय कार्यात्मक जी को निशाना बनाने में सक्षम एक प्रयोगात्मक अस्थिर आधा भाग के रूप में कार्य करने के लिए FFL के लिए अनुमति देता हैएफपी आबादी और एकल कक्ष दोनों स्तरों पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कल्पना की जा सकती है कि जमा intracellular लिए. स्वचालित माइक्रोस्कोपी के साथ मिलकर एक अर्द्ध स्वचालित बहुपद्वति प्लेट रीडर में एंजाइमी परख के आवेदन कैनेटीक्स और प्रतिक्रियाओं refolding की उपज की अभूतपूर्व एक साथ मूल्यांकन की अनुमति देता है. इसके अलावा, मॉडल यूकेरियोट Saccharomyces cerevisiae की सतही आणविक आनुवंशिकी सटीक प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण नेटवर्क के हेरफेर और सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया और Proteostasis के लिए योगदान दे उपन्यास खिलाड़ियों की पहचान के लिए खोज आधारित दृष्टिकोण के लिए अवसर दोनों की अनुमति देता है. इस अध्ययन में, FFL-GFP व्यक्त जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) और HSP104 विलोपन उपभेदों प्रोटीन denaturing गर्मी सदमे के अधीन हैं. FFL-GFP refolding एक वसूली समय के पाठ्यक्रम पर व्यक्त proteome के मरम्मत के लिए एक प्रॉक्सी readout के रूप में एक enzymatic परख और माइक्रोस्कोपी दोनों के माध्यम से नजर रखी है. WT कोशिकाओं की तुलना में, हम वें दिखानेई Hsp104 विलोपन तनाव विकृत FFL 2 के पुनर्सक्रियन में Hsp104 के लिए एक भूमिका की स्थापना पिछले निष्कर्ष का समर्थन, FFL-GFP refolding पर ~ 60% कम कुशल है.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Synergy MX Microplate Reader</td>
 <td>BioTek</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope</td>
 <td>Olympus, Tokyo Japan</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lumitrac 200 white 96-well plates</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SlideBook 5.0 digital microscopy software</td>
 <td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP152-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(LiAc) Lithium Acetate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L6883</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG (polyethelene glycol)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP233-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP120-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Malinckrodt</td>
 <td>4948</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1300-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC-URA</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1306-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cycloheximide</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>357420050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-luciferin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L9504</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>low melt agarose</td>
 <td>NuSieve</td>
 <td>50082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>immersion oil</td>
 <td>Cargille</td>
 <td>16484</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

coupled assays for monitoring protein refolding in saccharomyces cerevisiae

प्रोटीन तह / जीवजनन के संयुक्त प्रक्रियाओं के रूप में परिभाषित Proteostasis, refolding / मरम्मत, और गिरावट, हानिकारक परिणाम 1 से बचने के लिए बनाए रखा जाना चाहिए कि एक नाजुक सेलुलर संतुलन है. इस संतुलन को बाधित कि बाहरी या आंतरिक कारकों प्रोटीन एकत्रीकरण, विषाक्तता और कोशिका मृत्यु के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. मनुष्यों में इस तरह के हटिंगटन है, पार्किंसंस और अल्जाइमर रोग के रूप में 10 neurodegenerative विकारों के साथ जुड़े लक्षण के लिए एक प्रमुख योगदान कारक है. यह Proteostasis के रखरखाव में शामिल प्रोटीन इन गंभीर बीमारियों के लिए उपचार विकसित करने के लिए पहचान की जानी है कि इसलिए जरूरी है. यह लेख हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (FFL GFP) के लिए जुड़े हुए मॉडल प्रोटीन जुगनू luciferase का उपयोग कर लगभग वास्तविक समय प्रस्ताव पर विवो प्रोटीन तह में निगरानी के लिए तकनीक का वर्णन करता है. FFL के आधा भाग तनाव प्रेरित मीटर के प्रति बेहद संवेदनशील है के रूप में FFL-GFP का एक अनूठा मॉडल कैमेरिक प्रोटीन हैएंजाइम 12 inactivates जो isfolding और एकत्रीकरण,. Luciferase गतिविधि एक enzymatic परख उपयोग पर नजर रखी, और GFP आधा भाग स्वचालित माइक्रोस्कोपी का उपयोग घुलनशील या एकत्रित FFL दृश्यमान करने का एक तरीका प्रदान करता है. मिलकर इन तरीकों refolding और तनाव के बाद एक एंजाइम की कार्यात्मक पुनर्सक्रियन दोनों का विश्लेषण करने के लिए दो समानांतर और तकनीकी रूप से स्वतंत्र दृष्टिकोण को शामिल. गतिविधि वसूली सीधे बेहतर ऐसे प्रोटीन संरक्षक के रूप में प्रोटीन की गुणवत्ता नियंत्रण कारकों इन कार्यों को करने के लिए सहयोग समझने के लिए कैसे disaggregation और फिर solubilization के कैनेटीक्स के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है. इसके अलावा, जीन विलोपन या परिवर्तन इस प्रक्रिया के लिए विशिष्ट प्रोटीन या प्रोटीन के योगदान का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस लेख में हम इस दृष्टिकोण को मान्य करने के लिए प्रोटीन refolding करने, प्रणाली 5 refolding Hsp40/70/nucleotide विनिमय कारक (एनईएफ) के साथ भागीदार के लिए जाना जाता प्रोटीन disaggregase Hsp104 13 के योगदान की जांच.

खमीर disaggregase पर निर्भर है, Hsp104 कुशलतापूर्वक गर्मी विकृत प्रोटीन refold लिए. FFL-GFP की गतिविधि एक luminescence फ्लैश परख चित्रा 1 का उपयोग कर, एक 25 मिनट गर्मी के झटके के बाद नजर रखी थी. चित्रा 2 में दिखाया गया है तो ?...

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Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

इस लेख की जांच के लिए एक जुगनू luciferase-GFP संलयन प्रोटीन के उपयोग का वर्णन<em&gt; Vivo में</emमें&gt; प्रोटीन तह<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. एक मॉडल गर्मी विकृत प्रोटीन की refolding, इस अभिकर्मक का उपयोग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और प्रोटीन की गुणवत्ता नियंत्रण में Proteostasis नेटवर्क घटकों की भूमिका की जांच के लिए एक enzymatic परख द्वारा एक साथ नजर रखी जा सकती है.

में निगरानी प्रोटीन refolding के लिए युग्मित Assays<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

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