Name: coupled assays for monitoring protein refolding in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2013-07-09T12:00:00
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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da National Institutes of Health (NIGMS-074696) para KAM e uma Sociedade Americana de Microbiologia Robert D. Watkins Graduate Student Fellowship de Pesquisa de JLA Agradecemos também John Glover, da Universidade de Toronto para a prestação do FFL -GFP plasmídeo fonte.

1. Construção de variantes que contêm FFL-GFP plasmídeo Para este estudo, Saccharomyces cerevisiae BY4741 tensão (MAT a, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) foi utilizado juntamente com uma cepa de exclusão Hsp104 da coleção nocaute levedura (Abrir Biosystems / Thermo Scientific). A deleção foi confirmado utilizando um anticorpo específico de Hsp104 para análise de Western blot. FFL-GFP foi expresso a partir ...

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	<li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adapting+proteostasis+for+disease+intervention.">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li><li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104.">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).</li><li>Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+diffraction+studies+of+firefly+luciferase+from+Photinus+pyralis.">Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li><li>Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp104,+Hsp70,+and+Hsp40:+a+novel+chaperone+system+that+rescues+previously+aggregated+proteins.">Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins.</a> Cell. 94, 73-82 (1998).</li><li>Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+folding.">Mechanisms of protein folding.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 70-82 (2001).</li><li>Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+in+vivo+of+a+newly+translated+yeast+cytosolic+enzyme+is+mediated+by+the+SSA+class+of+cytosolic+yeast+Hsp70+proteins.">Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).</li><li>Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+binding+in+the+axial+channel+of+Hsp104.+Insights+into+the+mechanism+of+protein+unfolding.">Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding.</a> J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).</li><li>Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+bioluminescence:+a+mechanistic+approach+of+luciferase+catalyzed+reactions.">Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions.</a> IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+systems+biology+of+proteotoxic+stress+in+aging+and+disease.">The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).</li><li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence.">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li><li>Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+functions+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hsp90+chaperone.">In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).</li><li>Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+disaggregation+mediated+by+heat-shock+protein+Hsp104.">Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104.</a> Nature. 372, 475-478 (1994).</li><li>Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+stability+of+recombinant+green+fluorescent+protein+(GFPuv)+at+various+pH+values.">Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).</li><li>Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spectral+Distribution+of+Firefly+Light.">The Spectral Distribution of Firefly Light.</a> J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).</li><li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+disaggregase+machinery:+Hsp110+synergizes+with+Hsp70+and+Hsp40+to+catalyze+protein+disaggregation+and+reactivation+in+a+cell-free+system.">The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system.</a> PLoS One. 6, e26319 (2011).</li><li>Tkach, J. M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocytoplasmic+trafficking+of+the+molecular+chaperone+Hsp104+in+unstressed+and+heat-shocked+cells.">Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells.</a> Traffic. 9, 39-56 (2008).</li><li>Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Hsp70+subfamily,+Ssa,+in+protein+folding+in+yeast+cells,+seen+in+luciferase-transformed+ssa+mutants.">Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants.</a> Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).</li><li>Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+heat+shock+response+and+protein+chaperones:+budding+yeast+(Saccharomyces+cerevisiae)+as+a+model+system.">Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).</li></ol>

Neste artigo, a proteína modelo FFL-GFP foi usado para mostrar que o disaggregase levedura, a proteína Hsp104 contribui para a re-solubilização e reparação. Os ensaios enzimáticos e microscopia diferencialmente interrogado o estado da mesma proteína substrato para determinar a eficiência de redobragem e rendimento. Os resultados dos ensaios enzimáticos sugerem que a recuperação não é só a recuperação máxima na estirpe mutante hsp104D ineficiente, mas o valor inicial da tensão de desdobramento...

Nos seres humanos, incluindo distúrbios neurodegenerativos doença de Alzheimer e de Parkinson, e doença de Huntington tem sido associada ao enrolamento incorrecto e agregação das proteínas 10. Células empregar chaperones moleculares para evitar armadilhas cinética de proteínas celulares em estruturas inativas deformadas 6. As chaperonas participar em redes de interacção intrincados dentro da célula, mas não está completamente compreendido como a soma destas interacções contribui para Proteostase organismos. Uma das principais chaperonas responsáveis ​​pela maioria da dobragem de proteína citosólica é a 70 kD da proteína de choque térmico (Hsp 70) 19 família. Tem sido demonstrado que a perda de levedura de Hsp70 diminui a capacidade de dobrar nascente FFL heterologamente expressos e redobrar a proteína endógena, ornitina transcarbamilase, in vivo, 18, ​​7. A capacidade de analisar dobrável com resolução de tempo quase real irá facilitar a compreensão de como fatores de celular cont adicionalribute para este processo de Hsp70-dependente. Além disso, dobrando / redobrando reações podem não ser completamente dependente destas proteínas contribuem, de modo ensaios deve ser sensível o suficiente para detectar pequenas e grandes mudanças na cinética e eficiência. O disaggregase célula de levedura, Hsp104, desempenha um papel vital na reparação de proteínas deformadas agregados. Embora Hsp104 homólogos foram identificados em fungos e plantas, esta família parece estar ausente no metazoários. Tem sido proposto que outras chaperonas como os da família Hsp110 executar algumas das actividades conhecidas Hsp104 em mamíferos 16. Hsp104 é um +, complexo de proteínas hexamérica AAA que funciona em levedura para agregados de proteína remodelar, contribuindo para refolding e reparação 13. Hsp104, juntamente com a levedura de Hsp70, SSA1, ea levedura Hsp40, Ydj1, é necessária para a recuperação de FFL desnaturado em células de levedura 5, 8. A pequena proteína de choque térmico, Hsp26, também tem sido demonstrado ser requivermelho para a desagregação Hsp104 mediada por FFL 2. FFL é uma proteína de duas domínio que se liga ao substrato luciferina no local activo e sequência de uma alteração conformacional que requer ATP e de oxigénio, o substrato libertando decarboxylates oxiluciferina, o dióxido de carbono (CO 2), monofosfato de adenosina (AMP), e luz 11, 9, 3. O substrato comercialmente disponível FFL, D-luciferina, resulta em emissão de luz entre 550-570 nm, que podem ser detectadas usando um luminómetro 15. FFL é extremamente sensível à desnaturação de tratamentos e agregados rapidamente químicas ou calor em cima de desdobramento. Quando exposto a temperaturas entre 39-45 ° C FFL é reversível desdobrado e inativada 12. Em contraste, a GFP e seus derivados são altamente resistentes à proteína desdobramento tensões 14. Portanto fusão destas duas proteínas permite FFL para funcionar como uma unidade experimentalmente lábil capaz de atingir funcional LPF para depósitos intracelulares que podem ser visualizados por microscopia de fluorescência, tanto a população e os níveis de células individuais. Aplicação do ensaio enzimático num leitor de placas multimodo semi-automatizada juntamente com microscopia automatizada permite a avaliação simultânea sem precedentes de cinética e rendimento de reacções de redobramento. Além disso, a genética molecular fácil do modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae permite tanto a manipulação precisa da rede de controlo de qualidade de proteínas e a oportunidade para que as abordagens baseadas em descoberta para identificar novos jogadores contribuem para a resposta ao stress celular e Proteostase. Neste estudo, os de tipo selvagem (WT) e Hsp104 supressão estirpes que expressam FFL-GFP estão sujeitas a desnaturação da proteína de choque térmico. FFL-GFP refolding é monitorado através de um ensaio de enzimática e microscopia como uma leitura proxy para reparação do proteoma expresso ao longo de um curso de tempo de recuperação. Quando comparadas com as células WT, vamos mostrar ºe Hsp104 tensão eliminação é de aproximadamente 60% ​​menos eficiente na redobrando FFL-GFP, apoiando resultados anteriores estabelecer um papel para Hsp104 na reativação da desnaturado FFL 2.

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 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Synergy MX Microplate Reader</td>
 <td>BioTek</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope</td>
 <td>Olympus, Tokyo Japan</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lumitrac 200 white 96-well plates</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SlideBook 5.0 digital microscopy software</td>
 <td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP152-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(LiAc) Lithium Acetate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L6883</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG (polyethelene glycol)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP233-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP120-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Malinckrodt</td>
 <td>4948</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1300-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC-URA</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1306-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cycloheximide</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>357420050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-luciferin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L9504</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>low melt agarose</td>
 <td>NuSieve</td>
 <td>50082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>immersion oil</td>
 <td>Cargille</td>
 <td>16484</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

coupled assays for monitoring protein refolding in saccharomyces cerevisiae

Proteostase, definidos como os processos combinados de proteína de dobragem / biogénese, redobragem / reparação e degradação, é um equilíbrio celular delicada que deve ser mantida para evitar consequências deletérias 1. Fatores externos ou internos que perturbam esse equilíbrio pode levar a agregação de proteínas, toxicidade e morte celular. Nos humanos este é um factor que contribui para os sintomas associados com doenças neurodegenerativas, tais como a doença de Huntington, doença de Parkinson, e doença de Alzheimer 10. Por conseguinte, é essencial que as proteínas envolvidas na manutenção da Proteostase ser identificados a fim de desenvolver tratamentos para estas doenças debilitantes. Este artigo descreve as técnicas para monitoramento de enovelamento de proteínas vivo na resolução de tempo quase real, utilizando o modelo de proteína firefly luciferase fundida a proteína verde fluorescente (GFP-FFL). FFL-GFP é um modelo de proteína quimérica única como o radical FFL é extremamente sensível ao stress induzido misfolding e agregação, que inactiva a enzima 12. A actividade da luciferase é monitorizada usando um ensaio enzimático, e a porção da GFP fornece um método de visualização FFL solúvel ou agregado usando microscopia automatizado. Estes métodos juntamente incorporar duas abordagens paralelas e tecnicamente independente para analisar tanto refolding e reativação funcional de uma enzima após o estresse. Recuperação da atividade pode ser diretamente correlacionada com a cinética de desagregação e re-solubilização para entender melhor como fatores de controle de qualidade de proteína, como chaperones proteína colaborar para executar essas funções. Além disso, as deleções ou mutações de genes podem ser usadas para testar as contribuições de proteínas específicas ou subunidades proteicas para este processo. Neste artigo, vamos examinar as contribuições da proteína disaggregase Hsp104 13, conhecida com a parceria com o fator de troca Hsp40/70/nucleotide (NEF) redobrando sistema 5, a proteína refolding para validar esta abordagem.

A levedura é dependente da disaggregase, Hsp104 redobrar eficientemente proteínas desnaturadas pelo calor. A atividade de FFL-GFP foi monitorado após um choque de 25 min de calor, através de um ensaio de flash luminescência Figura 1. Os resultados deste ensaio automático mostrado na Figura 2 revelou um aumento progressivo na actividade ao longo de 90 min, que levou a uma recuperação de&gt; 80% em células WT. A tensão hsp104Δ recuperou 19% da atividade original em rel...

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Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Este artigo descreve o uso de uma luciferase de pirilampo-GFP proteína de fusão para investigar<em&gt; In vivo</em&gt; Dobramento de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Usando estes reagentes, redobrando de um modelo de proteína desnaturada pelo calor pode ser monitorizada por microscopia de fluorescência em simultâneo e um ensaio enzimático para sondar as funções dos componentes da rede Proteostase no controlo de qualidade de proteínas.

Ensaios para Monitoramento juntamente redobramento de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

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