Name: a caenorhabditis elegans model system for amylopathy study
Uploaded: 2013-05-17T13:00:00
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<p class="jove_content"&gt;私たちは、原稿の重要な読書のための博士双劉に感謝します。 PCL12コンストラクトは、ギフト用のフォーム博士クリストファーD.リンクだった。この作品は、2つの国立科学財団の助成金（0842708および1026958）とFSにAHA助成（09GRNT2250529）によってサポートされていました。</p

1。トランスジェニックワームの構築<ol><li>変換。 <ol><li>インジェクションパッドを準備します。ガラスカバースリップ上に、水に溶解し、ホット、2％アガロースのドロップを置きます。素早く降下に第二カバースリップを置き、軽くそれをタップします。アガロースが固化した後、離れてカバースリップをスライドさせて、80℃の真空オーブン中でカバースリップパッドを焼く°CO / N. </li><...

<ol>
	<li>Hardy, J., Allsop, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+deposition+as+the+central+event+in+the+aetiology+of+Alzheimer's+disease.">Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).</li><li>Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lewy+body+pathology+in+Alzheimer's+disease.">Lewy body pathology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).</li><li>Greenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+myositis:+review+of+recent+literature.">Inclusion body myositis: review of recent literature.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).</li><li>Revesz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporadic+and+familial+cerebral+amyloid+angiopathies.">Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies.</a> Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).</li><li>Hartmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+sites+of+intracellular+production+for+Alzheimer's+disease+A+beta40/42+amyloid+peptides.">Distinct sites of intracellular production for Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides.</a> Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).</li><li>Ohnishi, S., Takano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibrils+from+the+viewpoint+of+protein+folding.">Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding.</a> Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).</li><li>DL, R. i. d. d. l. e., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+II.">C. elegans II.</a> Cold Spring Harbor Monograph. 1, 1222 (1997).</li><li>Cotella, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+role+of+k++channel+oxidation+in+Mammalian+brain.">Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain.</a> The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).</li><li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans.">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).</li><li>Cai, S. Q., Sesti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+a+potassium+channel+causes+progressive+sensory+function+loss+during+aging.">Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).</li><li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons:+a+new+family+of+chemosensory+receptors.">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).</li><li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans.">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).</li><li>Caserta, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q-VD-OPh,+a+broad+spectrum+caspase+inhibitor+with+potent+antiapoptotic+properties.">Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties.</a> Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).</li><li>Christensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells.">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).</li></ol>

ここでは、Cを使用amylopathiesの細胞および分子の側面を研究するために、複合的なアプローチを説明しますエレガンス 。このアプローチの利点は次のとおり。1）低コストの線虫を室温で、細菌を接種し、通常のペトリ皿に保持される。 2）強力な遺伝学。トランスジェニック動物は、数ヶ月で得られたプロモーター配列の広い配列は、特定のニューロンにおける所望の遺?...

アミロイドベータ（Aβ）βおよびγセクレターゼ1によるアミロイド前駆体タンパク質（APP）の連続的切断後に形成される36-43アミノ酸のペプチドである。 γセクレターゼは、AβペプチドのC末端を処理し、その変数の長さ5を担当する。 Aβの最も一般的な形態は、Aβ40とAβ42、より一般的なAD 5などの病態に関連している後者である。アミロイド線維6を形成するために集約すること、高濃度Aβフォームβシートで。線維預金は、ニューロンを取り巻く老人斑の主成分である。両方斑および拡散性、非プラークAβオリゴマーは、Aβの基礎となる病原形を構成すると考えられている。 神経amylopathiesの実験室での研究は、時間とともにこれらの条件が進歩という事実によって複雑になる。したがって、それはimportanですがマウス、短い寿命に遺伝的に扱いやすい動物モデル相補的開発するT。これらのモデルはamylopathies通常は細胞および分子とそのシンプルさのおかげでの特定の側面を解明するために使用することができ、問題の本質をキャプチャするために役立ちます。ワーム線虫（Caenorhabditis elegans）の滝がこのカテゴリです。それは短い寿命を持っている、〜20日と加えて、遺伝子発現、タンパク質輸送、神経接続、シナプス形成、細胞シグナリング、および死の調節など、基本的な細胞プロセスは、哺乳類7に似ています。ワームのユニークな特徴は、強力な遺伝学と独立して血管損傷の神経損傷を勉強できるように血管系の欠如が含まれています。一方、脳の欠如は、Cの使用を制限する神経変性の多くの側面を研究する虫 。また、病変の解剖学的分布の再現性と識別は、この生物において行うことができない。その他の制限管理ポイントは、遺伝子発現プロファイルおよび複雑な挙動とメモリ機能障害の違い両方を評価する難しさが挙げられる。ここでは、Cを生成する方法を説明amylopathiesのエレガンスモデル 。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>1. NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J637</td>
			<td>17 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-peptone</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J636</td>
			<td>2.5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bring to 975 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>1 ml of 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>1 ml of 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3045</td>
			<td>1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>25 ml of 1M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>2. Potassium phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>108.3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td>35.6 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bring to 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>3. M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>1 ml of 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bring to 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>118 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td>48 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4880</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bring to 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>5. CM-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 culture medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11415</td>
			<td>450 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>50 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>50 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>6. Other Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon 700 oil</td>
			<td>Halocarbon Products</td>
			<td>9002-83-9</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &mu;m Acrodisc Syringe Filter</td>
			<td>PALL Co.</td>
			<td>4199</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6137-5UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin (peanut)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S320</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>425044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a caenorhabditis elegans model system for amylopathy study

Amylopathyは時間とともに組織におけるアミロイドβ（Aβ）の異常合成と蓄積を説明する用語です。 Aβは、アルツハイマー病（AD）の特徴であり、レヴィー小体認知症、封入体筋炎および脳アミロイド血管症1-4に見出される。 Amylopathiesは徐々に時間を使って開発。このような理由から短い寿命を持つ単純な生物は、これらの条件の分子の側面を解明するのに役立つ可能性があります。ここでは、ワームの線虫（Caenorhabditis elegans）を用いたAβ媒介神経変性を研究するための実験プロトコルを記述します。したがって、私たちは大人雌雄同体の生殖器合胞体にコードするDNA人間Aβ42を注入することにより、トランスジェニックワームを構築する。形質転換線は突然変異誘発によって誘発される積分によって安定化される。線虫は、それらの卵を採取し、播種によって同期化時代である。 Aβ42を表現するニューロンの機能が（適当な行動アッセイで試験される走化性アッセイ秒）。胚から得られた一次ニューロン培養は、行動データを補完し、抗アポトーシス性化合物の神経保護効果を試験するために使用される。

我々のプロトコルでは、我々は神経機能8に人間Aβ42オリゴマーの影響を研究。フラグメントをコードするヒトAβ42および火災ベクトルpPD50.52の人工シグナルペプチドコード配列は、末端にSmaIで1制限エンドヌクレアーゼ部位を導入したプライマーを用いて構築PCL12 9から増幅した。断片をSmaIで一意1部位10との間pPD95.75火災ベクトルで2,481 bpのFLP-6プ?...

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A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

私たちは、ワームでamylopathiesの側面を研究するための方法を説明<em&gt; C.エレガンス</em&gt;。我々は人間のAβを発現しているワームを構築する方法を示し<sub&gt; 42</sub&gt;ニューロンにおいて、どのように行動アッセイにおけるそれらの機能をテストします。私たちは、さらに薬理試験のために使用することができ、一次ニューロン培養を取得する方法を示しています。

A<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</emAmylopathyの研究のための&gt;モデルシステム

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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