Name: a caenorhabditis elegans model system for amylopathy study
Uploaded: 2013-05-17T13:00:00
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<p class="jove_content"&gt; Agradecemos ao Dr. Shuang Liu para a leitura crítica do manuscrito. A construção PCL12 foi um presente formulário Dr. Christopher D. ligação. Este trabalho foi apoiado por dois subsídios National Science Foundation (0842708 e 1026958) e uma subvenção AHA (09GRNT2250529) para FS.</p

1. Construção de Worms transgênicos <ol><li> Transformação. <ol><li> Prepare pastilhas de injeção. Colocar uma gota de água quente, de agarose 2% dissolvido em água, sobre uma lamela de vidro. Colocar rapidamente de uma segunda lamela sobre a queda e leve toque nele. Após a agarose é solidificado, lamelas deslizantes afastados, e cozer a lamela direccional num forno de vácuo a 80 ° CO / N. </li><li> Puxe pipetas. Nós usamos um Sutter P-97 extrator para puxar 1/0.5 mm OD / ID borosilicato capilares com fi...

<ol>
	<li>Hardy, J., Allsop, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+deposition+as+the+central+event+in+the+aetiology+of+Alzheimer's+disease.">Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).</li><li>Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lewy+body+pathology+in+Alzheimer's+disease.">Lewy body pathology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).</li><li>Greenberg, S. 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Aqui nós descrevemos uma abordagem combinada, para estudar aspectos celulares e moleculares da amylopathies usando C. elegans. As vantagens dessa abordagem incluem: 1.) De baixo custo C.elegans é mantido no prato normal de Petri semeadas com bactérias, à temperatura ambiente. 2) genética poderosas. Os animais transgénicos podem ser obtidos em alguns meses, e uma grande variedade de sequências de promotor está disponível para conduzir a expressão do gene desejado em neurónios específicos. 3)...

Beta amilóide (Ap) é um péptido de 36-43 aminoácidos que é formada após a clivagem sequencial da proteína precursora de amilóide (APP) por β e γ secretases 1. A secretase γ processa a extremidade C-terminal do péptido Aíi e é responsável pelos seus comprimentos variáveis ​​5. As formas mais comuns de Ap são Ap 40 e Ap 42, sendo o último mais comum associado a condições patológicas tais como a AD 5. Em altas concentrações ABeta forma β-folhas que agregam para formar fibrilas amilóides 6. Depósitos de fibrilas são o principal componente das placas senis que cercam os neurônios. Ambas as placas e difusíveis, oligómeros de Ap não-placa, são pensados ​​para constituir as formas de Ap patogénicos subjacentes. Estudo de laboratório de amylopathies neuronais é complicada pelo facto de estas condições o progresso ao longo do tempo. Portanto, é important para o desenvolvimento de animais geneticamente tratável modelos complementares para camundongos com vida curta. Estes modelos podem ser utilizados para elucidar os aspectos específicos de amylopathies-tipicamente celular e molecular, e em virtude da sua simplicidade, para ajudar a captar a essência do problema. O verme Caenorhabditis elegans quedas está nesta categoria. Ele tem uma vida curta, ~ 20 dias e, além disso processos celulares básicos, incluindo a regulação da expressão do gene, o tráfico de proteína, a conectividade neuronal, sinaptogênese, sinalização celular e morte são semelhantes aos dos mamíferos 7. As características únicas do worm incluem genética poderosos ea falta de um sistema de vasos, o que permite estudar dano neuronal independentemente de dano vascular. Por outro lado, a falta de um cérebro limita a utilização de C. elegans para estudar vários aspectos da neurodegeneração. Além disso, a reprodução e a identificação das distribuições anatómicas de lesões não pode ser executada neste organismo. Outro limiteções incluem a dificuldade para avaliar tanto as diferenças nos perfis de expressão gênica e comprometimento do comportamento complexo e função de memória. Aqui descrevemos métodos para gerar C. modelos elegans de amylopathies.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>1. NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J637</td>
			<td>17 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-peptone</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J636</td>
			<td>2.5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bring to 975 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>1 ml of 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>1 ml of 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3045</td>
			<td>1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>25 ml of 1M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>2. Potassium phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>108.3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td>35.6 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bring to 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>3. M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>1 ml of 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bring to 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>118 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td>48 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4880</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bring to 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>5. CM-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 culture medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11415</td>
			<td>450 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>50 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>50 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>6. Other Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon 700 oil</td>
			<td>Halocarbon Products</td>
			<td>9002-83-9</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &mu;m Acrodisc Syringe Filter</td>
			<td>PALL Co.</td>
			<td>4199</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6137-5UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin (peanut)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S320</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>425044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a caenorhabditis elegans model system for amylopathy study

Amylopathy é um termo que descreve a síntese e a acumulação anormal de beta-amilóide (Ap) em tecidos com o tempo. Ab é uma característica da doença de Alzheimer (AD) e é encontrado na demência com corpos de Lewy, a inclusão miosite corpo e angiopatia amilóide cerebral 1-4. Amylopathies desenvolver progressivamente com o tempo. Por esta razão, os organismos simples com tempos de vida curtos podem ajudar a elucidar os aspectos moleculares destas condições. Aqui, descrevemos os protocolos experimentais para estudar a neurodegeneração Aâ mediada através do verme Caenorhabditis elegans. Assim, construímos vermes transgênicos, injetando DNA humano codificação ABeta 42 para as gônadas de hermafroditas sincicial adultos. Linhas de transformantes são estabilizados por uma integração induzida por mutagénese. Nemátodes são sincronizados idade recolhendo e semeando os seus ovos. A função de neurónios que expressam Ap 42 é testada em ensaios comportamentais oportunos (ensaio de quimiotaxias). Culturas neuronais primárias obtidas a partir de embriões são usados ​​para complementar os dados de comportamento e para testar os efeitos neuroprotectores dos compostos anti-apoptóticos.

Com os nossos protocolos nós estudamos os efeitos do humano ABeta 42 oligômero na função neuronal 8. Um fragmento de codificação ABeta humano 42 eo sinal peptídeo sequência codificante artificial de Fogo vetor pPD50.52 foi amplificado a partir construção PCL12 9 usando primers que introduziram um Sma uma restrição local endonuclease nas extremidades. O fragmento foi então inserido em uma construção contendo um flp-6 sequência do promotor 2481 pb no vec...

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A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Nós descrevemos métodos para estudar aspectos da amylopathies do verme<em&gt; C. elegans</em&gt;. Mostramos como construir vermes expressando ABeta humano<sub&gt; 42</sub&gt; Em neurônios e como testar sua função em ensaios comportamentais. Temos ainda mostram como obter culturas neuronais primárias que podem ser utilizadas para testes farmacológicos.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para Estudo Amylopathy

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