Name: a chemical screening procedure for glucocorticoid signaling with a zebrafish larva luciferase reporter system
Uploaded: 2013-09-10T13:30:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System at JoVE.com

Мы благодарим С. Burkhart, К. Гофман и Симона Gräßle за отличную техническую помощь и благодарны М. FERG за помощь в анализе данных. Мы также благодарим С. Растегар за критические замечания по рукописи. Мы признаем, финансирование со стороны Studienstiftung де Deutschen Volkes (в МВт), DFG (DI913/4-1) и BioInterfaces Гельмгольца по программе в KIT.

1. Подготовьте рабочее разведение химической библиотеки Предварительно разведите соединений библиотеке испытуемого лекарственного средства (например, FDA утвержденных препаратов, Энцо науки о жизни) в Е3 (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl 2) с роботизированной наливных станции (например Multiprobe II, 8 игл с наконечник утилизации адаптер, PerkinElmer). Подходящие концентрации являются, например, 40 мкг / мл в 3% ДМСО, но это будет зависеть от типа используемой библиотеки. Параметры Multiprobe II, соответствующие этапам, описанным ниже, указаны в таблице 1. Протокол, описанный в таблице позволяет получать четыре аликвотных пластин параллельно. <ol><li> Внесите 10 мкл аликвоты фондовом библиотеки (2 мг / мл в ДМСО) в глубокие тарелки также (например 96-луночный планшет для хранения, Круглый Ну, 0,8 мл ABgene). Колонки 1 и 12 должна быть пустой - они будут получать положительные и отрицательные внутри-пластины управления. </li><l<html> я&gt; Внесите 490 мкл E3 с 1% ДМСО в приготовленных аликвотам библиотеке с Multiprobe II. Разведение выполняется с фиксированными иглами без свалок. </li><li> Добавить 10 мкл ДМСО в колонну 1 и 10 мкл раствора 5 мМ дексаметазона (в ДМСО) в колонке 12 как внутри-пластины управления. Концентрация ДМСО во всех лунках теперь 3%, концентрация дексаметазона в положительных контрольных лунок 100 мкм E3 / 3% ДМСО. </li><li> Уплотнение тарелку с ДМСО водостойким клеем уплотнительных листов. не хранить пластин при -80 ° С до использования. </li></ol> 2. Разведение Reporter рыбы Сбор эмбрионов из естественного нереста групповых вязки между GRE: Люк трансгенных рыб. Поднимите эмбрионов (не более 60) в 9 см чашки Петри, содержащие E3 среду не дополненную 1 мг / мл фунгицида метиленового синего до 4 дней после оплодотворения (DPF) в инкубаторе при 28 ° С Изменение E3 среды регулярно. Название &quot;&gt; 3. Подготовка люциферазы Medium (E3L) Приготовить водный люциферин исходного раствора 50 мМ добавлением дН 2 O во флакон, содержащий люциферин порошок. Этот исходный раствор может храниться при -80 ° С в течение нескольких месяцев. Развести люциферин запас в E3 среде до конечной концентрации 0,5 мМ, чтобы получить E3L среды. 4. Распределить Личинки в 96-луночных планшетах <ol><li> Подготовить 1 мл пипеток с широким отверстием, отрезав примерно 5 мм, кончик и кратко пылающий острые края. </li><li> Бассейн личинки из нескольких крестов, осторожно лить их из чашек Петри в стакан. Урожай около 50 личинок в то время, осторожно наливая их на сито (размер пор диаметром 0,25 мм) и сразу же поместить сито в небольшую чашку Петри (диаметр 5,5 см), заполненной E3L среды. </li><li> С широким наконечником отверстие пипетки, передача 225 мкл среды, содержащие одну личинку каждый в лунки белый96-луночный планшет (Optiplate, PerkinElmer). </li><li> Уплотнение пластин с клей уплотнительных листов (например, Topseal-A, PerkinElmer) и инкубируют их при 28 ° С в течение ночи. Это инкубация предотвращает запись переходных изменений в биолюминесценции сразу после того люциферина, явление, которое происходит также в культивируемых клетках 19. </li></ol> 5. Фармакотерапия <ol><li> Снимите пластину, содержащую готового раствора библиотеки от -80 ° C морозильник около 4 ч перед использованием. Аккуратно вихрь пластины и кратко вращать его в центрифуге для сбора жидкости в нижней части пластины. </li><li> Удалить клейкие уплотнительные листы от личинок пластин. </li><li> С ручным 96-канальной пипетки устройства (например, Ликвидатор, Steinbrenner) пипетки лекарственного раствора вверх и вниз 3 раза. Тогда аликвоту 25 мкл готового раствора химического библиотеки в лунки, содержащие личинки (с приведенном выше примере, этоприводит к конечной концентрации 4 мкг / мл в E3 с 0,3% ДМСО). Подготовка 10 (не менее 5) реплики пластины с личинок на библиотеки пластины. </li><li> Уплотнение тарелки с клеем уплотнительных листов и маркировать каждую тарелку с штрих-наклейке. </li></ol> 6. Свечение Запись <ol><li> Положите пластины, содержащие личинки в укладки единиц в Envision биолюминесценции читателя с повышенной чувствительностью люминесценции (PerkinElmer). Вместо этого можно использовать роботизированный систему инкубатора например занятых для млекопитающих скрининга системах клеточных культур в сочетании с читателем. </li><li> Запись биолюминесценции в течение двух дней с помощью настроек чтения, аналогичные описанным в таблице 2 для читателя представить себе. Адаптация количество аналитических повторов с числом пластин в перспективе, чтобы соответствовать требуемой бега время. </li><li> После конце прогона, проверьте пластины на наличие погибших личинок, чтобы оценить общее токсичность компounds. </li></ol> 7. Анализ данных Весь анализ данных выполняется в статистической среды программирования R с помощью пользовательских сценариев. <ol><li> AUC расчет В целях выявления соединений активирующие GC сигнализации независимо от их кинетических свойств, определения площади под кривой (AUC) записанных люминесценции следов (биолюминесценции исходных импульсов в зависимости от времени) в качестве параметра экранирования. AUCs аппроксимируются с трапеций (см. 2а и А &#39;). </li><li> Нормализация Вход преобразовать АУК, чтобы обеспечить более высокую нормальность данных (фиг. 2b и B &#39;). Тогда нормализовать журнала превращается АУК для каждой библиотеки пластины с надежной метода Z-счет (см. 20). Такая нормализация приводит значений, представляющих количество стандартных отклонений от медианы всех точек данных. Таким образом,систематические ошибки, такие как изменчивость между выполнения, будут удалены из данных. Данные теперь могут быть визуализированы откладывая среднюю надежную Z-балл реплик для каждой скважины (рис. 2в и с &#39;). </li><li> Метрики качества <ol><li> Тепловая карта Для того чтобы визуализировать пластины эффектов, связанных, построить данные для каждой пластины как Тепловая карта, используя, например, функции heatmap.2 от gplot пакета 21. Таким образом, краевые эффекты или соединение переноса могут быть легко обнаружены (сравните, например, с рис. 3а 3b). Исключить неоптимальные пластины из дальнейшего анализа. </li><li> РПЦ кривая Чтобы определить чувствительность и специфичность анализа, расчета приемника, работающего характерный (ROC) кривая, например, с помощью Bioconductor пакета РПЦ 22, используя значения Z-оценка определяется в 7,2 (рис. 3в). Впоследствии определить AUC этого у.е.RvE. AUC значение близко к 1 указывает на высокую чувствительность и специфичность анализа. </li></ol></li><li> Хитов Идентификация Для оптимизации порогового значения для идентификации активных соединений, определить индекс Youden. Для расчета индекса, вычесть расчетную истинную положительные темпы (TPR) от ложных срабатываний (РСП) кривой ROC для повышения надежные Z-оценка пороговых значений. Возьмите надежную Z-счет с наивысшим коэффициентом Youden (TPR минус РСП) в качестве точки отсечки. TPR / FPR можно оценить путем определения положительных контрольных лунок или известных активных соединений в библиотеке. При использовании положительного контроля скважин убедитесь, что они совпадают ожидаемого прочность хит. </li></ol> 8. Повторное проведение <ol><li> Пересмотреть положительные хит соединений путем обработки личинок с серийных разведений соединений, полученных от другого поставщика, используя ту же запись настройки, описанного выше. Правда хиты должны побудить люминесценции ALSO в этом анализе, в идеале в зависимости от дозы. </li></ol>

<ol>
	<li>Norris, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vertebrate Endocrinology. , (2007).</li><li>Kassel, O., Herrlich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+glucocorticoid+receptor+and+other+transcription+factors:+molecular+aspects.">Crosstalk between the glucocorticoid receptor and other transcription factors: molecular aspects.</a> Mol Cell Endocrinol. 275, 13-29 (2007).</li><li>Baschant, U., Tuckermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+glucocorticoid+receptor+in+inflammation+and+immunity.">The role of the glucocorticoid receptor in inflammation and immunity.</a> J Steroid Biochem Mol Biol. 120, 69-75 (2010).</li><li>Schacke, H., Docke, W. D., Asadullah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+involved+in+the+side+effects+of+glucocorticoids.">Mechanisms involved in the side effects of glucocorticoids.</a> Pharmacol Ther. 96, 23-43 (2002).</li><li>De Bosscher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Glucocorticoid+Receptor+modulators.">Selective Glucocorticoid Receptor modulators.</a> J Steroid Biochem Mol Biol. 120, 96-104 (2010).</li><li>Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+screening+in+the+zebrafish+embryo.">Chemical genetic screening in the zebrafish embryo.</a> Nat Protoc. 4, 1422-1432 (2009).</li><li>Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+screening+in+zebrafish.">Small molecule screening in zebrafish.</a> J Cardiovasc Transl Res. 3, 454-460 (2010).</li><li>Casals-Casas, C., Desvergne, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+disruptors:+from+endocrine+to+metabolic+disruption.">Endocrine disruptors: from endocrine to metabolic disruption.</a> Annu Rev Physiol. 73, 135-162 (2011).</li><li>Grun, F., Blumberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+the+case+for+obesogens.">Minireview: the case for obesogens.</a> Mol Endocrinol. 23, 1127-1134 (2009).</li><li>Odermatt, A., Gumy, C., Atanasov, A. G., Dzyakanchuk, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+glucocorticoid+action+by+environmental+chemicals:+potential+mechanisms+and+relevance.">Disruption of glucocorticoid action by environmental chemicals: potential mechanisms and relevance.</a> J Steroid Biochem Mol Biol. 102, 222-231 (2006).</li><li>Odermatt, A., Gumy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+and+mineralocorticoid+action:+why+should+we+consider+influences+by+environmental+chemicals.">Glucocorticoid and mineralocorticoid action: why should we consider influences by environmental chemicals.</a> Biochem Pharmacol. 76, 1184-1193 (2008).</li><li>Lohr, H., Hammerschmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+in+endocrine+systems:+recent+advances+and+implications+for+human+disease.">Zebrafish in endocrine systems: recent advances and implications for human disease.</a> Annu Rev Physiol. 73, 183-211 (2011).</li><li>Schaaf, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+functional+glucocorticoid+receptor+beta-isoform+in+zebrafish.">Discovery of a functional glucocorticoid receptor beta-isoform in zebrafish.</a> Endocrinology. 149, 1591-1599 (2008).</li><li>Schaaf, M. J., Chatzopoulou, A., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+system+for+glucocorticoid+receptor+research.">The zebrafish as a model system for glucocorticoid receptor research.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 153, 75-82 (2009).</li><li>Alsop, D., Vijayan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+stress+axis:+molecular+fallout+from+the+teleost-specific+genome+duplication+event.">The zebrafish stress axis: molecular fallout from the teleost-specific genome duplication event.</a> Gen Comp Endocrinol. 161, 62-66 (2009).</li><li>Alsop, D., Vijayan, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+programming+of+the+corticosteroid+stress+axis+during+zebrafish+development.">Molecular programming of the corticosteroid stress axis during zebrafish development.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 153, 49-54 (2009).</li><li>Schoonheim, P. J., Chatzopoulou, A., Schaaf, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+an+in+vivo+model+system+for+glucocorticoid+resistance.">The zebrafish as an in vivo model system for glucocorticoid resistance.</a> Steroids. 75, 918-925 (2010).</li><li>Weger, B. D., Weger, M., Nusser, M., Brenner-Weiss, G., Dickmeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Chemical+Screening+System+for+Glucocorticoid+Stress+Hormone+Signaling+in+an+Intact+Vertebrate.">A Chemical Screening System for Glucocorticoid Stress Hormone Signaling in an Intact Vertebrate.</a> ACS Chem Biol. 7, (2012).</li><li>Hirota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+biology+approach+reveals+period+shortening+of+the+mammalian+circadian+clock+by+specific+inhibition+of+GSK-3beta.">A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20746-20751 (2008).</li><li>Birmingham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+methods+for+analysis+of+high-throughput+RNA+interference+screens.">Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens.</a> Nat Methods. 6, 569-575 (2009).</li><li>Warnes, G. R., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Liaw, W. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> gplots: Various R programming tools for plotting data. 2.11.0, (2012).</li><li>Carey, V., Redestig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ROC: utilities for ROC, with uarray focus. , (2013).</li><li>Fan, F., Wood, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+assays+for+high-throughput+screening.">Bioluminescent assays for high-throughput screening.</a> Assay Drug Dev Technol. 5, 127-136 (2007).</li><li>Graf, S. F., Hotzel, S., Liebel, U., Stemmer, A., Knapp, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+fluidic+sorting+system+for+automated+Zebrafish+egg+sorting+into+multiwell+plates.">Image-based fluidic sorting system for automated Zebrafish egg sorting into multiwell plates.</a> J Lab Autom. 16, 105-111 (2011).</li><li>Letamendia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+an+automated+high-throughput+system+for+zebrafish+in+vivo+screenings.">Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings.</a> PLoS ONE. 7, e36690 (2012).</li></ol>

Нам нечего раскрывать.

Мы приведем здесь рабочий процесс и анализа данных для химической экране измерения GC деятельность в естественных условиях с использованием GRIZLY анализа 18. Анализ имеет характеристики контроля качества и показателей эффективности, которые сопоставимы с обычными экранами на основе клеток, важным преимуществом для его использования в условиях высокой пропускной. Кроме того, однако, в естественных условиях анализа обнаруживает также соединения, которые не доступны на экраны в пробирке. Примером этого может служить присутствии прогормонов прегненолона среди хитов. Таким образом, анализ GRIZLY расширяет сферу экранов, направленных на сигнальной активности GC. Важность обнаружения естественных условиях эффектов в с нашим анализом также иллюстрируется результатами мы, полученных с DBT загрязняющих оловоорганические и ТБТ 18. DBT, но не ТБТ, как было показано, ингибирует передачу сигнала GC в культуре клеток млекопитающих, и мы наблюдали то же самое в культурах клеток выражают даниоING в GRE: Люк репортер. Важно отметить, однако, в данном анализе GRIZLY, ТБТ показали ингибирующую активность по ГХ пути, так как он может быть преобразован в DBT на личиночной метаболизма. Это торможение наблюдалось уже на экологически значимых концентрациях ТБО. Эти результаты иллюстрируют потенциал анализа GRIZLY в обнаружении комбинированного воздействия, основанные на меж-органов перекрестных помех и метаболических модификаций соединений в живом организме. Они также подчеркивают приложений потенциал анализа GRIZLY для мониторинга окружающей среды. Таким образом, эффекты эндокринной нарушающими могут быть изучены на уровне сигнализации рецептора, где нарушающими мешает GC сигнализации активности индуцированного агонистом GR таких как дексаметазон. Другая возможность состоит в изучении сложное воздействие на прегненолона-стимулированных GC синтеза. Высокое качество пропускная способность анализа должны допускать быстрого скрининга образцов окружающей среды библиотек. Использование люциферазы в качестве арГен eporter позволяет высоким динамическим диапазоном обнаружения активности 23 сигнализации. Действительно, чувствительность анализа дает возможность обнаружить осмотический стресс-индуцированной продукции GC от одного личинок 18. Высокая временное разрешение достигается с люциферазы репортера позволяет проследить сигнализации деятельность в течение долгого времени, что дает возможность анализировать также кинетики данных. Потенциальный недостаток для некоторых приложений является ограниченная пригодность для пространственного мониторинга этого репортера системы. Люминесцентные репортер системы могут быть лучше подходит для анализов, требующие мониторинга определенных областях личинок. Однако такие анализы могут страдать от более низких чувствительности из-за фоновых эффектов, вызванных света возбуждения, который также создает ограничений на обнаружении флуоресцентных соединений. Кроме того, они могут обеспечить меньшую кинетическую разрешение из-за обычно более высокой стабильности флуоресцентных белков 23.Кроме того, они представляют проблемы с точки зрения съемочной аппаратуры, анализа данных и хранения данных, которые могут ограничить их использование для небольших исследовательских лабораторий. Множество планом анализа GRIZLY как анализа микротитрационный планшет на основе позволяет легко интеграции в типичных скрининга рабочих процессов. Анализ легко применимы и в небольших исследовательских лабораторий из-за его простоты использования и анализа данных. В то же время, это позволяет в значительной степени автоматизации, например, автоматизированные применение препарата с помощью пипетки роботов или автоматизированное распределение зародышей по эмбриона сортировка устройств 24,25. Простой считывания не требует автоматической сортировки микроскопы или сложное программное обеспечение для анализа изображений, но обеспечивает богатый набор данных о временных и количественных аспектов изучаемого сигнального пути. Таким образом, мы представляем шаг за шагом протокол для относительно недорогой, надежный и простой в обращении химической скрининге для GCдеятельность сигнализации в естественных условиях и в реальном времени. Анализ позволяет определить эффектов в естественных условиях соединений на GC сигнализации не обнаруживаются в культуре клеток на основе анализов. Среди многих приложений для анализа являются, например, определения генетических эффектов на глюкокортикоидов сигнализации, мониторинга окружающей среды, подрывающих эндокринную систему воздействия на глюкокортикоидов синтеза и активности сигнализации, а также скрининга соединений для нежелательных эффектов на GC сигнализации или для романа в естественных условиях модуляторов это важно сигнальный путь.

Глюкокортикоиды (ГКС) являются стероидные гормоны, производимые надпочечниками, которые играют важную роль в реакции на стресс и в регуляции обмена веществ 1. ГК связать цитоплазматические глюкокортикоидных рецепторов (ГР) на ядерных рецепторов суперсемейства, которые, при связывании, перемещать в ядро 2. Здесь они могут, например, репрессировать транскрипцию путем вмешательства с другими факторами транскрипции (трансрепрессии) или активировать транскрипцию гена с помощью глюкокортикоидных чувствительными элементами (Gres, трансактивации). Из-за их противовоспалительными свойствами, как природные, так и искусственные ГК широко используются препараты для лечения ряда заболеваний, таких как астма или артрит 3. Тем не менее, особенно при длительном применении ГКС может привести к серьезным побочным эффектам, в том числе диабета и глаукомы 4. Таким образом, новые соединения, направленные на GC сигнализации с потенциально более выгодным эффективности лечения и переносимости высоко ценятся на кормеэ. Важно отметить, что лиганд эффекты, наблюдаемые в культивируемых клетках могут отличаться от тех, видели в естественных условиях 5. Такие эффекты могут Результаты смещения, полученные с обычной культуре клеток на основе фармацевтических скрининга. Химический анализ в естественных условиях, как включается данио модели недавно попали в фокус, как это позволяет определить эффектов не обнаруживаемых в культуре клеток 6,7. Гормональные сигнальные пути также могут быть затронуты, загрязняющих окружающую среду. Так называемые эндокринные нарушения химических веществ (СЭД) влияют на различные гормональные регулируется процессы 8. Таким образом, воспроизводство и половое различие водных организмов может модулироваться веществ с эстроген-подобных действий. В последнее время проблемы были подняты, что метаболические нарушения могут быть связаны с ЭДХВ в среде 9. Один путь мишенью такой &quot;метаболического нарушения&quot; является глюкокортикоид путь, который также участвует в ксеноБиотики воздействие на развитие и иммунной функции 10,11. Однако, по сравнению с большим количеством информации, доступной на соединений, препятствующих половых стероидных действия гормона, сравнительно мало известно о эндокринных эффектов на разрушение опосредованных через ГР. Таким образом, средства необходимы, что позволит мониторинга загрязнителей на GC сигнализации в естественных условиях. Данио уже давно популярной моделью в биологии развития, а относительно недавно также привлекает исследователей из других областей, в том числе эндокринологии 12. По сравнению с другими костистых рыб, система GC сигнализации данио более похож на млекопитающих, поскольку данио геном содержит только один ген ГР в отличие от дублированных рецепторов во многих других видов рыб 13-15. Кроме того, гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси уже функционирует в 5-дневной данио личинки, которые увеличивают выработку эндогенного GC в ответ на стресс-14,16-18. Недавно мы генерируется трансгенного данио линию, GRE: Люк, который позволяет для мониторинга деятельности сигнализации GC в естественных условиях и в режиме реального времени 18. Линия несет репортера люциферазы генную конструкцию под контролем минимального ТАТА бокс промотора и четыре concatemerized ГОЭ (фиг. 1а). GC индуцированный биолюминесценции может быть измерена с одной GRE: Люк личинки в 96-луночных микротитрационных планшетах в естественных условиях в течение длительных периодов времени. Это GRIZLY анализ (для &quot;глюкокортикоидный в естественных условиях данио рерио активности люциферазы&quot;) может быть использован в ряде различных исследовательских областях, таких как стресс исследований, экологического мониторинга и фармакологических экранов 18. Мы были в состоянии обнаружить эндогенный рост кортизола после осмотического стресса от одного личинок и может следовать созревание ответ в процессе разработки. Кроме того, мы могли контролировать воздействие на GC сигнализации оловоорганическогос, которые требуют метаболизму личинкой. Важно отметить, что линия была в состоянии обнаружить эти эффекты в экологически значимых концентрациях. Наконец, в пилотном экрана анализ чувствительно и специфически обнаружен соединений с GC активности от химической библиотеки, в том числе одного соединения, которое стимулированного эндогенную продукцию кортизола у личинок. Здесь мы описываем подробный протокол для химических экранов с использованием анализа GRIZLY.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buffer composition + reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDA approved drug library</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-2841-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferin</td>
			<td>Biosynth</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiprobe II</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>8 channel, equipped with disposable tip adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquidator 96</td>
			<td>Steinbrenner Laborsysteme</td>
 <td></td>
			<td>hand-operated 96-channel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision XCite Multilabel Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with stacker automation, temperature control, barcode reader and enhanced luminescence detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasticware + consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Storage Plate</td>
			<td>ABgene</td>
			<td>AB-0765</td>
			<td>round well, 0.8 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover films,</td>
			<td>ratiolab</td>
			<td>6018412</td>
			<td>self adhesive, DMSO resistent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Steinbrenner Laborsysteme</td>
			<td>LRF-200L</td>
			<td>for liquidator 96, 200 &#956;l, low retention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TopSeal-A</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPlate-96</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005299</td>
			<td>white opaque 96-well microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode Labels</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1608182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered polypropylene IsoTip pipette tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>S058.4809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRE:Luc fish</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ZDB-TGCONSTRCT-120920-1</td>
			<td>available at the European Zebrafish Resource Centre EZRC, Karlsruhe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chemical screening procedure for glucocorticoid signaling with a zebrafish larva luciferase reporter system

Глюкокортикоидных гормонов стресса и их искусственные производные широко используются препараты для лечения воспаления, но длительное лечение глюкокортикоидами может привести к серьезным побочным эффектам. Тест-системы необходимы для поиска новых соединений, влияющих глюкокортикоидов сигнализацию в естественных условиях или определить нежелательные эффекты соединений на метаболизм глюкокортикоидов сигнализации. Мы создали трансгенных данио анализа, который позволяет измерять глюкокортикоидов сигнальной активности в естественных условиях и в режиме реального времени, GRIZLY анализ (глюкокортикоидный В естественных данио рерио активности люциферазы). Люциферазную основе анализа обнаруживает воздействие на глюкокортикоидов сигнализации с высокой чувствительностью и специфичностью, в том числе эффектов по соединений, которые требуют метаболизму или негативно повлиять на эндогенный продуцирование глюкокортикоидов. Мы приведем здесь подробный протокол для проведения химических экраны с этим анализом. Мы описываем сбор данных, нормализацию ианализ, поставив акцент на контроле качества и визуализации данных. Анализ обеспечивает простой и временным разрешением, и количественный отсчет. Он может работать в качестве платформы автономной, но также легко интегрируется в высокопроизводительного скрининга рабочих процессов. Кроме того, он позволяет в течение многих применений, помимо химического скрининга, такие как мониторинг окружающей среды эндокринные расстройства или исследований стресса.

Watch this Scientific Journal Video about A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System at JoVE.com

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Опишем порядок и анализ данных скрининга системы химической для глюкокортикоидов сигнализации гормона стресса с помощью данио личинки: глюкокортикоидный В естественных условиях данио рерио активности люциферазы (GRIZLY) анализа. Анализ чутко и специально обнаруживает воздействие на глюкокортикоидов сигнализации соединениями, которые требуют метаболизму или негативно повлиять на выработку эндогенного глюкокортикоидов.

Процедура Скрининг Обработка глюкокортикоидных сигнализации с корреспондентом системе данио рерио Личинка люциферазы

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Human Biology

Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Изучение мембранных биогенеза с люциферазы основе Пробирной Гена Репортер

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Разработка автоматизированной обработки изображений и анализа для экранов данио химических веществ.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Lineage Маркировка данио рерио Клетки с лазерной Uncagable Fluorescein Декстран

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Определение целей по правам микроРНК с Пробирной LightSwitch люциферазы системы с помощью 3&#39;UTR-репортер Формирует и микроРНК Mimic в прилипшие клетки

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi скрининга для выявления Постэмбриональное фенотипы в С. Элеганс</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Высокая пропускная Функциональная Скрининг с использованием Домашнее двойного свечения люциферазы

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

РНК Catalyst в качестве корреспондента Скрининг препаратов против РНК редактирования в трипаносом

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Трансфекции клеток RAW264.7 с люциферазы гена

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

Multi-фермента скрининга с использованием высокой пропускной Генетическая ферментного Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...