Name: mechanical stimulation-induced calcium wave propagation in cell monolayers: the example of bovine corneal endothelial cells
Uploaded: 2013-07-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells at JoVE.com

Forskning udført i laboratoriet blev støttet af tilskud fra Research Foundation - Flandern (FWO, tilskud numrene G.0545.08 og G.0298.11) er universitetscenter seværdighed polakker Program (belgisk Science Policy, tilskud nummer P6/28 og P7/13) og er indlejret i en FWO-støttet forskning samfund. CDH er en post-ph.d.-stipendiat for Research Foundation - Flandern (FWO). Forfatterne er meget taknemmelige for alle nuværende og tidligere medlemmer af Laboratoriet for Molekylær og Cellulær signalering (KU Leuven), Dr. SP Srinivas (Indiana University School of Optometri, USA), laboratoriet af Dr. Leybaert (Ghent University) og Dr. Vinken (VUB), som forudsat nyttige diskussioner, optimeret procedurer eller var involveret i udviklingen af ​​værktøjer til studiet af connexin hemichannels.

1.. Isolering af hornhindeendothelceller Før du går i gang: Isoler celler fra friske øjne, opnået fra en lokal slagteri, så snart som muligt efter enucleating øjet. Sørg for, at øjet blev udskrællet fra en ko af de maksimalt 18 måneder, fem minutter efter slagtning og bevaret i Earle Balanced Salt Solution - 1% jodopløsning ved 4 ° C for transport til laboratoriet. <ol><li> Tag øjet ud af Earle Balanced Salt Solution - 1% jodopløsning og placere den i en petriskål (100 x 20 ...

I dette manuskript, beskriver vi en simpel metode til at måle intercellulære Ca2 +-bølgeudbredelse i monolag af primære bovine hornhindeendotelceller ved at tilvejebringe en lokaliseret og kontrolleret mekanisk stimulering ved hjælp af en mikropipette. Mekanisk stimulerede celler reagere med en lokal stigning i intracellulær IP3 og Ca2 +, som begge er vigtige intracellulære signalmolekyler, der driver intercellulære Ca2 +-bølgeudbredelse 11,67. IP 3 direkte...

Intercellulære kommunikation og signalering er afgørende for koordineringen af fysiologiske processer som reaktion på ekstracellulære agonister på vævet og hel-orgel niveau 1,2. Den mest direkte måde intercellulære kommunikation er skabt af forekomsten af ​​gap junctions. Gap junctions er platter gap junction-kanaler, som er proteinholdige kanaler dannet af head-to-head docking af to connexin (Cx) hemichannels af tilstødende celler 3,4 (Figur 1). Gap junctions tillader passage af små signalmolekyler med en molekylvægt på mindre end 1,5 kDa, herunder Ca2 + eller IP 3 5, forårsager og modulerende Ca2 +-frigivelse fra intracellulære lagre af nabocellerne 6 (figur 2). Gap junction kanaler er stramt reguleret af intra-og intermolekylære proteininteraktioner og cellulære signalering processer som redox modifikation ogfosforylering 7.. GJS lette koordineret reaktion af tilsluttede celler og dermed handle som en kemisk og elektrisk syncytium. For eksempel er udbredelsen af hjertets handling potentiale på tværs af de atrielle og ventrikulære myocytter medieret af CX-baserede GJ kanaler 85. Cxs ikke kun har en rolle som gap junction-kanaler, men også danne uparrede hemichannels, derved fungerer som kanaler i membraner samme regelmæssige ionkanaler 8-10 (figur 1). Hemichannels deltager i parakrine signalering mellem naboceller ved at styre udveksling af ioner og signalmolekyler mellem intra-og ekstracellulære miljø. I mange celletyper (som epitelceller, osteoblastiske celler, astrocytter, endotelceller, etc.) og organer (som hjerne, lever, nethinde, cochlea og kar), +-bølger intercellulære Ca2 er fundamentale for koordineringen af flercellede svar <sup&gt; 11.. Stigninger i intracellulære Ca2 +-niveauer i en bestemt celle er ikke begrænset til denne celle, men forplante sig til de omgivende naboceller, hvorved der etableres et intercellulært Ca2 +-bølge 12,13. Disse intercellulære Ca2 +-bølger er vigtig for normal fysiologisk regulering af cellelag som et syncytium og deres dysregulation er blevet forbundet med patofysiologiske processer 11. I hornhindeendothelet og epitelet, studerede forskellige grupper 14-24, herunder vores egen 25-33, mekanismerne og roller intercellulære kommunikation. I ikke-exciterbare celler, ligesom hornhindeendothelceller to forskellige former for intercellulær kommunikation forekommer 28,29, nemlig kløften forbindelsesepitop intercellulær kommunikation og parakrine intercellulær kommunikation. Gap forbindelsesepitop intercellulære kommunikation indebærer en direkte udveksling af signalmolekyler via mellemrumssammenføjninger 7.. Gap junctionale intercellulære kommunikation er afgørende for at opretholde vævshomeostase, kontrollerende celledeling, og etablere en synkroniseret reaktion på ekstracellulær stress 10,34,35. I en række patologier er gap junction kobling reduceret på grund af defekte cxs og hermed påvirke kløft forbindelsesepitop intercellulære kommunikation 36.. Dette understreger vigtigheden og indflydelse kløften forbindelsesepitop intercellulære kommunikation i flercellede organismer. I modsætning til kampen forbindelsesepitop intercellulær kommunikation, er paracrine intercellulær kommunikation ikke afhængig af celle-celle anbringelsen, idet det indebærer frigivelse af diffunderbare ekstracellulære budbringere (figur 2). Forskellige typer af signalstoffer frigives i det ekstracellulære rum ved at signalere celler. Molekylet er derefter transporteres til målcellen hvor det er detekteret af en specifik receptor-protein. Efterfølgende receptor-signal kompleks inducerer et cellulært respons, derafsluttes ved fjernelse af signalet, inaktivering eller desensibilisering. Frigivet lipofile ekstracellulære signalering budbringere trænge membranen og handle på intracellulære receptorer. I modsætning hertil hydrofile budbringere ikke krydse plasmamembranen af ​​den responderende celle, men fungerer som en ligand, som binder til overflade-udtrykte receptorproteiner, som derefter videresender signalet til det intracellulære miljø. Tre store familier af celleoverfladereceptor proteiner deltager i denne proces: ionkanal-forbundet, enzymbundet, og G-protein-bundet. Den frigivne messenger molekyle kan handle på receptorer af samme celle (autokrin), på målceller i umiddelbar nærhed (paracrine), eller på fjerne målceller, der kræver kredsløbssygdomme (endokrine). I mange celletyper, herunder hornhindeendothelet 28,29, er ATP en af de større hydrofile, parakrine faktorer, som driver udbredelsen af intercellulære Ca2 +-bølger 37-40. During mekanisk deformation, hypoxi, betændelse eller stimulering af forskellige agenter, kan ATP frigøres fra raske celler 41-44 reaktion på forskydningsspænding, stræk, eller osmotisk hævelse 44,45. Forskellige ATP-frigivelse mekanismer er blevet postuleret, herunder vesikulær exocytose 44 og en overflod af transportmekanismer, såsom ATP-bindende kassette (ABC) transportere, plasmalemmal spændingsafhængige anion kanaler 46, P2X7 receptor kanaler 47,48, samt connexin hemichannels 49-52 og pannexin hemichannels 43,49,53. Ekstracellulær ATP kan være hurtigt hydrolyseres til ADP, AMP og adenosin 54,55 af ectonucleotidases der er til stede i det ekstracellulære miljø. Den ekstracellulært udgivet ATP og dets metabolit ADP 56 vil spredes via diffusion. Den efterfølgende vekselvirkning af disse nukleotider med purinerge receptorer i de omkringliggende celler har været impliceret i propagation af intercellulære Ca2 +-bølger 28,37,51. To forskellige klasser af purinerge receptorer findes: adenosin er den vigtigste naturlige ligand for P1-purinreceptorer, mens både purin (ATP, ADP) og pyrimidin (UTP, UDP) nukleotider handle på de fleste P2-purinreceptorer 57. Intercellulære kommunikation kan undersøges ved forskellige metoder såsom skrabe lastning, dye transfer, lokal uncaging af agonister som IP 3 og Ca 2 +, mekanisk stimulering, etc.. Her beskriver vi studiet af Ca 2 +-bølgeudbredelse fremkaldes ved mekanisk stimulering af en enkelt celle. Fordelen ved at studere Ca 2 +-bølgeudbredelse ved mekanisk stimulering er, at det giver en let værktøj til at kvantificere udbredelsen af Ca 2 +-bølge over tid, og det giver kvantitativt at sammenligne forskellige forbehandlinger af cellerne. I hornhindeendothelet, +-bølger disse intercellulære Ca2 tillader en cokoordineret reaktion fra monolaget, herved fungerer som en mulig forsvarsmekanisme af den ikke-regenererende hornhindeendothelet hjælper endothelium at modstå ekstracellulære belastninger under intraokulær kirurgi, eller ved udsættelse for inflammatoriske mediatorer under immunafvisning eller uveitis 58,59.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Column1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14155-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodine</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>38060-1EA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>11960-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine (Glutamax)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>35050-038</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amphotericin-B</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A2942</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic-antimycotic mixture</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>15240-096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>25300-054</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14190-091</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-4 AM</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>F14217</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) </td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A265</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VI</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VII</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Control Peptide (SRGGEKNVFIV)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Two chambered glass slides</td>
 <td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)</td>
 <td>155380</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal microscope </td>
 <td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)</td>
 <td>LSM510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>P-280</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HVPZT-amplifier</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>E463 HVPZT-amplifier</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)</td>
 <td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA</td>
 <td>4878</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microelectrode puller </td>
 <td>Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)</td>
 <td>WZ DMZ-Universal Puller</td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
 </table>

mechanical stimulation-induced calcium wave propagation in cell monolayers: the example of bovine corneal endothelial cells

Intercellulære kommunikation er afgørende for koordineringen af ​​fysiologiske processer mellem celler i en række forskellige organer og væv, herunder hjernen, lever, nethinde, cochlea og kar. I eksperimentelle indstillinger +-bølger intercellulære Ca2 kan fremkaldes ved at anvende en mekanisk stimulus til en enkelt celle. Dette fører til frigivelse af de intracellulære signalmolekyler IP 3 og Ca 2 +, der indleder udbredelsen af Ca 2 +-bølge koncentrisk fra mekanisk stimuleret celle til de omkringliggende celler. De vigtigste molekylære veje, der styrer intercellulære Ca 2 +-bølgeudbredelse leveres af gap junction-kanaler gennem direkte overførsel af IP 3, og ved hemichannels gennem udgivelsen af ATP. Identifikation og karakterisering af ejendommene og regulering af de forskellige connexin og pannexin isoformer som gap junction-kanaler og hemichannels er tilladt af quantification af spredningen af det intercellulære Ca2 +-bølge, siRNA, og anvendelsen af inhibitorer af gap junction-kanaler og hemichannels. Her beskriver vi en metode til at måle intercellulære Ca2 +-bølge i monolag af primære hornhindeendothelceller læsset med Fluo4-AM i respons på en kontrolleret og lokaliseret mekaniske stimuli provokeret af en akut, kortvarigt deformation af cellen som et resultat for at røre cellemembranen med en mikromanipulator-kontrolleret glas mikropipette med en spids diameter på mindre end 1 um. Vi beskriver også den isolering af primære bovine hornhindeendothelceller og dens anvendelse som model system til at vurdere Cx43-hemichannel aktivitet som den drevne kraft intercellulære Ca2 +-bølger gennem frigivelse af ATP. Endelig diskuterer vi brug fordele, begrænsninger og alternativer ved denne metode i forbindelse med gap junction kanal og hemichannel forskning.

Alle forsøg udføres i overensstemmelse med alle relevante retningslinjer, bestemmelser og reguleringsorganer og protokollen bliver demonstreret udføres under vejledning og godkendelse af dyret pleje og brug udvalg af KU Leuven. Hos kvæg hornhindeendothelceller (BCEC), er funktionelle gap junctions udtrykt og begge kløften forbindelsesepitop intercellulær kommunikation og paracrine intercellulær kommunikation bidrage væsentligt til intercellulær kommunikation på en interaktiv måde,...

Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells at JoVE.com

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellulære Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Bølger er drevet af gap junction-kanaler og hemichannels. Her beskriver vi en metode til måling intercellulære Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Bølger i cellemonolag som reaktion på en lokal encellede mekanisk stimulus og dens anvendelse til at undersøge de egenskaber og regulering af gap junction-kanaler og hemichannels.

Mekanisk Stimulation-induceret Calcium bølgeudbredelse i cellemonolag: eksempel med Bovin hornhindeendothelceller

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Undersøgelse af Actin cytoskeleton i Live endoteliale celler, der udtrykker GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Vurdering af Calcium Sparks i intakte Skeletal muskelfibre

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Analyse af oxidativt stress i zebrafisk embryoner

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Måling af Osmotisk Vand permeabilitetskoefficienten (P<sub&gt; F</sub&gt;) Af sfæriske celler: Isolerede planteprotoplaster som et eksempel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering af murint Ventil endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Kvantificering af endotelcelle Klæbeevne<em&gt; In vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering og primær kultur af muse aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...