Name: mechanical stimulation-induced calcium wave propagation in cell monolayers: the example of bovine corneal endothelial cells
Uploaded: 2013-07-16T12:00:00
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実験室で行われる研究活動は、研究財団からの補助金によって支えられて - フランダース（FWO、助成番号G.0545.08とG.0298.11）、大学間の観光極プログラム（ベルギーの科学政策、助成番号P6/28とP7/13）とFWOでサポートされている研究コミュニティに埋め込まれています。フランダース（FWO） - CDHは研究財団の博士研究員である。著者は、分子·細胞内シグナル伝達（KUルーベン）、博士SPスリニバス（検眼、米国インディアナ大学）博士Leybaert（ゲント大学）との研究室の研究室のすべての現在および元メンバーに非常に感謝しています有用な議論を、最適化された手順やコネキシンヘミチャネルの研究のためのツールの開発に関与していたが提供博士Vinken（VUB）。

1。角膜内皮細胞の分離始める前にした場合：目をenucleating後できるだけ早く、地元の屠殺場から入手した、新鮮な目から細胞を分離します。目が最大18ヶ月、5分死後とアールの平衡塩類溶液中で保存の牛から、摘出されたことを確認してください - 4で1％ヨウ素溶液実験室への輸送のための°C。 <ol><li> 1％ヨウ素溶液をペトリ皿（100×20㎜）に置く - アールの平衡塩溶液...

本稿では、マイクロピペットを使用して、ローカライズされた、制御された機械的刺激を提供することにより、プライマリウシ角膜内皮細胞の単層の細胞内のCa 2 +波の伝播を測定するための簡単な方法を述べる。機械的に刺激された細胞では、細胞内のCa 2 +波伝播11,67を駆動する本質的な細胞内シグナル伝達分子である、どちらも細胞内のIP 3およびCa 2</sup...

細胞間のコミュニケーションとシグナリングは細胞外組織におけるアゴニスト及び全臓器レベル1,2に対応して生理学的プロセスの調整のために不可欠である。細胞間コミュニケーションの最も直接的な方法は、ギャップ結合の発生によって作成されます。ギャップ結合は、隣接するセル3,4（ 図1）の2コネキシン（Cxの）ヘミチャネルの頭に頭ドッキングによって形成されたタンパク性チャネルであるギャップ結合チャネルのプラークです。ギャップ結合は、隣接セル6（ 図2）の細胞内貯蔵から引き起こし、変調のCa 2 +放出のCa 2 +又はIP 3 5を含む1.5未満キロダルトンの分子量を有する小さなシグナル伝達分子の通過を可能にする。ギャップ結合チャネルはしっかりレドックス変形例のように、内および分子間相互作用によって、タンパク質と細胞内シグナル伝達プロセスによって規制されているとリン7。 GJSは、それによって化学的および電気的合胞体として作用し、接続されたセルの協調対応を容易にします。例えば、心房および心室筋細胞全体の心筋活動電位の広がりはCxに基づくGJチャネル85によって媒介される。 CXSはギャップ結合チャネルとしての役割を持っているだけでなく、対ヘミチャネルを形成することにより、定期的なイオンチャネル8-10（ 図1）と同様に膜におけるチャネルとして機能していない。ヘミチャネルは、イントラと細胞外環境との間のイオンとシグナル伝達分子の交換を制御することにより、隣接するセル間のパラクリンシグナリングに参加しています。 多くの細胞型（上皮細胞、骨芽細胞、星状細胞、内皮細胞などのような）及び器官（脳、肝臓、網膜、蝸牛および脈管構造等）において、細胞間のCa 2 +波多細胞応答の調整のための基本となる<suP&gt; 11。特定の細胞内Ca 2 +濃度の増加は、このセルに限定されるものではなく、それによって細胞内のCa 2 +波12,13を確立し 、周囲の隣接セルに伝達されない。これらの細胞内のCa 2 +波合胞体などの細胞層の正常な生理的調節のために重要であり、それらの調節不全は、病態生理学的プロセス11と関連している。角膜内皮および上皮では、私たち自身の25-33を含む異なるグループ14-24は 、細胞間コミュニケーションの仕組みや役割を学んだ。非興奮性細胞では、角膜内皮細胞のように、細胞間コミュニケーションの二つの異なるモードが28,29、すなわちギャップ結合細胞間コミュニケーションとパラクリン細胞間のコミュニケーションを発生する。ギャップ結合細胞間コミュニケーションは、ギャップジャンクション7 を介してシグナル伝達分子の直接交換を伴う。ギャップジャンクショ​​ンtional細胞間の通信は、細胞増殖を制御し、細胞外ストレス10,34,35に同期された応答を確立し、組織の恒常性を維持するために重要である。病状の数は、ギャップ結合の結合が不完全によりCXSに減少し、これによって細胞間のギャップ結合コミュニケーション36に影響を及ぼしている。これは、多細胞生物におけるギャップ結合細胞間コミュニケーションの重要性と影響力を強調している。それは、細胞外拡散性メッセンジャー（ 図2）の放出を伴うため、ギャップ結合細胞間の通信とは対照的に、傍分泌細胞間の通信は、細胞-細胞同格に依存しない。シグナル伝達分子の異なるタイプのシグナリング細胞によって細胞外空間に放出される。分子は、それが特定の受容体タンパク質によって検出される標的細胞に輸送される。その後、受容体シグナル複合体はどの細胞応答を誘導信号、不活化又は脱感作を除去することによって終了する。リリース脂溶性の細胞外シグナル伝達の使者は膜を貫通し、細胞内の受容体に作用。対照的に、親水性の使者が応答細胞の原形質膜を通過しないが、その後、細胞内環境への信号を中継する表面発現受容体タンパク質に結合するリガンドとして作用する。細胞表面受容体タンパク質の三大家族がこのプロセスに参加：イオンチャネル連結、酵素、およびGタンパク質結合した。解放メッセンジャー分子は、近接標的細胞（パラクリン）上、または循環系（内分泌）を必要とする遠隔標的細胞に、同一セル（自己分泌）の受容体に作用することができる。 角膜内皮28,29を含む多くの細胞型において、ATPは、細胞間のCa 2 +波37-40の伝播を駆動する主要な親水性、パラクリン要因の一つである。 DURる種々の薬剤による機械的変形、低酸素症、炎症または刺激ATPは44,45を膨潤せん断応力、伸張、又は浸透圧に応答して41-44健常細胞から放出させることができる。別のATP放出メカニズムは、同様に、小胞のエキソサイトー44、例えばATP結合カセット（ABC）トランスポーター、形質膜電位依存性アニオンチャネル46、P2X7受容チャネル47,48などのトランスポートメカニズムの過多を含む、仮定されている コネキシンのヘミチャネル49-52とpannexinのヘミチャネル43,49,53。細胞外ATPはADP、AMPに急速に加水分解されると細胞外環境に存在するectonucleotidasesで54,55をアデノシンができます。細胞外に放出されたATP及びその代謝ADP 56は拡散によって広がっていく。隣接するセルでプリン受容体とこれらのヌクレオチドのその後の相互作用は、pに関与している細胞内のCa 2 +波28,37,51のropagation。プリン受容体の二つの異なるクラスが存在している：両方のプリン（ATP、ADP）とピリミジン（UTP、UDP）ヌクレオチドが最もP2-57プリン受容体に作用しながら、アデノシンは、P1-プリン受容体の主要天然リガンドである。 細胞間のコミュニケーションは、スクレープ負荷、移染、IP 3およびCa 2 +、機械的刺激、 等のようなアゴニストのローカルアンケージングなどの異なる方法で調査することができる。ここでは、+波の伝播は、単一セルの機械的刺激によって誘発されるのCa 2の研究を説明します。機械的刺激によってのCa 2 +波伝播を研究することの利点は、時間をかけてのCa 2 +波の広がりを定量化する簡単なツールを提供し、それは定量的に細胞の異なる前処理とを比較可能にすることである。角膜内皮において、これらの細胞内のCa 2 +波共同を可能にする単層からコーディネートの応答は、ここに眼内手術中に細胞外の応力に耐えられるように内皮を助ける非再生角膜内皮の可能性の防御機構として機能しているか、免疫拒絶またはブドウ膜炎58,59間に炎症性メディエーターに暴露される。

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Column1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14155-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodine</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>38060-1EA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>11960-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine (Glutamax)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>35050-038</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amphotericin-B</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A2942</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic-antimycotic mixture</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>15240-096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>25300-054</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14190-091</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-4 AM</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>F14217</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) </td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A265</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VI</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VII</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Control Peptide (SRGGEKNVFIV)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Two chambered glass slides</td>
 <td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)</td>
 <td>155380</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal microscope </td>
 <td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)</td>
 <td>LSM510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>P-280</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HVPZT-amplifier</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>E463 HVPZT-amplifier</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)</td>
 <td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA</td>
 <td>4878</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microelectrode puller </td>
 <td>Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)</td>
 <td>WZ DMZ-Universal Puller</td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
 </table>

mechanical stimulation-induced calcium wave propagation in cell monolayers: the example of bovine corneal endothelial cells

細胞間のコミュニケーションは、脳、肝臓、網膜、蝸牛と血管系を含む、臓器や組織の様々な細胞間の生理学的プロセスの調整のために不可欠です。実験的な設定では、細胞内のCa 2 +波単一セルに機械的刺激を印加することによって誘発することができる。これは、細胞内シグナル伝達分子のIP 3およびCa 2のリリースにつながる+隣接セルへの機械的刺激を受けた細胞から+波同心円状のCa 2の伝播を開始すること。細胞内のCa 2 +波の伝播を制御する主要な分子経路は、IP 3の直接転送を通って、ATPの放出を通じてヘミチャネルによってギャップ結合チャネルによって提供されます。プロパティと異なるコネキシンおよびギャップ結合チャネルとヘミチャネルとしてpannexinアイソフォームの規制の同定と特徴付けはquantificatioで許可されているnは細胞内のCa 2 +波は、siRNA、およびギャップ結合チャネルとヘミチャネルの阻害剤の使用の広がり。ここでは、結果として細胞内のCa 2細胞の急性、短期的な変形によって引き起こさ制御およびローカライズされた機械的刺激に応答しFluo4-AMでロードプライマリー角膜内皮細胞の単層で+波を測定するための方法を説明1μm未満の先端径を有するマイクロマニピュレータ制御されたガラスマイクロピペットで細胞膜に触れる。また、+波ATPの放出を通じて細胞内のCa 2のための駆動力としてCx43の-ヘミチャネルの活性を評価するためのモデル系として、一次ウシ角膜内皮細胞およびその使用の単離を記述している。最後に、我々は、使用、利点、制限およびギャップ結合チャネルとヘミチャネル研究の文脈におけるこの方法の選択肢を議論する。

すべての実験は、関連するすべてのガイドライン、規制、規制機関に準拠して実行され、実証されているプロトコルは、KUルーベンの動物のケアと使用委員会の指導と承認の下で行われる。 ウシ角膜内皮細胞（BCEC）で、機能的なギャップ結合を発現させ、ギャップ結合細胞間コミュニケーションとパラクリン細胞間通信の両方は、インタラクティブな方法で細胞間のコ?...

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Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

細胞間のCa<sup&gt; 2 +</sup&gt;波は、ギャップ結合チャネルとヘミチャネルによって駆動される。ここでは、細胞間のCaを測定するための方法を説明<sup&gt; 2 +</supローカル単細胞機械的刺激とプロパティとギャップ結合チャネルとヘミチャネルの規制を調査するために、そのアプリケーションに応じて、細胞単層で&gt;波。

細胞単層に機械的刺激によって誘発されるカルシウム波の伝播：ウシ角膜内皮細胞の例

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