Name: mechanical stimulation-induced calcium wave propagation in cell monolayers: the example of bovine corneal endothelial cells
Uploaded: 2013-07-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells at JoVE.com

Forskningsarbeid utført i laboratoriet ble støttet med tilskudd fra Research Foundation - Flandern (FWO; tilskuddsordninger tall G.0545.08 og G.0298.11), den Interuniversity attraksjonen polakker Program (belgisk Science Policy, prosjekt nummer P6/28 og P7/13) og er innebygd i en FWO-støttet forskningsmiljø. CDH er en postdoktor for Research Foundation - Flandern (FWO). Forfatterne er svært takknemlig for alle nåværende og tidligere medlemmer av Laboratory of Molecular and Cellular signalering (KU Leuven), Dr. SP Srinivas (Indiana University School of Optometry, USA), laboratoriet av Dr. Leybaert (Ghent University) og av Dr. Vinken (VUB) som ga nyttige diskusjoner, optimalisert prosedyrer eller var involvert i utviklingen av verktøy for studier av connexin hemichannels.

En. Isolering av Hornhinnen endotelceller Før du begynner: Isoler celler fra friske øyne, hentet fra et lokalt slakteri, så snart som mulig etter enucleating øyet. Sørg for at øyet ble enucleated fra en ku av maksimale 18 måneder gammel, fem minutter etter avliving og bevart i Earles Balanced Salt Solution - 1% jod-løsning ved 4 ° C for transport til laboratoriet. <ol><li> Ta øyet ut av Earles Balanced Salt Solution - 1% jod løsning og plassere den i en petriskål (100 x 20 mm)....

I dette manuskriptet, beskriver vi en enkel metode for å måle intracellulære Ca2 +-bølgeforplantning i monolag av primære bovine corneale endotelial-celler ved å tilveiebringe en lokal og kontrollert mekanisk stimulering ved hjelp av en mikropipette. Mekanisk stimulerte celler reagere med en lokal økning i intracellulært IP 3 og Ca 2 +, som begge er essensielle intracellulære signalmolekyler som driver intercellulære Ca 2 +-bølgeutbredelse 11,67. IP 3 er ...

Intercellulær kommunikasjon og signal er vesentlig for koordinering av fysiologiske prosesser som respons på ekstracellulære agonister ved vev-og hel-organ nivå 1,2. Den mest direkte måten å intercellular kommunikasjon er skapt av forekomsten av gap veikryss. Gap veikryss er plaketter av gap junction kanaler, som er proteinholdige kanaler dannet av head-to-head dokking av to connexin (Cx) hemichannels av tilstøtende celler 3,4 (figur 1). Gap veikryss tillate passasje av små signalmolekyler med en molekylvekt på mindre enn 1,5 kDa, blant Ca 2 + eller IP 3 5, forårsaker og modulere Ca2 +-frigjøring fra de intracellulære lagre av nabocellene 6 (figur 2). Gap junction kanaler er strengt regulert av intra-og intermolekylær protein interaksjoner og av cellulære signalering prosesser, som redoks modifikasjon ogfosforylering 7. Gjs rette for koordinert respons av tilkoblede celler, og dermed fungerer som en kjemisk og elektrisk syncytium. For eksempel, er spredning av kardial aksjonspotensiale tvers av de atriale og ventrikulære myocytter mediert av Cx-baserte GJ kanaler 85. CXS ikke bare har en rolle som gap junction kanaler, men også danne uparede hemichannels, og derved fungerer som kanaler i membraner på samme måte som vanlige ionekanaler 8-10 (figur 1). Hemichannels delta i parakrine signalering mellom nabocellene ved å kontrollere utveksling av ioner og signalmolekyler mellom intra-og ekstracellulære miljøet. I mange celletyper (som epitelceller, osteoblastiske celler, astrocytes, endotelceller, osv.) og organer (som hjerne, lever, netthinne, sneglehuset og blodkar), intracellulære Ca 2 +-bølger er grunnleggende for koordinering av flercellede svar <sup&gt; 11. Økninger i intracellulær Ca 2 +-nivåer i en viss celle er ikke begrenset til denne celle, men forplanter seg til de omkringliggende nabocellene, for derved å etablere et intercellulært Ca 2 +-bølge 12,13. Disse intercellulært Ca 2 +-bølger er viktig for normal fysiologisk regulering av celle lag som syncytium og deres dysregulation har vært forbundet med patofysiologiske prosesser 11. I hornhinnen endotelet og epitel, studerte ulike grupper 14-24, inkludert vår egen 25-33, mekanismer og roller intercellular kommunikasjon. I ikke-eksiterbare celler, som corneale endotelial-celler, to forskjellige moduser av intercellulær kommunikasjon forekomme 28,29, nemlig gap junctional intercellulær kommunikasjon og parakrine intercellulær kommunikasjon. Gap junctional intercellular kommunikasjon innebærer en direkte utveksling av signalmolekyler via gap veikryss 7. Gap juncnale intercellular kommunikasjon er avgjørende for å opprettholde vev homeostase, kontrollere cellevekst, og etablere en synkronisert svar på ekstracellulær stresset 10,34,35. I et antall patologiske tilstander, er gap junction kopling redusert på grunn av defekte CXS og herved påvirker gapet junctional intercellulær kommunikasjon 36. Dette understreker viktigheten og innflytelse gap junctional intercellular kommunikasjon i flercellede organismer. I motsetning til gapet junctional intercellulær kommunikasjon, er parakrin intercellulær kommunikasjon ikke avhengig av celle-celle-apposisjon, siden det innebærer frigjøring av diffunderbart ekstracellulære budbringere (figur 2). Ulike typer signalmolekyler blir utgitt i ekstracellulære rommet ved å signalisere celler. Molekylet blir deretter transportert til målcellen hvor det detekteres av et spesifikt reseptorprotein. Deretter reseptor-signal kompleks induserer en cellulær respons, somble avsluttet ved fjerning av signalet, inaktivering eller desensitivisering. Utgitt lipofile ekstracellulære signalmolekyler budbringere trenge gjennom membranen og handle på intracellulære reseptorer. I motsetning, gjør hydrofile budbringere ikke krysse plasmamembranen hos det reagerer celle, men opptrer som en ligand som binder seg til overflaten-uttrykte reseptor proteiner, som deretter videresender signalet til det intracellulære miljøet. Tre store familier av celleoverflaten reseptor proteiner delta i denne prosessen: ion-channel-forbundet, enzyme-linked, og G protein-koblet. Den frigjorte messenger molekyl kan opptre på reseptorene av den samme celle (autokrin), på målceller i umiddelbar nærhet (parakrine), eller på fjerne målceller som krever sirkulasjonssystemet (endokrine). I mange celletyper, inkludert corneal endothelium 28,29, ATP er en av de store hydrofile, parakrine faktorene som driver forplantningen av intercellulære Ca 2 +-bølger 37-40. During mekanisk deformasjon, hypoksi, betennelse eller stimulering av ulike agenter, kan ATP bli løst fra friske celler 41-44 i respons til skjærspenning, strekke, eller osmotisk hevelse 44,45. Forskjellige ATP-frigjøringsmekanismer er blitt postulert, inkludert vesikulært exocytose 44 og en mengde av transport-mekanismer, slik som ATP-bindende kassett (ABC) transportører, plasmalemmal spenningsavhengige anion kanaler 46, P2X7 receptor kanaler 47,48, samt connexin hemichannels 49-52 og pannexin hemichannels 43,49,53. Extracellular ATP kan være hurtig hydrolyseres til ADP, AMP og adenosin 54,55 ved ectonucleotidases som er til stede i det ekstracellulære miljø. Den ekstracellulært utgitt ATP og dets metabolitt ADP 56 vil spre seg gjennom diffusjon. Den etterfølgende interaksjon av disse nukleotidene med purinergiske reseptorer i de nærliggende celler har vært implisert i propagation av intercellular Ca 2 +-bølger 28,37,51. To forskjellige klasser av purinergiske reseptorer finnes: adenosin er den viktigste naturlige ligand for P1-purinoceptors, mens både purine (ATP, ADP) og pyrimidin (UTP, UDP) nukleotider handle på de fleste P2-purinoceptors 57. Intercellulær kommunikasjon kan bli undersøkt av ulike metoder som skrape lasting, fargestoff overføring, lokale uncaging av agonister som IP 3 og Ca 2 +, mekanisk stimulering, etc.. Her beskriver vi studiet av Ca 2 +-bølgeutbredelse fremkalt ved mekanisk stimulering av en enkelt celle. Fordelen med å studere Ca 2 +-bølgeutbredelse av mekanisk stimulering er at det gir et enkelt verktøy for å kvantifisere spredningen av Ca 2 +-bølge over tid, og det gir kvantitativt sammenligne ulike forbehandling av cellene. I hornhinnen endotelet, disse intercellulært Ca 2 +-bølger tillate en cokoordinert respons fra monolaget, herved opptrer som en mulig forsvarsmekanisme av den ikke-regenerative corneal endothelium hjelpe endotelet til å motstå påkjenninger under ekstracellulære intraokulær kirurgi, eller ved eksponering for inflammatoriske mediatorer under immun avvisning eller uveitt 58,59.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Column1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14155-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodine</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>38060-1EA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>11960-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine (Glutamax)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>35050-038</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amphotericin-B</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A2942</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic-antimycotic mixture</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>15240-096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>25300-054</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14190-091</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-4 AM</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>F14217</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) </td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A265</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VI</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VII</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Control Peptide (SRGGEKNVFIV)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Two chambered glass slides</td>
 <td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)</td>
 <td>155380</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal microscope </td>
 <td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)</td>
 <td>LSM510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>P-280</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HVPZT-amplifier</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>E463 HVPZT-amplifier</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)</td>
 <td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA</td>
 <td>4878</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microelectrode puller </td>
 <td>Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)</td>
 <td>WZ DMZ-Universal Puller</td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
 </table>

mechanical stimulation-induced calcium wave propagation in cell monolayers: the example of bovine corneal endothelial cells

Intercellulær kommunikasjon er viktig for samordning av fysiologiske prosesser mellom celler i en rekke organer og vev, inkludert hjernen, leveren, retina, sneglehuset og blodkar. I eksperimentelle innstillinger, intercellulære Ca 2 +-bølger kan bli fremkalt ved å anvende en mekanisk stimulus til en enkelt celle. Dette fører til frigivelse av de intracellulære signalmolekyler IP 3 og Ca 2 + som initierer formering av Ca 2 +-bølge konsentrisk fra det mekanisk stimulert celle til nabocellene. De viktigste molekylære mekanismer som styrer intercellulært Ca 2 +-bølgeutbredelse leveres av gap junction kanaler gjennom direkte overføring av IP 3 og ved hemichannels gjennom utgivelsen av ATP. Identifisering og karakterisering av egenskapene og regulering av ulike connexin og pannexin isoformer som gap junction kanaler og hemichannels er tillatt av quantification for spredning av den intercellulære Ca 2 +-bølge, siRNA, og anvendelse av inhibitorer av gap junction kanaler og hemichannels. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å måle intracellulære Ca2 +-bølge i monolag av primære corneale endotelial-celler lastet med Fluo4-AM som reaksjon på en kontrollert og lokalisert mekanisk stimulus provosert av en akutt, kortvarig deformasjon av cellen som et resultat for å trykke på cellemembranen med en mikromanipulator-styrt glass mikropipette med en spiss diameter på mindre enn 1 pm. Vi beskriver også isolasjon av primære bovine corneale endotelial-celler og dens bruk som modellsystem for å vurdere Cx43-hemichannel aktivitet som det drevne kraft for intercellulær Ca 2 +-bølger gjennom frigjøring av ATP. Avslutningsvis diskuterer vi bruk, fordeler, begrensninger og alternativer av denne metoden i sammenheng med gap veikryss kanal og hemichannel forskning.

Alle eksperimentene er utført i samsvar med alle gjeldende retningslinjer, forskrifter og kontrollorganer og protokollen blir demonstrert utføres under veiledning og godkjenning av dyr omsorg og bruk komité av KU Leuven. I bovine corneale endotelial-celler (BCEC), er funksjonelle gap veikryss og uttrykt både gapet junctional intercellulær kommunikasjon og parakrine intercellulær kommunikasjon bidra vesentlig til intercellulær kommunikasjon på en interaktiv måte, men den viktigste st...

Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells at JoVE.com

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellulært Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Bølger er drevet av gap junction kanaler og hemichannels. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å måle intracellulære Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Bølger i cellemonolagene i respons på en lokal encellet mekanisk stimulus og dens anvendelse for å undersøke egenskapene til og regulering av gap junction kanaler og hemichannels.

Mekanisk stimulering-indusert Kalsium wave forplantning i cellemonolagene: The Eksempel på storfe Hornhinnen endotelceller

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Studie av aktin cytoskjelettet i Live endotelceller uttrykker GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Vurdering av kalsium Sparks i Intakt skjelettmuskelfibre

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Analyse av oksidativt stress i sebrafisk embryo

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Måling av osmosevann permeabilitetskoeffisient (P<sub&gt; F</sub&gt;) Av sfæriske Cells: Isolerte Plant Protoplaster som et eksempel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av Murint Valve endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Kvantifisering av endotelcelle klebrighet<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolasjon og Primær Culture of Mouse endotelceller fra aorta

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høy oppløsning Time-lapse Imaging og automatisk analyse av mikrotubulidynamikk i levende menneske navleveneendotel Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...