Name: mechanical stimulation-induced calcium wave propagation in cell monolayers: the example of bovine corneal endothelial cells
Uploaded: 2013-07-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells at JoVE.com

O trabalho de investigação realizado em laboratório foi apoiada por doações da Fundação de Pesquisa - Flandres (FWO; números concessão G.0545.08 e G.0298.11), o Programa Interuniversitário poloneses Atração (Ciência Política belga; número de concessão P6/28 e P7/13) e está inserida em uma comunidade de investigação FWO apoiado. CDH é uma bolsa de pós-doutorado da Fundação de Pesquisa - Flandres (FWO). Os autores são muito gratos a todos os membros atuais e antigos do Laboratory of Molecular and Cellular Signaling (KU Leuven), Dr. SP Srinivas (Indiana Escola de Optometria University, EUA), o laboratório de Dr. Leybaert (Universidade de Ghent) e de Dr. Vinken (VUB), que proporcionou discussões úteis, procedimentos otimizados ou estavam envolvidos no desenvolvimento de ferramentas para o estudo de hemichannels conexina.

1. Isolamento de células endoteliais da córnea Antes de começar: Isole as células dos olhos frescos, obtidos a partir de um matadouro local, logo que possível após a enucleação dos olhos. Certifique-se de que foi submetida à enucleação de uma vaca máximas de 18 meses de idade, cinco minutos após o abate e preservados em solução salina equilibrada de Earle - solução de iodo a 1% a 4 ° C durante o transporte para o laboratório. <ol><li> Pegue o olho de Solução Salina Bal...

Neste artigo, nós descrevemos um método simples de medir intercelular Ca 2 + de propagação de ondas em monocamadas de células endoteliais corneanas bovinas primárias, fornecendo uma estimulação mecânica localizada e controlada usando uma micropipeta. Mecanicamente estimuladas células respondem com um aumento local intracelular IP3 e Ca 2 +, ambos os quais são moléculas de sinalização intracelular que conduzem essenciais intracelular de Ca 2 + de propagação de o...

Comunicação intercelular e de sinalização são essenciais para a coordenação dos processos fisiológicos em resposta aos agonistas extracelulares no tecido e nível de 1,2-órgão inteiro. A maneira mais direta de comunicação intercelular é criado pela ocorrência de junções. Junções são placas de canais de junção gap, que são canais protéicos formados pelo acoplamento cabeça-de-cabeça de dois (Cx) hemichannels conexina de células adjacentes 3,4 (Figura 1). Junções de hiato permitir a passagem de pequenas moléculas de sinalização, com um peso molecular de menos de 1,5 kDa, incluindo Ca 2 + ou de IP 3 5, causando modulação e Ca 2 + de libertação a partir das reservas intracelulares das células vizinhas 6 (Figura 2). Canais de junções são fortemente regulados por intra e intermolecular interações proteína e por processos de sinalização celular, como modificação redox efosforilação 7. GJS facilitar a resposta coordenada de células conectadas, agindo assim como um sincício elétrica e química. Por exemplo, a propagação do potencial de acção cardíaca entre os miócitos atriais e ventriculares é mediada pelos canais GJ baseados Cx 85. Cxs não só tem um papel como canais de junções de hiato, mas também formar hemichannels desemparelhados, funcionando desse modo como os canais de membranas de forma semelhante aos canais de iões regulares 8-10 (Figura 1). Hemichannels participar na sinalização parácrinas entre células vizinhas por controlar a troca de iões e moléculas de sinalização entre o ambiente intra-e extracelulares. Em muitos tipos de células (como células epiteliais, células osteoblásticas, astrócitos, células endoteliais, etc) e órgãos (como o cérebro, o fígado, retina, cóclea e na vasculatura), intercelular Ca 2 +-ondas são fundamentais para a coordenação das respostas multicelulares <sup&gt; 11. Aumentos nos níveis de Ca2 + intracelular em células de um determinado não estão limitados a esta célula, mas para propagar as células vizinhas adjacentes, estabelecendo assim uma intercelular Ca 2 + onda 12,13. Estes intercelular Ca 2 +-ondas são importantes para a regulação fisiológica normal de camadas de células como um sincício e sua desregulação tem sido associado com os processos patofisiológicos 11. No endotélio corneano e epitélio, diferentes grupos 14-24, incluindo o nosso próprio 25-33, estudou os mecanismos e as funções de comunicação intercelular. Em células não-excitáveis, como as células endoteliais corneanas, dois modos distintos de comunicação intercelular ocorrer 28,29, nomeadamente lacuna juncional comunicação intercelular e comunicação intercelular parácrina. Gap juncional comunicação intercelular envolve uma troca direta de moléculas de sinalização via junções gap 7. Gap junccomunicação intercelular internacional é fundamental para a manutenção da homeostase do tecido, controle da proliferação celular, e estabelecer uma resposta sincronizada ao estresse extracelular 10,34,35. Em uma série de patologias, acoplamento junção gap é reduzida devido à Cxs com defeito, e vem afetando lacuna juncional comunicação intercelular 36. Isto enfatiza a importância ea influência do fosso juncional comunicação intercelular em organismos multicelulares. Em contraste com a abertura juncional comunicação intercelular, a comunicação intercelular parácrina não é dependente de aposição célula-célula, uma vez que implica a libertação de mensageiros extracelulares difusíveis (Figura 2). Diferentes tipos de moléculas sinalizadoras são libertadas no meio extracelular pelas células de sinalização. A molécula é então transportado para a célula alvo, onde é detectado por uma proteína receptor específico. Subsequentemente, o complexo receptor de sinal induz uma resposta celular, queé terminada por remoção do sinal, ou inactivação de dessensibilização. Lançamentos lipofílicos mensageiros de sinalização extracelular penetrar a membrana e agem sobre os receptores intracelulares. Em contraste, os mensageiros hidrofílicas não atravessar a membrana plasmática da célula responder, mas actuar como um ligando que se liga a proteínas receptoras expressas na superfície, que então retransmitem o sinal para o ambiente intracelular. Três grandes famílias de proteínas receptoras de superfície celular participar neste processo: canais de íons ligados, enzyme-linked e proteína G ligada. A molécula mensageira libertados podem actuar sobre os receptores da mesma célula (autócrino), sobre as células-alvo, em estreita proximidade (parácrina), ou nas células alvo distantes que exigem que o sistema circulatório (endócrina). Em muitos tipos de células, incluindo endotélio corneano 28,29, o ATP é um dos principais factores parácrinos, hidrofílicos que conduzem à propagação intercelular da Ca2 +-ondas 37-40. During deformação mecânica, a hipoxia, a inflamação ou a estimulação por vários agentes, o ATP pode ser libertado a partir de células saudáveis ​​41-44, em resposta à tensão de corte, estiramento, ou inchaço osmótico 44,45. Mecanismos de libertação de ATP diferentes têm sido postulada, incluindo exocitose vesicular 44 e uma multiplicidade de mecanismos de transporte, tais como a cassete (ABC) transportadores de ligação a ATP, canais dependentes da voltagem aniónica plasmalemmal 46 canais dos receptores P2X7, 47,48, bem como conexina hemichannels 49-52 e pannexin hemichannels 43,49,53. O ATP extracelular pode ser rapidamente hidrolisado para o ADP, AMP e adenosina 54,55 por ectonucleotidases que estão presentes no ambiente extracelular. O ATP extracelular liberado e seu metabólito ADP 56 vai se espalhar por meio de difusão. A interacção subsequente destes nucleótidos com receptores purinérgicos nas células vizinhas tem sido implicada na propagation intercelular de Ca 2 +-ondas 28,37,51. Duas classes diferentes de receptores purinérgicos estão presentes: adenosina é o principal ligando natural para P1-purinoceptors, enquanto ambos purina (ATP, ADP) e pirimidina (UTP, UDP) nucleótidos actuar em mais purinoceptors P2-57. Comunicação intercelular pode ser investigada por vários métodos, tais como a carga raspagem, a transferência de corantes, uncaging locais de agonistas como IP3 e Ca 2 +, estimulação mecânica, etc. Aqui descrevemos o estudo de Ca 2 + de propagação da onda induzida por estimulação mecânica de uma única célula. A vantagem de se estudar Ca 2 + de propagação da onda de estimulação mecânica é que ela fornece uma ferramenta fácil de quantificar a propagação do Ca 2 + onda ao longo do tempo e que permite comparar quantitativamente diferentes pré-tratamentos das células. Nas endotélio corneano, estes intercelular Ca 2 +-ondas permitir um coresposta coordenada a partir da monocamada, actuando por este meio como um possível mecanismo de defesa do endotélio corneal não regenerativos ajudando o endotélio para suportar tensões extracelular durante a cirurgia intra-ocular, ou por exposição a mediadores inflamatórios, durante a rejeição imunológica ou uveíte 58,59.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Column1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14155-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodine</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>38060-1EA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>11960-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine (Glutamax)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>35050-038</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amphotericin-B</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A2942</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic-antimycotic mixture</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>15240-096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>25300-054</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14190-091</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-4 AM</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>F14217</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) </td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A265</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VI</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VII</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Control Peptide (SRGGEKNVFIV)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Two chambered glass slides</td>
 <td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)</td>
 <td>155380</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal microscope </td>
 <td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)</td>
 <td>LSM510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>P-280</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HVPZT-amplifier</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>E463 HVPZT-amplifier</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)</td>
 <td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA</td>
 <td>4878</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microelectrode puller </td>
 <td>Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)</td>
 <td>WZ DMZ-Universal Puller</td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
 </table>

mechanical stimulation-induced calcium wave propagation in cell monolayers: the example of bovine corneal endothelial cells

Comunicação intercelular é essencial para a coordenação dos processos fisiológicas entre as células de uma variedade de órgãos e tecidos, incluindo o cérebro, o fígado, a retina, na cóclea e vasculatura. Em condições experimentais, intercelular Ca 2 +-ondas pode ser obtida através da aplicação de um estímulo mecânico para uma única célula. Isto conduz à libertação das moléculas sinalizadoras intracelulares de IP 3 e Ca 2 + que iniciam a propagação do Ca 2 + onda concêntrica a partir da célula estimulada mecanicamente para as células vizinhas. As principais vias moleculares que controlam intercelular Ca 2 + propagação de ondas são fornecidos por canais de derivação lacuna através da transferência direta de IP 3 e por hemichannels através da liberação de ATP. A identificação e caracterização das propriedades de regulação e das diferentes isoformas de conexinas e pannexin como canais de junções de hiato e hemichannels são permitidas pelo quantification da disseminação intercelular do Ca 2 + onda, siRNA, e o uso de inibidores dos canais de junções de hiato e hemichannels. Aqui, nós descrevemos um método para medir intercelular Ca 2 + onda em monocamadas de células endoteliais da córnea primárias carregado com Fluo4-AM em resposta a um estímulo mecânico controlado e localizado provocado por uma deformação aguda de curta duração, da célula como resultado de tocar na membrana celular com uma micropipeta de vidro controlada por micromanipulador com um diâmetro de ponta de menos de 1 um. Descrevemos também o isolamento de bovinos células endoteliais corneanas primários e sua utilização como sistema modelo para avaliar a atividade Cx43-hemichannel como a força orientada para intercelular Ca 2 +-ondas através da liberação de ATP. Finalmente, discute-se a utilização, vantagens, limitações e alternativas deste método no contexto do canal de junção gap e pesquisa hemichannel.

Todos os experimentos são executados em conformidade com todas as diretrizes, regulamentos e agências reguladoras e do protocolo que está sendo demonstrado é realizada sob a orientação e aprovação do comitê de cuidados com os animais e uso da KU Leuven. Em células endoteliais da córnea de bovino (BCEC), para junções de hiato funcionais e ambos são expressos lacuna juncional comunicação intercelular e comunicação intercelular parácrina contribuir significativamente para a c...

Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells at JoVE.com

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercelular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Ondas são conduzidos por canais de junção gap e hemichannels. Aqui, descrevemos um método para medir intercelular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Ondas em monocamadas de células em resposta a um estímulo mecânico de uma única célula local e sua aplicação a investigar as propriedades e regulação dos canais de junções gap e hemichannels.

A estimulação mecânica induzida por cálcio Propagação de Ondas em monocamadas de células: O Exemplo de Bovinos endotélio corneano

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagação de-tronco embrionárias humanas (ES) Células

Biologia

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Isolamento e expansão em grande escala de Adulto Humanos endotelial Colony Células Progenitoras Forming

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Estudo do citoesqueleto de actina em Live Células Endoteliais Expressando GFP-Actina

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Avaliação do cálcio Faíscas intactas fibras musculares esqueléticas

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Medindo o Coeficiente de Permeabilidade osmótica de água (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos planta isolada como um exemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

A quantificação da Adesividade celular endotelial<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...