Name: mechanical stimulation-induced calcium wave propagation in cell monolayers: the example of bovine corneal endothelial cells
Uploaded: 2013-07-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells at JoVE.com

El trabajo de investigación realizado en el laboratorio fue apoyado por becas de la Fundación de Investigación - Flandes (FWO, números de concesión G.0545.08 y G.0298.11), el Programa Interuniversitario Polos de atracción (Política Científica de Bélgica, el número de concesión P6/28 y P7/13) y está incrustado en una comunidad de investigación FWO apoyado. CDH es un becario posdoctoral de la Fundación de Investigación - Flandes (FWO). Los autores están muy agradecidos a todos los miembros actuales y anteriores del Laboratorio de Señalización Celular y Molecular (Universidad Católica de Lovaina), Dr. SP Srinivas (Escuela de Optometría de la Universidad de Indiana, EE.UU.), el laboratorio del Dr. Leybaert (Universidad de Gante) y de procedimientos Dr. Vinken (VUB), que proporcionó útil para los debates, optimizado o estuvieron involucrados en el desarrollo de herramientas para el estudio de hemichannels conexina.

1. Aislamiento de células endoteliales de la córnea Antes de empezar: Aislar las células de los ojos frescos, obtenidos de un matadero local, tan pronto como sea posible después de la enucleación del ojo. Asegúrese de que el ojo fue enucleado de una vaca de máximos de 18 meses, cinco minutos después de la autopsia y conservados en solución salina equilibrada de Earle - solución de yodo al 1% a 4 ° C para su transporte al laboratorio. <ol><li> Tome el ojo de solución salina equi...

En este manuscrito, se describe un método simple para medir intercelular Ca 2 + de propagación de la onda en monocapas de células endoteliales corneales bovinas primarias, proporcionando una estimulación mecánica localizada y controlada utilizando una micropipeta. Mecánicamente células estimuladas responden con un aumento local de IP intracelular 3 y Ca 2 +, ambos de los cuales son moléculas de señalización intracelulares esenciales que impulsan intercelular Ca 2 + en</sup...

La comunicación intercelular y la señalización son fundamentales para la coordinación de los procesos fisiológicos en respuesta a los agonistas extracelular en el tejido y 1,2 a nivel de todo el órgano. La forma más directa de comunicación intercelular es creada por la aparición de uniones. Gap cruces son las placas de los canales de salida brecha, que son canales proteicos formados por la cabeza a la cabeza de acoplamiento de dos (Cx) hemichannels conexina de células adyacentes 3,4 (Figura 1). Gap cruces permiten el paso de pequeñas moléculas de señalización con un peso molecular de menos de 1,5 kDa, incluyendo Ca 2 + o IP 3 5, causando y la modulación de Ca 2 +-liberación de los almacenes intracelulares de las células vecinas 6 (Figura 2). Canales de salida brecha están fuertemente regulados por intra e intermolecular interacciones de las proteínas y los procesos de señalización celular, como la modificación redox yfosforilación 7. Gjs facilitar la respuesta coordinada de células conectadas, actuando como un sincitio química y eléctrica. Por ejemplo, la propagación del potencial de acción cardíaco a través de los miocitos auriculares y ventriculares está mediada por canales GJ Cx basados ​​en 85. Cxs no sólo tienen un papel como canales de salida brecha, pero también forman hemichannels no apareados, de esta manera funcionarán como canales en las membranas de manera similar a los canales de iones regulares 8-10 (Figura 1). Hemichannels participan en la señalización paracrina entre las células vecinas mediante el control del intercambio de iones y moléculas de señalización entre el medio ambiente intra-y extracelular. En muchos tipos de células (como las células epiteliales, células osteoblásticas, astrocitos, células endoteliales, etc) y los órganos (como el cerebro, el hígado, la retina, cóclea y el sistema vascular), intercelular Ca 2 + olas son fundamentales para la coordinación de las respuestas multicelulares <sup&gt; 11. Los aumentos en intracelulares de Ca + niveles 2 en una determinada célula no se limitan a esta célula, pero se propagan a las células vecinas que rodean, estableciendo de ese modo un Ca intercelular 2 de la onda + 12,13. Estos intercelular Ca 2 +-ondas son importantes para la regulación fisiológica normal de las capas de células como un sincitio y su desregulación se ha asociado con los procesos fisiopatológicos 11. En el endotelio corneal y el epitelio, los diferentes grupos de 14-24, incluyendo la nuestra 25-33, estudiaron los mecanismos y las funciones de la comunicación intercelular. En células no excitables, como las células endoteliales de la córnea, dos modos distintos de la comunicación intercelular se producen 28,29, a saber brecha ocasiones la comunicación intercelular y la comunicación intercelular paracrina. Brecha ocasiones la comunicación intercelular implica un intercambio directo de moléculas de señalización a través de las uniones comunicantes 7. Gap juncla comunicación intercelular nal es crítico para mantener la homeostasis del tejido, el control de la proliferación celular, y el establecimiento de una respuesta sincronizada al estrés extracelular 10,34,35. En una serie de patologías, acoplamiento brecha de la salida se reduce debido a Cxs defectuosos, y por este medio que afecta brecha ocasiones la comunicación intercelular 36. Esto pone de relieve la importancia y la influencia de la brecha ocasiones la comunicación intercelular en los organismos multicelulares. En contraste con brecha ocasiones la comunicación intercelular, la comunicación intercelular paracrina no depende de la aposición de célula a célula, ya que implica la liberación de mensajeros extracelulares difusibles (Figura 2). Los diferentes tipos de moléculas de señalización se liberan en el espacio extracelular por señalización de células. La molécula se transporta a la célula diana donde se detecta por una proteína receptora específica. Posteriormente, el complejo receptor-señal induce una respuesta celular, que sese termina mediante la retirada de la señal, la inactivación o la desensibilización. Lipofílicas mensajeros de señalización extracelular Lanzamiento penetrar la membrana y actúan sobre los receptores intracelulares. En contraste, mensajeros hidrofílicos no atraviesan la membrana plasmática de la célula responder, sino que actúan como un ligando que se une a las proteínas del receptor expresado en la superficie, que luego se retransmiten la señal para el medio ambiente intracelular. Tres grandes familias de proteínas del receptor de la superficie celular que participen en este proceso: los canales iónicos-ligado, unido a enzima y la proteína G-vinculados. La molécula mensajera liberado puede actuar sobre los receptores de la misma célula (autocrina), sobre las células diana en estrecha proximidad (paracrina), o en las células diana distantes que requieren el sistema circulatorio (endocrina). En muchos tipos de células, incluyendo endotelio corneal 28,29, ATP es uno de los principales factores hidrófilos, paracrinos que impulsan la propagación de intercelular Ca 2 +-ondas 37-40. DurING deformación mecánica, la hipoxia, la inflamación o la estimulación por diversos agentes, el ATP puede ser liberado de las células sanas 41-44 en respuesta a la tensión de corte, estiramiento, o osmótica hinchazón 44,45. Diferentes mecanismos de ATP de liberación se han postulado, incluyendo exocitosis vesicular 44 y una plétora de mecanismos de transporte, tales como transportadores de unión a ATP de cassette (ABC), canales de aniones dependientes de voltaje plasmalemmal 46, P2X7 canales de los receptores de 47,48, así como conexina hemichannels 49-52 y pannexin hemichannels 43,49,53. ATP extracelular puede ser hidroliza rápidamente a ADP, AMP y adenosina 54,55 por ectonucleotidasas que están presentes en el medio ambiente extracelular. El ATP liberado extracelularmente y su metabolito ADP 56 se extenderán a través de la difusión. La posterior interacción de estos nucleótidos con los receptores purinérgicos en las células vecinas se ha implicado en la propagation de intercelular Ca 2 + olas 28,37,51. Dos clases diferentes de receptores purinérgicos están presentes: la adenosina es el principal ligando natural para P1-purinoceptores, mientras tanto purina (ATP, ADP) y la pirimidina (UTP, UDP) nucleótidos actúan en la mayoría de P2-purinoceptores 57. La comunicación intercelular puede ser investigado por diferentes métodos, tales como la carga de raspadura, la transferencia de tintes, uncaging local de los agonistas como IP 3 y Ca 2 +, la estimulación mecánica, etc. A continuación se describe el estudio de Ca 2 de propagación de la onda + provocada por la estimulación mecánica de una sola célula. La ventaja de estudiar Ca 2 de propagación de la onda + por estimulación mecánica es que proporciona una herramienta fácil de cuantificar la propagación de la Ca 2 de la onda + en el tiempo y que permite comparar cuantitativamente diferentes pretratamientos de las células. En el endotelio corneal, estos intercelular Ca 2 + olas permiten una corespuesta coordinada de la monocapa, por este medio que actúa como un posible mecanismo de defensa del endotelio corneal no regenerativa ayudar al endotelio para soportar tensiones extracelulares durante la cirugía intraocular, o tras la exposición a mediadores de la inflamación durante el rechazo inmunológico o uveítis 58,59.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Column1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14155-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodine</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>38060-1EA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>11960-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine (Glutamax)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>35050-038</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amphotericin-B</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A2942</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic-antimycotic mixture</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>15240-096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>25300-054</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14190-091</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-4 AM</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>F14217</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) </td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A265</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VI</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VII</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Control Peptide (SRGGEKNVFIV)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Two chambered glass slides</td>
 <td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)</td>
 <td>155380</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal microscope </td>
 <td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)</td>
 <td>LSM510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>P-280</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HVPZT-amplifier</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>E463 HVPZT-amplifier</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)</td>
 <td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA</td>
 <td>4878</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microelectrode puller </td>
 <td>Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)</td>
 <td>WZ DMZ-Universal Puller</td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
 </table>

mechanical stimulation-induced calcium wave propagation in cell monolayers: the example of bovine corneal endothelial cells

La comunicación intercelular es esencial para la coordinación de procesos fisiológicos entre las células en una variedad de órganos y tejidos, incluyendo el cerebro, el hígado, la retina, cóclea y la vasculatura. En la configuración experimental, intercelular Ca 2 +-ondas puede ser obtenido mediante la aplicación de un estímulo mecánico a una sola celda. Esto conduce a la liberación de las moléculas intracelulares de señalización IP 3 y Ca 2 + que iniciar la propagación de la Ca 2 de la onda + concéntricamente desde la célula estimulada mecánicamente a las células vecinas. Las principales vías moleculares que controlan intercelular Ca 2 de propagación de la onda + son proporcionados por los canales de salida brecha a través de la transferencia directa de IP 3 y hemichannels a través de la liberación de ATP. Identificación y caracterización de las propiedades y la regulación de diferentes conexina y isoformas pannexin como canales y hemichannels brecha de la salida son permitidas por el quantification de la propagación de la intercelular Ca 2 de la onda +, ARNsi, y el uso de inhibidores de canales y hemichannels brecha de la salida. Aquí, se describe un método para medir intercelular Ca 2 de la onda + en monocapas de células endoteliales corneales primarias cargado con Fluo4-AM en respuesta a un estímulo mecánico controlado y localizado provocado por una deformación aguda, de corta duración de la célula como resultado de tocar la membrana celular con una micropipeta de vidrio micromanipulador-controlado con un diámetro de la punta de menos de 1 m. También describe el aislamiento de células endoteliales corneales bovinas primarias y su uso como sistema modelo para evaluar la actividad Cx43-hemicanal como la fuerza impulsada por intercelular Ca 2 +-ondas a través de la liberación de ATP. Finalmente, se discute el uso, ventajas, limitaciones y alternativas de este método en el contexto del canal brecha de la salida y la investigación hemicanal.

Todos los experimentos se realizan en cumplimiento de todas las directrices, reglamentos y las agencias reguladoras y el protocolo que se está demostrado se lleva a cabo bajo la dirección y aprobación del cuidado de los animales y el empleo de la Universidad Católica de Lovaina. En las células endoteliales corneales bovinas (BCEC), uniones funcionales se expresan y ambos brecha ocasiones la comunicación intercelular y la comunicación intercelular paracrina contribuyen de manera signif...

Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells at JoVE.com

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercelular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las ondas son conducidas por canales y hemichannels brecha de la salida. Aquí se describe un método para medir intercelular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Ondas en monocapas de células en respuesta a un estímulo mecánico de una sola célula local y su aplicación para investigar las propiedades y la regulación de los canales y hemichannels brecha de la salida.

Mecánica estimulación inducida por calcio Propagación de Ondas en monocapas de células: el ejemplo de las especies bovina células endoteliales corneales

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagación de la madre embrionarias humanas (ES) Células

Investigación

Biología

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

El aislamiento y la expansión a gran escala de células humanas adultas Colonia progenitoras endoteliales formación

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Estudio del citoesqueleto de actina en vivo las células endoteliales que expresan GFP-actina

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Evaluación de calcio en Sparks intactas las fibras musculares esqueléticas

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Análisis de estrés oxidativo en embriones de pez cebra

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Medición de la osmótica de agua Coeficiente de Permeabilidad (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos de plantas aisladas como ejemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Aislamiento de las células murinas de la válvula endoteliales

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

La cuantificación de la adhesividad de la célula endotelial<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...