Name: mechanical stimulation-induced calcium wave propagation in cell monolayers: the example of bovine corneal endothelial cells
Uploaded: 2013-07-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells at JoVE.com

Forskningen utförs i laboratoriet har finansierats med bidrag från Research Foundation - Flandern (FWO, bidrag nummer G.0545.08 och G.0298.11), den Interuniversity sevärdhet polackerna Program (belgisk Science Policy, licensnummer P6/28 och P7/13) och är inbäddad i en FWO-stödd forskning community. CDH är en forskarassistent i Research Foundation - Flandern (FWO). Författarna är mycket tacksamma för alla nuvarande och tidigare medlemmar av Laboratoriet för molekylär och cellulär signalering (KU Leuven), dr SP Srinivas (Indiana University School of Optometri, USA), laboratoriet av Dr Leybaert (Ghent University) och Dr Vinken (VUB) som gav nyttiga diskussioner, optimerade rutiner eller var inblandade i utvecklingen av verktyg för studier av connexin hemichannels.

Ett. Isolering av hornhinnan endotelceller Innan du börjar: Isolera celler från friska ögon, som erhållits från ett lokalt slakteri, så snart som möjligt efter enucleating ögat. Se till att ögat var enukleation från en ko med maximalt 18 månader gammal, fem minuter efter slakt och bevaras i Earles Balanced Salt Solution - 1% jodlösning vid 4 ° C under transporten till laboratoriet. <ol><li> Ta ögat ur Earles balanserade saltlösning - 1% jodlösning och placera den i en petri...

I detta manuskript, beskriver vi en enkel metod för att mäta intercellulär Ca 2 +-vågutbredning i monoskikt av primära bovina korneala endotelceller genom att tillhandahålla en lokaliserad och kontrollerad mekanisk stimulering med användning av en mikropipett. Mekaniskt stimulerade celler reagerar med en lokal ökning av intracellulär IP 3 och Ca 2 +, båda av vilket är väsentliga intracellulära signalerande molekylar som driver intercellulär Ca 2 +-vågutbredning 11,67....

Kommunikationen mellan och signalering är avgörande för samordningen av fysiologiska processer som svar på extracellulära agonister vid vävnaden och hela-orgel nivån 1,2. Det mest direkta sättet att kommunikationen mellan skapas av förekomsten av kanalförbindelser. Kanalförbindelser är plack av kanaler gap junction, som är proteinhaltiga kanaler bildade av head-to-head dockning av två connexin (Cx) hemichannels av angränsande celler 3,4 (Figur 1). Kanalförbindelser tillåta passage av små signalmolekyler med en molekylvikt av mindre än 1,5 kDa, inklusive Ca 2 + eller IP 3 5, vilket leder till och modulera Ca2 +-frisättning från intracellulära förråd av de angränsande cellerna 6 (figur 2). Gap junction kanaler hårt reglerad av intra-och intermolekylära proteininteraktioner och cellulär signalering processer, liksom redox modifiering ochfosforylering 7. GJS underlätta ett samordnat svar på anslutna celler, och därmed utgöra en kemisk och elektrisk syncytium. Till exempel är spridningen av hjärtats aktionspotential över atriella och ventrikulära myocyter medieras av Cx-baserade GJ kanaler 85. CXS inte bara ha en roll som kanaler gap junction, men också bilda oparade hemichannels, fungerar därmed som kanaler i membran på samma sätt som vanliga jonkanaler 8-10 (Figur 1). Hemichannels deltar i parakrina signalering mellan angränsande celler genom att reglera utbytet av joner och signalmolekyler mellan intra-och extracellulära miljön. I många celltyper (såsom epitelceller, osteoblastceller, astrocyter, endotelceller, etc.) och organ (som hjärna, lever, retina, cochlea och kärlsystemet), intercellulär Ca2 +-vågorna är grundläggande för samordningen av flercelliga svar <sup&gt; 11. Ökningar i intracellulära Ca2 +-nivåer i en viss cell är inte begränsade till denna cell, men propagera till omgivande angränsande celler, varigenom det skapas en intercellulär Ca 2 +-våg 12,13. Dessa intercellulär Ca 2 +-vågor är viktiga för normal fysiologisk reglering av cellskikt som ett syncytium och deras dysreglering har associerats med patofysiologiska processer 11. I hornhinneendotel och epitel, studerade olika grupperna 14-24, inklusive vår egen 25-33, mekanismer och roller kommunikationen mellan. I icke-retbara celler, liksom hornhinnan endotelceller, två distinkta former av kommunikationen mellan inträffar 28,29, nämligen klyftan junktional kommunikationen mellan och parakrin kommunikationen mellan. Gap junktional kommunikationen mellan innebär ett direkt utbyte av signalmolekyler via gap junctions 7. Gap juncnella kommunikationen mellan är avgörande för att upprätthålla vävnad homeostas, kontrollerar celltillväxt, och inrättande av en synkroniserad svar på extracellulära stressen 10,34,35. I ett antal sjukdomar, är gap junction koppling reducerad på grund av defekta CXS, och härmed påverka gap junktional kommunikationen mellan 36. Detta understryker vikten och påverkan av gapet junktional intracellulär kommunikation i flercelliga organismer. I motsats till gap junktional kommunikationen mellan, är parakrin kommunikationen mellan inte beroende av cell-cell apposition, eftersom det involverar frisättning av diffunderbara extracellulära budbärare (Figur 2). Olika typer av signalerande molekyler frigörs i det extracellulära utrymmet genom att signalera celler. Molekylen transporteras sedan till målcellen där den detekteras av en specifik receptorprotein. Därefter receptor-signalen komplex inducerar ett cellulärt svar, somavslutas genom avlägsnande av signalen, inaktivering eller hyposensibilisering. Släppt lipofila extracellulära signalsystem budbärare penetrera membranet och agera på intracellulära receptorer. Däremot korsar hydrofila budbärare inte plasmamembranet hos den svarande cellen, men fungera som en ligand som binder till ytuttryckta receptorproteiner, som sedan vidarebefordrar signalen till intracellulära miljön. Tre stora familjer av cellyteproteiner proteiner deltar i denna process: jon-kanal-kopplad, enzym-linked, och G-protein-kopplade. Den släpptes Budbärarmolekylen kan agera på receptorer i samma cell (autokrin), på målceller i närheten (parakrint), eller på avlägsna målceller som kräver cirkulationssystemet (endokrin). I många celltyper, innefattande hornhinneendotel 28,29, är ATP en av de stora hydrofila, parakrina faktorer för förökning av intercellulär Ca 2 +-vågor 37-40. DurIng mekanisk deformation, hypoxi, inflammation eller stimulering av olika agenter, kan ATP frigöras från friska celler 41-44 som svar på skjuvspänning, stretch, eller osmotisk svullnad 44,45. Olika ATP-frigöringsmekanismer har förutsatts, inklusive vesikulär exocytos 44 och en uppsjö av transporttjänster mekanismer, såsom ATP-bindande kassett (ABC) transportörer, plasmalemmal spänningsberoende kanaler anjon 46, P2X7-receptorns 47,48, samt connexin hemichannels 49-52 och pannexin hemichannels 43,49,53. Extracellulär ATP kan vara snabbt hydrolyseras till ADP, AMP och adenosin 54,55 genom ectonucleotidases som är närvarande i den extracellulära omgivningen. Den extracellulärt släppt ATP och dess metabolit ADP 56 kommer att spridas genom diffusion. Den efterföljande interaktion av dessa nukleotider med purinerga receptorer i de angränsande cellerna har varit inblandad i propagation av intercellulär Ca 2 +-vågor 28,37,51. Två olika klasser av purinerga receptorer finns: adenosin är den främsta naturliga liganden för P1-purinoceptorer, medan både purin (ATP, ADP) och pyrimidin (UTP, UDP) nukleotider agera på de flesta P2-purinoceptorer 57. Kommunikationen mellan kan undersökas med olika metoder såsom skrapa lastning, fargöverföring, lokal uncaging av agonister som IP 3 och Ca 2 +, mekanisk stimulering, osv. Här beskriver vi studiet av Ca 2 +-vågutbredning framkallade genom mekanisk stimulering av en enda cell. Fördelen med att studera Ca2 +-vågutbredning genom mekanisk stimulering är att det ger ett enkelt verktyg för att kvantifiera spridningen av Ca2 +-våg över tid och det gör att kvantitativt jämföra olika förbehandlingar av cellerna. I hornhinnans endotel, dessa intercellulära Ca2 +-vågor tillåta en coordinated svar från monolagret, härmed fungerar som en möjlig försvarsmekanism i icke-regenerativ hornhinneendotel hjälper endotelet att motstå extracellulära påkänningar under intraokulär kirurgi, eller vid exponering för inflammatoriska mediatorer under immunavstötning eller uveit 58,59.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Column1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14155-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodine</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>38060-1EA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>11960-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine (Glutamax)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>35050-038</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amphotericin-B</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A2942</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic-antimycotic mixture</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>15240-096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>25300-054</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14190-091</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-4 AM</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>F14217</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) </td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A265</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VI</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VII</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Control Peptide (SRGGEKNVFIV)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Two chambered glass slides</td>
 <td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)</td>
 <td>155380</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal microscope </td>
 <td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)</td>
 <td>LSM510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>P-280</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HVPZT-amplifier</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>E463 HVPZT-amplifier</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)</td>
 <td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA</td>
 <td>4878</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microelectrode puller </td>
 <td>Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)</td>
 <td>WZ DMZ-Universal Puller</td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
 </table>

mechanical stimulation-induced calcium wave propagation in cell monolayers: the example of bovine corneal endothelial cells

Intercellulär kommunikation är avgörande för samordningen av fysiologiska processer mellan celler i olika organ och vävnader, inklusive hjärnan, lever, retina, cochlea och kärlsystemet. I experimentella inställningar, intercellulär Ca 2 +-vågor kan framkallas genom att applicera en mekanisk stimulans till en enda cell. Detta leder till frisättning av de intracellulära signalmolekyler IP 3 och Ca 2 + att initiera propagering av Ca 2 +-våg koncentriskt från den mekaniskt stimulerad cell till de angränsande cellerna. De huvudsakliga molekylära vägar som kontrollerar intercellular Ca2 +-vågutbredning tillhandahålls av kanaler gap junction genom direkt överföring av IP 3 och hemichannels genom frisättning av ATP. Identifiering och karaktärisering av egenskaper och regleringen av olika connexin och pannexin isoformer såsom kanaler gap junction och hemichannels tillåts av quantification för spridning av den intercellulära Ca 2 +-våg, siRNA, och användningen av inhibitorer av kanaler gap junction och hemichannels. Här beskriver vi en metod för att mäta intercellulär Ca 2 +-våg i monoskikt av primära korneala endotelceller laddad med Fluo4-AM som svar på ett kontrollerat och lokaliserad mekanisk stimulering som framkallats av en akut, kortvarig deformation av cellen som en följd av att peka på cellmembranet med en mikromanipulator kontrollerad glasmikropipett med en spets diameter av mindre än 1 | im. Vi beskriver också isoleringen av primära nötkreatur hornhinnan endotelceller och dess användning som modell för att bedöma Cx43-hemichannel aktivitet som den drivna kraft för intercellular Ca2 +-vågorna genom frisättning av ATP. Slutligen diskuterar vi användning, fördelar, begränsningar och alternativ av denna metod inom ramen för gap junction-kanal och hemichannel forskning.

Alla experiment utförs i enlighet med alla relevanta riktlinjer, föreskrifter och tillsynsmyndigheter och protokoll som demonstreras utförs under ledning och godkännande av djurets skötsel och användning kommitté av KU Leuven. I nötkreatur hornhinnans endotelceller (BCEC), är funktionella kanalförbindelser uttrycks och både lucka junktional kommunikationen mellan och parakrin kommunikationen mellan väsentligt bidra till kommunikationen mellan på ett interaktivt sätt, men det vi...

Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells at JoVE.com

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellulär Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Vågor drivs av kanaler gap junction och hemichannels. Här beskriver vi en metod för att mäta intercellulär Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Vågor i cellmonoskikten som svar på en lokal encelliga mekanisk stimulus och dess tillämpning för att undersöka egenskaperna och reglering av kanaler gap junction och hemichannels.

Mekanisk stimulering-inducerad Kalcium vågutbredning i cellmonoskikt: exemplet Nötkreatur hornhinnan endotelceller

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Spridning av mänskliga embryonala stamceller (ES-celler)

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Isolering och storskalig expansion av vuxen människa Endothelial kolonibildande progenitorceller

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Studie av Actin cytoskelettet i Live endotelceller uttrycka GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

I Intakta Skeletal Muscle Fibers Bedömning av Kalcium Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Analys av oxidativ stress i Zebrafish embryon

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Mätning av det osmotiska Vatten permeabilitetskoefficienten (P<sub&gt; F</sub&gt;) Av Sfäriska Celler: isolerade växtprotoplaster som exempel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av murint Ventil Endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Kvantifiering av endotelceller Vidhäftnings<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Högupplöst time-lapse avbildning och automatiserad analys av mikrotubuli Dynamics i Living Human navelsträngsvenendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...