Name: rnai-mediated double gene knockdown and gustatory perception measurement in honey bees (apis mellifera)
Uploaded: 2013-07-25T08:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier Erin Fennern pour aider expérience. Ce travail a été financé par le Conseil norvégien de la recherche (180504, 185306 et 191699), Pew Charitable Trust, et le National Institute on Aging (NIA P01 AG22500).

Partie 1: ARNi à médiation knockdown double gène 1. ARNds Synthèse <ol><li> amorces de conception d&#39;ARN double brin ciblant vg, USP et un gène codant pour la protéine de fluorescence verte de contrôle (GFP) qui n&#39;est pas à l&#39;abeille génome: amorces ont été conçues en utilisant le logiciel gratuit en ligne Primer3 ( <a href="http://frodo.wi.mit.edu/" target="_blank">http://frodo.wi.mit.edu/</a> ) . </li><li> synthèse ARN double brin pour vg, USP</...

<ol>
	<li>Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+Argonaute+proteins+in+small+RNA-directed+RNA+cleavage+pathways.">Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways.</a> Genes Dev. 18, 1655-1666 (2004).</li><li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+RNAi+for+the+masses.">Mammalian RNAi for the masses.</a> Trends Genet. 19, 9-12 (2003).</li><li>Huvenne, H., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+dsRNA+uptake+in+insects+and+potential+of+RNAi+for+pest+control:+a+review.">Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review.</a> J. Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).</li><li>Beye, M., Hartel, S., Hagen, A., Hasselmann, M., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+developmental+gene+silencing+in+the+honey+bee+using+a+homeobox+motif.">Specific developmental gene silencing in the honey bee using a homeobox motif.</a> Insect Mol. Biol. 11, 527-532 (2002).</li><li>Amdam, G. V., Simoes, Z. L., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+vitellogenin+gene+function+in+adult+honeybees+by+intra-abdominal+injection+of+double-stranded+RNA.">Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA.</a> BMC Biotechnol. 3, 1 (2003).</li><li>Patel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+a+queen:+TOR+pathway+governs+diphenic+caste+development.">The making of a queen: TOR pathway governs diphenic caste development.</a> PLoS ONE. 6, e509 (2007).</li><li>Amdam, G. V., Norberg, K., Page, R. E., Erber, J., Scheiner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+vitellogenin+gene+activity+increases+the+gustatory+responsiveness+of+honey+bee+workers+(Apis+mellifera).">Downregulation of vitellogenin gene activity increases the gustatory responsiveness of honey bee workers (Apis mellifera).</a> Behav. Brain Res. 169, 201-205 (2006).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+honey+bee+IRS+gene+biases+behavior+toward+food+rich+in+protein.">Down-regulation of honey bee IRS gene biases behavior toward food rich in protein.</a> PLoS Genet. 6, e1000896 (2010).</li><li>Wang, Y., Brent, C. S., Fennern, E., Amdam, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+perception+and+fat+body+energy+metabolism+are+jointly+affected+by+vitellogenin+and+juvenile+hormone+in+honey+bees.">Gustatory perception and fat body energy metabolism are jointly affected by vitellogenin and juvenile hormone in honey bees.</a> PLoS Genet. 8, e1002779 (2012).</li><li>Luna, B. M., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+dsRNA+into+Female+A.+aegypti+Mosquitos.">Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos.</a> J. Vis. Exp. (5), e215 (2007).</li><li>Mussig, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+disruption+of+the+NMDA+receptor+subunit+NR1+in+the+honeybee+brain+selectively+impairs+memory+formation.">Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation.</a> J. Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).</li><li>Stove, V., Smits, K., Naessens, E., Plum, J., Verhasselt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+gene+knock-down+by+a+single+lentiviral+vector+expressing+an+array+of+short+hairpin+RNAs.">Multiple gene knock-down by a single lentiviral vector expressing an array of short hairpin RNAs.</a> Electron J. Biotechnol. 19, 13 (2006).</li><li>Sun, D., Melegari, M., Sridhar, S., Rogler, C. E., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-miRNA+hairpin+method+that+improves+gene+knockdown+efficiency+and+provides+linked+multi-gene+knockdown.">Multi-miRNA hairpin method that improves gene knockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown.</a> Biotech. 41, 59-63 (2006).</li><li>Ament, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+ultraspiracle+influences+honey+bee+social+behavior+and+behavior-related+gene+expression.">The transcription factor ultraspiracle influences honey bee social behavior and behavior-related gene expression.</a> PLoS Genet. 8, e1002596 (2012).</li><li>Amdam, G. V., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hive+bee+to+forager+transition+in+honeybee+colonies:+the+double+repressor+hypothesis.">The hive bee to forager transition in honeybee colonies: the double repressor hypothesis.</a> J. Theor. Biol. 223, 451-464 (2003).</li><li>Pankiw, T., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+thresholds+to+sucrose+predict+foraging+division+of+labor+in+honeybees.">Response thresholds to sucrose predict foraging division of labor in honeybees.</a> Behav. Ecol. Sociobiol. 47, 265-267 (2000).</li><li>Pankiw, T., Nelson, M., Page, R. E., Fondrk, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+communal+crop:+modulation+of+sucrose+response+thresholds+of+pre-foraging+honey+bees+with+incoming+nectar+quality.">The communal crop: modulation of sucrose response thresholds of pre-foraging honey bees with incoming nectar quality.</a> Behav. Ecol. Sociobiol. 55, 286-292 (2004).</li><li>Jaycox, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+Changes+in+Worker+Honey+Bees+(Apis+mellifera+L.)+after+Injection+with+Synthetic+Juvenile+Hormone+(Hymenoptera:+Apidae).">Behavioral Changes in Worker Honey Bees (Apis mellifera L.) after Injection with Synthetic Juvenile Hormone (Hymenoptera: Apidae).</a> J. Kan. Entomol. Soc. 49, 165-170 (1976).</li><li>Jaycox, E. R., Skowronek, W., Guynn, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+changes+in+worker+honey+bees+(Apis+mellifera)+induced+by+injections+of+a+juvenile+hormone+mimic.">Behavioral changes in worker honey bees (Apis mellifera) induced by injections of a juvenile hormone mimic.</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 67, 529-534 (1974).</li><li>Scheiner, R., Pluckhahn, S., Oney, B., Blenau, W., Erber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+pharmacology+of+octopamine,+tyramine+and+dopamine+in+honey+bees.">Behavioural pharmacology of octopamine, tyramine and dopamine in honey bees.</a> Behav. Brain Res. 136, 545-553 (2002).</li><li>Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+juvenile+hormone+analogue+on+honey+bee+foraging+behaviour+and+alarm+pheromone+production.">Effects of a juvenile hormone analogue on honey bee foraging behaviour and alarm pheromone production.</a> J. Insect. Physiol. , 277-282 (1985).</li><li>Giurfa, M., Malun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+mechanosensory+conditioning+of+the+proboscis+extension+reflex+in+honeybees.">Associative mechanosensory conditioning of the proboscis extension reflex in honeybees.</a> Lear Memory. 11, 294-302 (2004).</li><li>Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+genotype,+foraging+role,+and+sucrose+responsiveness+on+the+tactile+learning+performance+of+honey+bees+(Apis+mellifera+L.).">The effects of genotype, foraging role, and sucrose responsiveness on the tactile learning performance of honey bees (Apis mellifera L.).</a> Neurobiol. Learn Mem. 76, 138-150 (2001).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDK1+and+HR46+gene+homologs+tie+social+behavior+to+ovary+signals.">PDK1 and HR46 gene homologs tie social behavior to ovary signals.</a> PLoS ONE. 4, e4899 (2009).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+behaviorally+associated+gene+networks+in+worker+honey+bee+ovaries.">Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honey bee ovaries.</a> J. Exp. Biology. 215, 124-134 (2012).</li><li>Amdam, G. V., Csondes, A., Fondrk, M. K., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+social+behaviour+derived+from+maternal+reproductive+traits.">Complex social behaviour derived from maternal reproductive traits.</a> Nature. 439, 76-78 (2006).</li><li>Amdam, G. V., Ihle, K. E., Page, R. E., Pfaff, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hormones, Brain and Behavio. , (2009).</li><li>Guidugli, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitellogenin+regulates+hormonal+dynamics+in+the+worker+caste+of+a+eusocial+insect.">Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect.</a> FEBS Letters. 579, 4961-4965 (2005).</li><li>Corona, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=juvenile+hormone,+insulin+signaling,+and+queen+honey+bee+longevity.">juvenile hormone, insulin signaling, and queen honey bee longevity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7128-7133 (2007).</li><li>Sinha, S., Ling, X., Whitfield, C. W., Zhai, C., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+scan+for+cis-regulatory+DNA+motifs+associated+with+social+behavior+in+honey+bees.">Genome scan for cis-regulatory DNA motifs associated with social behavior in honey bees.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16352-16357 (2006).</li><li>Amdam, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+control+of+the+yolk+precursor+vitellogenin+regulates+immune+function+and+longevity+in+honeybees.">Hormonal control of the yolk precursor vitellogenin regulates immune function and longevity in honeybees.</a> Exp. Gerontol. 39, 767-773 (2004).</li><li>Wang, Q. C., Nie, Q. H., Feng, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference:+antiviral+weapon+and+beyond.">RNA interference: antiviral weapon and beyond.</a> World J. Gastroenterol. 9, 1657-1661 (2003).</li><li>Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Argonaute+family:+tentacles+that+reach+into+RNAi,+developmental+control,+stem+cell+maintenance,+and+tumorigenesis.">The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis.</a> Genes Dev. 16, 2733-2742 (2002).</li><li>Hunt, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+genomics+of+honeybee+foraging+and+nest+defense.">Behavioral genomics of honeybee foraging and nest defense.</a> Naturwissenschaften. 94, 247-267 (2007).</li><li>Pankiw, T., Waddington, K. D., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+sucrose+response+thresholds+in+honey+bees+(Apis+mellifera+L.):+influence+of+genotype,+feeding,+and+foraging+experience.">Modulation of sucrose response thresholds in honey bees (Apis mellifera L.): influence of genotype, feeding, and foraging experience.</a> J. Comp. Physiol. A. 187, 293-301 (2001).</li><li>Pankiw, T., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pheromones,+hormones,+and+handling+on+sucrose+response+thresholds+of+honey+bees+(Apis+mellifera+L.).">Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.).</a> J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 189, 675-684 (2003).</li></ol>

Notre étude est la première tentative de frapper simultanément sur les deux gènes chez les insectes adultes. Nos résultats montrent que les deux stratégies d&#39;ARN double brin injections (une seule injection et l&#39;injection de deux jours) sont efficaces pour la répression du gène double, et gene silencing simultanée de VG et USP peuvent être testés 6 jours après les injections ARN double brin dans les abeilles 8,9. Cependant, le gène knockdown efficacité varie selon les es...

L&#39;interférence ARN (ARNi) est gene silencing post-transcriptionnelle basée sur l&#39;ARN, qui se produit dans une grande variété d&#39;organismes eucaryotes. Le processus de RNAi est déclenchée par l&#39;ARN (ARNdb) précurseurs bicaténaires endogènes ou exogènes. L&#39;ARN double brin active la protéine Dicer de ribonucléase qui lie et clive l&#39;ARN double brin en petits fragments (20-25 pb). Ensuite, les petits fragments d&#39;ARN double brin le guide la reconnaissance et le clivage d&#39;ARNm complémentaires par les protéines Argonaute, un composant catalytique de complexe RNA-induced silencing (RISC) 1. Chez les mammifères, ARNdb plus de 30 nt, activent une réponse antivirale (réponse interféron, IFN), qui conduit à une dégradation non spécifique des ARN transcrits 2. Cependant, à long ARN double brin sont avérées efficaces et spécifiques chez les insectes car il ya un manque de ce IFN 3. Longs ARNdb ont été utilisés pour la régulation négative des gènes cibles de différentes espèces d&#39;insectes. Les abeilles sont l&#39;un des pionorganismes EER d&#39;insectes dans lequel les fonctions de nombreux gènes importants dans le développement et le comportement ont été révélés en utilisant l&#39;ARN double brin 4,5. Plusieurs méthodes de livraison ARNdb ont été réalisées chez les abeilles: ARNds alimentation régule négativement efficacement l&#39;expression du gène cible en larves d&#39;abeilles 6, alors que l&#39;injection ARNdb est une approche efficace pour inactivation génique dans le miel embryons d&#39;abeille 4 et les abeilles adultes 7,8. effets knockdown de gènes exposées en appliquant ARN double brin pour les insectes sont transitoires et localisée. Des études ont montré que les injections d&#39;ARN double brin abdominaux et les injections de ARNds thoraciques réprimer efficacement l&#39;expression du gène cible dans les cellules du corps de graisse abdominale d&#39;insectes 9,10. ARNdb est injecté dans les cavités abdominales et thoraciques et des cellules de graisse corporelle sont en mesure de prendre l&#39;ARNdb de l&#39;hémolymphe où les cellules sont baignées 10. Toutefois, les gènes dans d&#39;autres organes, tels que les ovaires et le cerveau, ne peuvent pas être ciblés par l&#39;une desinjections abdominales ou thoraciques. Afin de cibler des gènes dans le cerveau d&#39;abeille, l&#39;injection du cerveau de l&#39;ARN double brin a également été réalisée, ce qui influence de manière efficace l&#39;expression d&#39;un gène cible dans des zones du cerveau locaux 11. Ici, nous ne documentons injection d&#39;ARN double brin abdominale qui est plus couramment utilisé dans les abeilles adultes. RNAi a été principalement utilisé pour cibler un gène unique et a été un outil puissant pour révéler la fonction des gènes. Cependant, n&#39;importe quel gène n&#39;est pas isolé des autres, c&#39;est dans les réseaux de régulation complexes. Une clé pour comprendre un processus biologique consiste à disséquer la façon dont les gènes interagissent les uns avec les autres, ce qui nécessite des manipulations simultanées de gènes multiples plutôt qu&#39;un seul inactivation génique. Dans les lignées cellulaires de mammifères, les scientifiques ont réussi à inhiber simultanément deux ou trois gènes en utilisant des systèmes de livraison de 12 ou multi-microARN (miARN) conçoit en épingle à cheveux 13. Mais chez les insectes, plusieurs passes rabattues de gènes sont encore testés. Ici, nous présentastratégies t d&#39;injection différents, qui peuvent atteindre un effet de choc à double gène. Nous ciblons deux gènes: vitellogénine (VG) qui code pour une protéine précurseur jaune et ultraspiracle (USP) qui code pour un récepteur putatif de l&#39;hormone juvénile (JH) et peut servir comme un facteur de transcription médiation des réponses à JH 14 chez les abeilles. Vg et JH régulent mutuellement dans une boucle de rétroaction 15 et sont impliqués dans la régulation du comportement abeille 9. En utilisant la double inactivation génique, nous perturbent à la fois Vg et les voies JH, et découvrez comment ils affectent conjointement le comportement des abeilles et de la physiologie et comment vg, USP et JH interagissent 9. Perception gustative est un facteur prédictif du comportement des abeilles mellifères comportement social 16. En termes de développement, de comportement des abeilles nid avec grande perception gustative comportemental rapides maturité, et généralement fourragères tôt dans la vie et préfèrent recueillir le pollen 16,17. Bien que la réglementation mECANISMES qui sous-tendent la perception gustative sont encore peu claires, des études ont montré que la perception gustative est liée à métabolismes internes d&#39;énergie 9, la sécrétion hormonale 18,19 et biogénétique amine voies 20. Les deux Vg et JH sont des régulateurs hormonaux importants moduler la perception gustative 7,21. En laboratoire, une variation de la perception gustative chez les abeilles peut être évaluée en testant la réponse extension du proboscis (PER) de différentes solutions de saccharose. Chaque abeille est testé par toucher son deux antennes avec une goutte d&#39;eau suivie d&#39;une série ascendante de concentration de 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% de saccharose. Une réponse positive est à noter si une abeille s&#39;étend pleinement ses trompe quand une goutte d&#39;eau ou saccharose est touché à chaque antenne. Basé sur le nombre de réponses positives aux solutions, le niveau de perception gustative de chaque individu peut être déterminé 16. Toutefois, l&#39;application de la PER ne se limite pas à la mesure de gperception ustatory. Le PER est aussi une méthode efficace pour tester l&#39;état métabolique des abeilles tels que la satiété contre la faim. Les abeilles avec des réponses plus au saccharose ont plus faim en général (Wang et Amdam, données non publiées). Par ailleurs, le paradigme PER peut également être utilisé dans l&#39;apprentissage associatif et de la mémoire chez les abeilles. Dans ce cas, les abeilles seront formés à associer la présence d&#39;eau de saccharose avec une odeur. Quand les abeilles apprennent l&#39;association, seule la présence de l&#39;odeur peut susciter une réaction de trompe positif sans les récompenser avec le saccharose 22,23. Dans cette vidéo, nous montrons comment réaliser PER d&#39;évaluer la perception gustative qui a été connecté avec vg et usp à double effet de choc dans une étude précédente 9.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GE Healthcare PCR beads in 96 well plate</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27-9557-01</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>RiboMax T7 RNA production system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trizol LS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hamilton micro syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80301</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>30G BD disposable needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1 ml Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>30960</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereo dissection microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>S6D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26000-25</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Wax plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

rnai-mediated double gene knockdown and gustatory perception measurement in honey bees (apis mellifera)

Cette vidéo montre les nouvelles techniques de l&#39;interférence ARN (ARNi), qui régulent à la baisse deux gènes simultanément dans les abeilles en utilisant l&#39;ARN (l&#39;ARN double brin) injections double brin. Il présente également un protocole de réponse d&#39;extension du proboscis (PER) d&#39;essai pour mesurer la perception gustative. Inactivation génique médiée par ARNi est une technique efficace la régulation négative de l&#39;expression du gène cible. Cette technique est généralement utilisée pour la manipulation d&#39;un seul gène, mais il a ses limites pour détecter les interactions et les effets conjoints entre les gènes. Dans la première partie de cette vidéo, nous vous présentons deux stratégies pour frapper simultanément sur les deux gènes (appelées knockdown double gène). Nous montrons les deux stratégies sont en mesure de réprimer efficacement deux gènes, vitellogénine (VG) et ultraspiracle (USP), qui sont dans une boucle de rétroaction réglementaire. Cette approche knockdown double gène peut être utilisé pour disséquer les interrelations entre les gènes et peut être facilement appliqué dansdifférentes espèces d&#39;insectes. La deuxième partie de cette vidéo est une démonstration de l&#39;extension réponse dosage trompe (PER) chez les abeilles après le traitement de knockdown double gène. Le test PER est un test standard pour mesurer la perception gustative chez les abeilles, qui est un indicateur clé de la rapidité de maturation sur le comportement des abeilles est. Grand perception gustative des abeilles nid indique le développement comportemental augmenté, ce qui est souvent associée à un plus jeune âge au début de la recherche de nourriture et d&#39;alimentation spécialisation dans le pollen. En outre, par essai peut être appliqué à identifier les états métaboliques de satiété ou de faim chez les abeilles. Enfin, par dosage combiné avec appariement différents stimuli odorants pour le conditionnement des abeilles est également largement utilisé pour les études de l&#39;apprentissage et la mémoire chez les abeilles.

Tant les deux jours de l&#39;injection stratégies mono-injection et réduit de façon significative vg (One-way ANOVA, p &lt;0,001) (figure 2A) et l&#39;USP (One-way ANOVA, p &lt;0,001) (figure 2B) les niveaux de transcription chez les abeilles six jours après l&#39;ARNdb a été injecté. La suppression de l&#39;USP transcription en utilisant l&#39;injection unique avec un mélange ARN double brin et l&#39;injection de deux jours avec vg premier et...

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RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

Dans ce protocole, nous décrivons deux stratégies qui suppriment simultanément deux gènes (knockdown double gène) chez les abeilles. Ensuite, nous présentons comment utiliser la réponse d&#39;extension trompe (PER) d&#39;analyse pour étudier l&#39;effet de knockdown double gène sur Honey Bee perception gustative.

ARNi médiée double inactivation génique et de mesure de la perception gustative chez les abeilles (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

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Double fluorescence In situ</emHybridation> dans des coupes de cerveau frais

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Recherche

Neurosciences

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

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Pharmacologie comportementale dans le conditionnement classique de la réponse Extension Proboscis chez les abeilles ( Apis mellifera)

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Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

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Conditionnement tactile et d&#39;analyse des mouvements des stratégies d&#39;échantillonnage antennaires chez les abeilles (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

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Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

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Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Microélectrodes à double canon et concentrique pour la mesure de signaux extracellulaires Ion dans le tissu cérébral

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

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A Novel Behavioral Assay d&#39;enquêter sur les réponses gustatifs de l&#39;individu, Librement-mobiles Bumble Bees (<em&gt; Bombus terrestris</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Manipulation neuropharmacologiques de Restrained et vol libre abeilles,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...