Name: prostaglandin extraction and analysis in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2013-06-25T13:00:00
Duration: 8 min 50 s
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हम UAB त्वचा रोग अनुसंधान केंद्र (सी. Elmets को P30 AR050948), UAB-UCSD ओ ब्रायन तीव्र गुर्दे की चोट केंद्र (P30 DK079337 ए अग्रवाल करने के हिस्से में समर्थित किया गया है जो UAB लक्षित Metabolomics और प्रोटिओमिक्स प्रयोगशाला, धन्यवाद ) और UAB फेफड़े स्वास्थ्य केंद्र (R01 HL114439, R01 HL110950 जेई Blalock के लिए). मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए समर्थन एक NCRR साझा इंस्ट्रुमेंटेशन अनुदान (एस बार्न्स को S10 के RR19261) से था. हम भी तकनीकी सहायता के लिए रे मूर धन्यवाद. सी. एलिगेंस उपभेदों NIH द्वारा वित्त पोषित है जो Caenorhabditis जेनेटिक्स सेंटर द्वारा प्रदान किया गया. इस काम एनआईएच (एक ARRA के प्रशासनिक पूरक सहित R01GM085105 को MAM,) द्वारा समर्थित किया गया था.

<ol>
	<li>Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+synthesis+and+adiposity+regulation+in+Caenorhabditis+elegans.">Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans.</a> Trends Endocrinol. Metab. 20, 58-65 (2009).</li><li>Marza, E., Lesa, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyunsaturated+fatty+acids+and+neurotransmission+in+Caenorhabditis+elegans.">Polyunsaturated fatty acids and neurotransmission in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Soc. Trans. 34, 77-80 (2006).</li><li>Edmonds, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin/FOXO+signaling+regulates+ovarian+prostaglandins+critical+for+reproduction.">Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction.</a> Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).</li><li>Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+maternal+phospholipid+composition+and+IP(3)-dependent+embryonic+membrane+dynamics+by+a+specific+fatty+acid+metabolic+event+in+C.+elegans.">Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans.</a> Genes Dev. 26 (3), 554-566 (2012).</li><li>Kosel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eicosanoid+formation+by+a+cytochrome+P450+isoform+expressed+in+the+pharynx+of+Caenorhabditis+elegans.">Eicosanoid formation by a cytochrome P450 isoform expressed in the pharynx of Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. J. 435, 689-700 (2011).</li><li>Kubagawa, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+signals+derived+from+polyunsaturated+fatty+acids+control+sperm+recruitment+in+vivo.">Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo.</a> Nat Cell Biol. 8, 1143-1148 (2006).</li><li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473, 226-229 (2011).</li><li>Gerisch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bile+acid-like+steroid+modulates+Caenorhabditis+elegans+lifespan+through+nuclear+receptor+signaling.">A bile acid-like steroid modulates Caenorhabditis elegans lifespan through nuclear receptor signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5014-5019 (2007).</li><li>Edison, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+pheromones+regulate+multiple+complex+behaviors.">Caenorhabditis elegans pheromones regulate multiple complex behaviors.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 378-388 (2009).</li><li>Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandins+and+leukotrienes:+advances+in+eicosanoid+biology.">Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology.</a> Science. 294, 1871-1875 (2001).</li><li>Wang, D., Dubois, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eicosanoids+and+cancer.">Eicosanoids and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 10, 181-193 (2010).</li><li>Cha, Y. I., Solnica-Krezel, L., DuBois, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+prostanoids:+deciphering+the+developmental+functions+of+cyclooxygenase-derived+prostaglandins.">Fishing for prostanoids: deciphering the developmental functions of cyclooxygenase-derived prostaglandins.</a> Dev. Biol. 289, 263-272 (2006).</li><li>Hata, A. N., Breyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacology+and+signaling+of+prostaglandin+receptors:+multiple+roles+in+inflammation+and+immune+modulation.">Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: multiple roles in inflammation and immune modulation.</a> Pharmacol. Ther. 103, 147-166 (2004).</li><li>Sugimoto, Y., Narumiya, S., Ichikawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+function+of+prostanoid+receptors:+studies+from+knockout+mice.">Distribution and function of prostanoid receptors: studies from knockout mice.</a> Prog. Lipid Res. 39, 289-314 (2000).</li><li>Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoprostanes:+novel+bioactive+products+of+lipid+peroxidation.">Isoprostanes: novel bioactive products of lipid peroxidation.</a> Free Radic. Res. 38, 105-122 (2004).</li><li>Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heterogenous+mixture+of+F-series+prostaglandins+promotes+sperm+guidance+in+the+C.+elegans+reproductive+tract.">A heterogenous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the C. elegans reproductive tract.</a> PLoS Genetics. 9 (1), e1003271 (2013).</li><li>Golovko, M. Y., Murphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+LC-MS/MS+procedure+for+brain+prostanoid+analysis+using+brain+fixation+with+head-focused+microwave+irradiation+and+liquid-liquid+extraction.">An improved LC-MS/MS procedure for brain prostanoid analysis using brain fixation with head-focused microwave irradiation and liquid-liquid extraction.</a> J. Lipid Res. 49, 893-902 (2008).</li><li>Murphy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+and+tandem+mass+spectrometry+of+eicosanoids.">Electrospray ionization and tandem mass spectrometry of eicosanoids.</a> Anal. Biochem. 346, 1-42 (2005).</li><li>Milne, G. L., Yin, H., Morrow, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+biochemistry+of+the+isoprostane+pathway.">Human biochemistry of the isoprostane pathway.</a> J. Biol. Chem. 283, 15533-15537 (2008).</li><li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes.">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chem. Biodivers. 5, 2431-2441 (2008).</li><li>Kulas, J., Schmidt, C., Rothe, M., Schunck, W. H., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450-dependent+metabolism+of+eicosapentaenoic+acid+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Cytochrome P450-dependent metabolism of eicosapentaenoic acid in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Arch. Biochem. Biophys. 472, 65-75 (2008).</li><li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+polyunsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).</li></ol>

लेखक ब्याज की कोई संघर्ष है.

हम एफ श्रृंखला पीजीएस पर ध्यान केंद्रित, eicosanoid निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. समस्याग्रस्त हो सकता है कि प्रक्रिया के कई हिस्से हैं. सबसे पहले, यह भुखमरी पीजी चयापचय को बदल सकते हैं के रूप में कीड़ा संस्कृतियों, भूखा नहीं है कि महत्वपूर्ण है. NA22 उच्च घनत्व पहुंचता है क्योंकि पूरक खिलाने के लिए, NA22 बैक्टीरिया के बजाय और आमतौर पर इस्तेमाल OP50 बैक्टीरिया की सिफारिश कर रहे हैं. हालांकि, NA22 तनाव एंटीबायोटिक प्रतिरोध का अभाव है और संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील है. दूसरा, कीड़े स्तनधारी ऊतकों के सापेक्ष कम बहुतायत में व्यक्तिगत पीजी आइसोमरों synthesize. इस भाग में कई isomers के बीच अतिरेक के कारण हो सकता है. हम व्यापक विश्लेषण और मजबूत संकेतों के लिए ऊतक के बारे में 6 ग्राम की सलाह देते हैं. सूखे निकालने कम मेथनॉल में resuspended है तो कम ऊतक (1-2 ग्राम) का उपयोग किया जा सकता है: पानी के घोल पीजी एकाग्रता बढ़ाने के लिए. हालांकि, केवल एक से दो इंजेक्शन प्रदर्शन किया जा सकता है. हमारे LC-MS/MS प्रणाली का पता लगाने सीमा 10 स्नातकोत्तर के बारे में हैPGF 2α / एमएल. घनी पैक मिश्रित चरण कीड़े की एक मिलीलीटर (लगभग 1 ग्राम) CePGF2 के लगभग 25-50 स्नातकोत्तर पैदावार. अधिक संवेदनशील मास स्पेक्ट्रोमेट्री सिस्टम विश्लेषण के लिए आवश्यक कीड़ा ऊतक की मात्रा को कम कर सकते हैं. तीसरा, नमूनों के बीच पीजी निकासी दक्षता में मतभेद चर परिणाम हो सकते हैं. हम निकासी दक्षता ऊतकों समानांतर में निकाले जाते हैं जब इसी तरह की है कि मिल गया है. दक्षता का निर्धारण करने के लिए, एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में homogenization के कदम पर PGF 2α घ 4 से 1.0 एनजी जोड़ें. एम आर एम मी / z 357/197 एक 1 एनजी / एमएल मानक समाधान के सापेक्ष PGF 2α-D4 एकाग्रता को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है बड़े पैमाने पर संक्रमण का उपयोग कर. निकासी के दौरान खो PGF 2α घ 4 की राशि तो गणना की जाती है. हम शामिल क्रोमैटोग्राफी मापदंडों और बड़े पैमाने पर बदलाव अन्य पीजीएस और eicosanoids पता लगाने के लिए बदला जा सकता है. काफी प्रयास के बावजूद, हम डी सीरीज या ई सेवाओं की पहचान करने में सक्षम नहीं किया गया हैएँ अर्क 17 में पृ. इसके अलावा, हम 8 आईएसओ PGF 2α और पीजी stereoisomers 19 की एक nonselective मिश्रण उत्पन्न करता है जो मुक्त कणों द्वारा शुरू किए peroxidation, की विशेषता है कि 8 आईएसओ पीजीई 2 का पता नहीं है. कीड़े अन्य पीजी प्रकार synthesize ज्ञात नहीं है. Endocannabinoids और arachidonic और eicosapentaenoic एसिड के विभिन्न epoxy और हाइड्रोक्सी मेटाबोलाइट्स सी में पाया गया है एलिगेंस 5,7,20,21 निकालता है. हम क्रमशः मात्रा का ठहराव और पहचान के लिए प्रामाणिक मानकों की तुलना में एम आर एम और एमएस / एमएस दोनों के उपयोग की सलाह देते हैं. उपन्यास eicosanoids के लिए, इन विश्लेषण संभव हो तो, एंजाइमों 22, साथ ही एक कार्यात्मक परख synthesizing PUFA में कमी कर रहे हैं, जो वसा म्यूटेंट, का एक तुलनात्मक अध्ययन के साथ जोड़ा जाना चाहिए. वसा म्यूटेंट का विश्लेषण करने के लिए एक चेतावनी है कि कीड़े में मौजूद PUFAs की मात्रा मिनट पीजी संश्लेषण के लिए पर्याप्त हैं. उदाहरण के लिए, वसा -2 (wa17) म्यूटेंटडी 12 desaturase गतिविधि की एक छोटी राशि (~ 5 जंगली प्रकार की 22%) और इन म्यूटेंट अभी पीजीएस 6 का उत्पादन. वसा 3 (wa22) और वसा -4 (WA14) म्यूटेंट arachidonic और eicosapentaenoic एसिड 16 से व्युत्पन्न पीजीएस synthesize करने में विफल है . हम यह भी वसा म्यूटेंट शेष वर्गों से ऊपर विनियमन पीजी संश्लेषण द्वारा PUFA वर्गों के नुकसान की भरपाई के लिए मिल गया है. उदाहरण के लिए, वसा 3 (wa22) म्यूटेंट 20 कार्बन PUFAs से निकाली गई सबसे पीजीएस synthesize करने में विफल. इसके बजाय, वे 18 कार्बन PUFAs 16 से व्युत्पन्न उपन्यास पीजीएस अप विनियमित करने के लिए दिखाई देते हैं. तिथि करने के लिए, हम एक सी. पहचान नहीं है पीजी संश्लेषण में पूरी तरह से कमी है कि एलिगेंस तनाव. यह पीजीएस विकास या विकास के लिए आवश्यक हैं कि संभव है.

Prostaglandins (पीजीएस) बड़े पैमाने पर जांच की और जीवों 12-14 की एक विस्तृत सरणी में प्रजनन, प्रतिरक्षा, और विकास को विनियमित करने में शामिल किया गया है कि लिपिड हार्मोन का एक महत्वपूर्ण वर्ग के हैं. वे एक आम अग्रदूत (एस) से प्राप्त लिपिड की एक श्रृंखला शामिल है क्योंकि पीजीएस आदर्श व्यापक जीव विज्ञान प्रणाली विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं. निमेटोड सी. एलिगेंस आनुवंशिकी और प्रणालियों जीव विज्ञान में मौलिक सवालों का पता करने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल जीवों में से एक है. हमने दिखा दिया है कि सी. एलिगेंस एफ श्रृंखला पीजीएस synthesizes कि oocytes 3,6,16 को गतिशील शुक्राणु गाइड. क्रमश: तीन, चार, और पांच डबल बांड, एफ 1 शामिल हैं, F2, और F3 वर्गों, साथ 20 कार्बन PUFAs से व्युत्पन्न एफ श्रृंखला पीजीएस 3,16 पहचान की गई है. ये पीजीएस cyclooxygenase एंजाइमों की स्वतंत्र संश्लेषित, अभी तक PGF 1α और PGF 2α stereoisomers अभी जीई हैंnerated. सी. के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एलिगेंस पीजीएस, LC-MS/MS एक शक्तिशाली और संवेदनशील विश्लेषणात्मक तकनीक है. इस विश्लेषण के प्रदर्शन से पहले, यह विश्लेषणात्मक प्रक्रिया का प्रदर्शन भारी निकालने की गुणवत्ता पर निर्भर करता है क्योंकि एक अनुकूलित निष्कर्षण विधि विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है. लिक्विड क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री ही अनुपात (मी / z) चार्ज करने के लिए प्रत्याशित बड़े पैमाने पर है, साथ ही पीजी जनक आयन की वांछनीय शिखर आकार और अवधारण समय प्रदान कर सकते हैं. सी. में पीजीएस की मेटाबोलिक रूपरेखा एलिगेंस विभिन्न एमएस अधिग्रहण रणनीतियों की आवश्यकता होती है एक चुनौती भरा काम है. नियंत्रण रेखा एमएस पूर्ण स्कैन या सर्वेक्षण स्कैनिंग (Q1 में स्कैनिंग) कि सबसे ionizable पीजीएस एक बड़े पैमाने पर spectrometric प्रतिक्रिया उत्पन्न होगा सुनिश्चित करने का फायदा है. सर्वेक्षण स्कैन जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती सी. के संबंध में पीजीएस की कुल रूपरेखा पर उपयोगी जानकारी प्रदान करता है एलिगेंस, नाबालिग पीजीएस का पता लगाने के कम संवेदनशीलता की वजह से समझौता किया है. Nevertheकम, नियंत्रण रेखा एमएस सर्वेक्षण स्कैनिंग पीजीएस की एक वैश्विक दृष्टि दे और एक बड़े पीजी आबादी के उपापचय को प्रभावित करने के लिए भविष्यवाणी म्यूटेंट का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है सकते हैं. Metabolite पहचान में, रासायनिक संश्लेषित पीजी मानकों के LC-MS/MS विश्लेषण पहला संदर्भ यौगिकों के रूप में अपने उत्पाद आयन स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए किया जाता है. ये स्पेक्ट्रा एक अज्ञात metabolite के स्पेक्ट्रम की तुलना में किया जा सकता है. एकाधिक प्रतिक्रिया की निगरानी (एम आर एम) मोड बढ़ाया संवेदनशीलता और विशिष्टता के लिए प्रयोग किया जाता है. एक एम आर एम प्रयोग एक परिसर के माता - पिता आयन / उत्पाद आयन जन संक्रमण निर्दिष्ट करने के द्वारा पूरा किया है. लक्ष्य analytes की मात्रा और संरचना जानने के द्वारा, यह कई अज्ञात मेटाबोलाइट्स के लिए सैद्धांतिक एम आर एम बदलाव की भविष्यवाणी करना संभव है. सी. में समाजिक पीजीएस रूपरेखा के लिए एक अनुकूलित LC-MS/MS विधि एलिगेंस रिपोर्ट नहीं दी है. यहाँ हम नियंत्रण रेखा के एमएस और से मिलकर एक निष्कर्षण और एकीकृत मास स्पेक्ट्रोमेट्री दृष्टिकोण का वर्णन नियंत्रण रेखा, का पता लगाने बढ़ाता, और सी की जांच के लिए एमएस / एमएस तरीकों एलिगेंस पीजी मेटाबोलाइट्स. यह दृष्टिकोण अन्य eicosanoids के लिए लागू किया जा सकता है.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-large (16 cm) plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875714</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain NA22</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>NA22</td>
			<td><a href="http://www.cgc.cbs.umn.edu" target="_blank">http://www.cgc.cbs.umn.edu</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone, 399.5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A928-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butylated Hydroxytoluene</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>101162</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H302-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid, 399%</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC27048-0010</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC26832-0010</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGF2&alpha;-d4</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>316010</td>
			<td>Cayman has a wide array of standards available for purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile screw cap self-standing 5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-651</td>
			<td>For use with Bullet Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm zirconium oxide beads</td>
			<td>Next &gt;&gt;&gt; Advance</td>
			<td>ZrOB05</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes</td>
			<td>Kimble Kimax</td>
			<td>45200-10</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml glass conical tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>8082-15</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmacote (Siliconizing reagent)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SL2-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V1235C-TFE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentraSL2 Clinical Centrifuge</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>2517N92-TS</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender 5 blue homogenizer</td>
			<td>Next &gt;&gt;&gt; Advance</td>
			<td>BBY5MB</td>
			<td>A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergi 4 &mu;m Hydro-RP 80 &Aring; LC Column 250 x 2.0 mm</td>
			<td>Phenomenenex</td>
			<td>00G-4375-B0</td>
			<td>HPLC Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm</td>
			<td>Phenomenenex</td>
			<td>AJ0-7510</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecurityGuard Guard Cartridges Kit</td>
			<td>Phenomenenex</td>
			<td>KJ0-4282</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler</td>
			<td>Shimadzu Scientific Instruments, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API 4000 triple quadrupole mass spectrometer</td>
			<td>Applied Biosystems/MDS SCIEX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="2">M9 buffer recipe (4 liter)</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>12 g</td>
						<td>KH2PO4</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>24 g</td>
						<td>Na2HPO4</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>20 g</td>
						<td>NaCl</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Up to 4 liter</td>
						<td>Deionized water</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">Aliquot to eight 1 liter bottles. Autoclave and cool.</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>0.5 ml/bottle</td>
						<td>1 M MgSO4</td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

prostaglandin extraction and analysis in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis एलिगेंस लिपिड 1-9 की जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली पशु मॉडल के रूप में उभर रहा है. Prostaglandins पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड (PUFAs) 10-14 से व्युत्पन्न लिपिड संकेत हैं जो eicosanoids के एक महत्वपूर्ण वर्ग के हैं. ये संकेतन अणुओं की वजह से उनके कम बहुतायत और प्रतिक्रियाशील प्रकृति का अध्ययन करने के लिए मुश्किल हैं. प्रास्टाग्लैंडिनों की विशेषता फैटी एसिड रीढ़ के भीतर स्थित एक cyclopentane अंगूठी संरचना है. स्तनधारियों में, प्रास्टाग्लैंडिनों cyclooxygenase एंजाइम पर निर्भर है और स्वतंत्र रास्ते 10,15 के माध्यम से बनाई जा सकती है. सी. एलिगेंस cyclooxygenases 6,16,17 से स्वतंत्र prostaglandins के एक विस्तृत सरणी synthesizes. एफ श्रृंखला prostaglandins के एक बड़े वर्ग की पहचान की है, लेकिन eicosanoids के अध्ययन नई खोजों के लिए पर्याप्त कमरे के साथ एक प्रारंभिक चरण में किया गया है. यहाँ हम प्रास्टाग्लैंडिनों और अन्य eicosanoids निकालने और विश्लेषण करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. आरोपी लिपिडएक तरल तरल निष्कर्षण तकनीक का उपयोग बड़े पैमाने पर कीड़ा संस्कृतियों से निकाला और electrospray ionization अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-ESI-MS/MS) के लिए युग्मित तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं. ऐसे α-घ 4 PGF के रूप में 2 prostaglandins के deuterated एनालॉग, के शामिल किए जाने के लिए एक आंतरिक मानक मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सिफारिश की है के रूप में. एकाधिक प्रतिक्रिया की निगरानी या एम आर एम जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती पशुओं के बीच विशिष्ट प्रोस्टाग्लैंडीन प्रकार यों और तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. टकराव प्रेरित विघटन या एमएस / एमएस महत्वपूर्ण ढांचागत सुविधाओं के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. लिक्विड क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा एमएस) ऐसे मी / z 315-360 के रूप में एक चयनित जन रेंज के सर्वेक्षण स्कैन, प्रोस्टाग्लैंडीन के स्तर में वैश्विक परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम सभी तीन विश्लेषण का उदाहरण देते हैं. इन तरीकों उपन्यास eicosanoids की खोज और उनके चयापचय मार्ग delineating के लिए एक toolset के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करेगा.

नमूना तैयार Golovko और मर्फी 17 से अनुकूलित तरल तरल निष्कर्षण द्वारा किया गया. यह आंतरिक मानक (PGF 2α-D4) के शानदार वसूली प्रदान की. सी. से पीजी निकासी के लिए सामान्य योजना एलिगेंस चित्र 1 में दिखाया गया है. Chromatographic शर्तों&gt; 30 eicosanoid मानकों (1 टेबल 13 मानकों से पता चलता है) की आधारभूत जुदाई प्रदान करने के लिए अनुकूलित किया गया. 0.1% चींटी एसिड युक्त पानी और acetonitrile साथ एक पन आर.पी. स्तंभ (250 x 2.0 मिमी आईडी) सबसे अच्छा जुदाई और संवेदनशीलता प्रदान की. जंगली प्रकार और वसा 3 उत्परिवर्ती अर्क का सर्वेक्षण स्कैन 315-360 परमाणु जन इकाइयों की बड़े पैमाने पर सीमा के भीतर आयनों के चित्रा 2 दस्तावेज़ वैश्विक स्तर में दिखाया गया है. वसा 3 (wa22) म्यूटेंट सबसे अधिक 20 कार्बन PUFAs की कमी है. एक F3 वर्ग पीजी प्रकाश डाला है. चित्रा 3 में, एक जंगली प्रकार निकालने के एम आर एम विश्लेषण F1 के कई पीजी आइसोमरों (चित्रा 3A दिखाने </stro<html> एनजी&gt;), एफ 2 (3B चित्रा), और F3 (आंकड़े -3 सी और 3 डी) वर्गों. F3 के वर्ग दो बड़े पैमाने पर बदलाव के साथ या तो पता लगाया जा सकता है, मी / z 351/193 या मीटर z / 351/191. CePGF2 मुख्य रूप PGF 2α enantiomer के शामिल है. CePGF1 PGF 1α या अपने enantiomer होने की संभावना है. चित्रा 4 CePGF2 की टक्कर प्रेरित अपघटन (आर टी = 11.8) PGF2 α मानक की तुलना में (आर टी = 11.8) से पता चलता है. उत्पाद आयनों में मामूली अंतर होने की संभावना निकालने में कम CePGF2 बहुतायत और सह एल्यूटिंग यौगिकों के कारण हैं. <img alt="चित्रा 1" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig1.jpg" /> चित्रा 1. सी. के योजनाबद्ध आरेख एलिगेंस पीजीएस निष्कर्षण और नियंत्रण रेखा एमएस विश्लेषण करती है. दोनों लिपिड ऑक्सीकरण को कम करने के लिए 0.005% BHT है एसीटोन / खारा और क्लोरोफॉर्म ध्यान दें. अधिक जानकारी के लिए पाठ को देखें.http://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg &quot;लक्ष्य =&quot; _blank &quot;&gt; बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें. <img alt="चित्रा 2" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2.jpg" /> चित्रा 2. जंगली प्रकार और वसा 3 (wa22) उत्परिवर्ती अर्क की मी / z 315-360. लिक्विड क्रोमैटोग्राफी प्रतिधारण समय (आर टी) के सर्वेक्षण स्कैन पैनल [ए] में दिखाया गया है. आरटी पर निकाले आयनों = 11.3 जंगली प्रकार [बी] और वसा 3 (wa22) [सी] के अर्क के लिए दिखाए जाते हैं. जन मीटर z / 351 के साथ एक F3 वर्ग पीजी प्रकाश डाला है. सीपीएस, मायने रखता है / सेक, एएमयू, परमाणु जन इकाई. <img alt="चित्रा 3" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3.jpg" /> अंजीरउरे 3. जंगली प्रकार के अर्क के एम आर एम विश्लेषण. एफ 1 वर्ग पीजीएस जन संक्रमण मी / z 355/311 [ए] के साथ पाया जाता है. पीजीएस होने की उम्मीद नहीं कर रहे हैं जो कई हाइड्रोफोबिक यौगिकों (आरटी&gt; 14 मिनट) ने भी इस संक्रमण से पता चला रहे हैं उस पर ध्यान दें. एफ 2 वर्ग पीजीएस जन संक्रमण से पता चला रहे हैं मीटर z / 353/193 [बी]. F3 वर्ग पीजीएस या तो जन संक्रमण से पता चला रहे हैं मीटर z / 351/193 [सी] या मीटर z / 351/191 [डी]. अर्क प्रत्येक वर्ग के कई पीजी आइसोमरों कि रोकने पर ध्यान दें. नंबर 2 तालिका में दिखाया पीजीएस के अनुरूप हैं. CePGF2 की एकाग्रता 1.8 एनजी / मिली है. आरटी, प्रतिधारण समय, सीपीएस, मायने रखता है / सेक. <img alt="चित्रा 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4.jpg" /> 4 चित्रा. रासायनिक synth के टकराव प्रेरित अपघटनPGF 2α और CePGF2 esized. पैनल में तीर [एक] PGF 2α और CePGF2 (आर टी = 11.8) के बीच साझा उत्पाद या विखंडन आयनों का संकेत मिलता है. मी / z 309 और मी / z 193 पर उत्पाद आयनों दिखाया संरचनाओं के अनुरूप संकेत दरार साइटों (ए और बी प्रकाश डाला), से उत्पन्न, और एफ श्रृंखला पीजीएस के लक्षण हैं [बी] कर रहे हैं. सीपीएस, मायने रखता है / सेक. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig4large.jpg" target="_blank">बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें</a> . <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> मानक </td><td> आर टी (मिनट) </td><td> [महाराष्ट्र] - मी / z </td><td> एमएस / एमएस में प्रमुख उत्पाद आयनों </td></tr><tr><td> 20 हाइड्रोक्सी पीजीई 2 </td><td> 9.43 </td><td> 367 </td><td> 349, 331, 287, 234, 189, 129, 109 </td></tr&gt; <tr><td> PGF 3 - </td><td> 11.26 </td><td> 351 </td><td> 333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> बी 2 थ्राम्बाक्सेन </td><td> 11.66 </td><td> 369 </td><td> 289, 191, 177, 169, 151 </td></tr><tr><td> PGF 2 - </td><td> 11.80 </td><td> 353 </td><td> 335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> PGF 1 - </td><td> 11.79 </td><td> 355 </td><td> 337, 319,311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195 </td></tr><tr><td> Lipoxin बी 4 </td><td> 12.38 </td><td> 351 </td><td> 201, 191,189, 165, 155, 115, 107, 71, 59 </td></tr><tr><td> पीजीडी 2 </td><td> 12.56 </td><td> 351 </td><td> 315, 271,203, 189 </td></tr><tr><td> 5 (एस), 6 (नि.) - Lipoxin एक 4 </td><td> 12.83 </td><td> 351 </td><td> 235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59 </td></tr><tr><td> पीजीए 2 </td><td> 14.02 </td><td> 333 </td><td> 315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109 </td></tr><tr><td> Δ12-PGJ 2 </td><td> 14.20 </td><td> 333 </td><td> 271, 189, 123 </td></tr><tr><td> Leukotriene बी 4 </td><td> 14.73 </td><td> 335 </td><td> 181, 109, 93, 71, 69, 59, 57 </td></tr><tr><td> 15d-Δ 12,14-PGJ 2 </td><td> 16.80 </td><td> 315 </td><td> 297, 271, 217, 203, 158 </td></tr><tr><td> 5 (एस) HpETE </td><td> 17.88 </td><td> 335 </td><td> 97, 83, 81, 57 </td></tr></tbody></table> तालिका 1. रिटेंशन बार और LC-MS/MS विधि 3 से 13 eicosanoid मानकों के प्रमुख उत्पाद आयनों. 30 ओवर मानकों LC-MS/MS कार्यक्रम विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया गया. chromatographic प्रतिधारण बार (आरटीएस) भी बहुत समान पीजीएस के बीच मतभेद है. एक अपवाद PGF 1α और PGF 2α है. फिर भी, इन पीजीएस हैं घ(- मी / z [महाराष्ट्र]) और टक्कर प्रेरित अपघटन स्पेक्ट्रा (एमएस / एमएस) अपने माता - पिता आयन जनता द्वारा istinguished. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> प्रोस्टाग्लैंडीन वर्ग </td><td> चित्रा 3 में नहीं. </td><td> [महाराष्ट्र] - मी / z </td><td> एमएस / एमएस में प्रमुख उत्पाद आयनों </td></tr><tr><td> एफ 1 (CePGF1) </td><td> 1 </td><td> 355 </td><td> 319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157 </td></tr><tr><td> एफ 1 </td><td> 2 </td><td> 355 </td><td> 311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157 </td></tr><tr><td> एफ 2 (CePGF2) </td><td> 3 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127 </td></tr><tr><td> F2 </td><td> 4 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 5 </td><td> 351 </td><td> 315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 6 </td><td> 351 </td><td> 333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163 </td></tr></tbody></table> तालिका 2. कई प्रमुख सी. के लिए टकराव प्रेरित अपघटन उत्पाद आयनों एलिगेंस F1, F2, और F3 पीजीएस 3 चित्र में दिखाया गया है. अन्य कम प्रचुर मात्रा isomers का एमएस / एमएस नहीं दिखाए जाते हैं. ये आंकड़े कई विश्लेषण से कर रहे हैं और सभी उत्पाद आयनों किसी दिए गए समय में दिखाई दे सकता है. अर्क की जटिलता को देखते हुए, कुछ कम प्रचुर मात्रा में उत्पाद आयनों हस्तक्षेप से इसी तरह की अवधारण समय या परिणाम के साथ एक और माता पिता आयन से प्राप्त कर सकते हैं. पीक 2 संभावना CePGF1 के एक stereoisomer है और चोटी के 4 संभावना CePGF2 के एक stereoisomer है. अतिरिक्त डेटा 3 के लिए एडमंड्स, एट अल. (2010) देखें.

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Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

इस पत्र में, हम प्रास्टाग्लैंडिनों और अन्य eicosanoids से निकालने और विश्लेषण करने के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया का वर्णन<em&gt; सी. एलिगेंस</em&gt; LC-MS/MS का उपयोग कर.

में प्रोस्टाग्लैंडीन निष्कर्षण और विश्लेषण<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

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