Name: prostaglandin extraction and analysis in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2013-06-25T13:00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Мы благодарим UAB Целевые Метаболомики и протеомики лаборатории, которая была частично поддержана кожи UAB Болезнь научно-исследовательский центр (P30 AR050948 к С. Elmets), UAB-UCSD О&#39;Брайен Острая Центр повреждение почек (P30 DK079337 А. Агарвал ) и легких UAB центр здоровья (R01 HL114439, R01 HL110950 Blalock до х.э.). Поддержка масс-спектрометр был от общей NCRR Инструменты гранта (S10 RR19261 С. Барнс). Мы также благодарим Рэй Мур за технической поддержкой. C. Элеганс штаммы были предоставлены Caenorhabditis генетический центр, который финансируется NIH. Эта работа была поддержана NIH (R01GM085105 в МАМ, в том числе административных ARRA дополнительную плату).

<ol>
	<li>Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+synthesis+and+adiposity+regulation+in+Caenorhabditis+elegans.">Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans.</a> Trends Endocrinol. Metab. 20, 58-65 (2009).</li><li>Marza, E., Lesa, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyunsaturated+fatty+acids+and+neurotransmission+in+Caenorhabditis+elegans.">Polyunsaturated fatty acids and neurotransmission in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Soc. Trans. 34, 77-80 (2006).</li><li>Edmonds, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin/FOXO+signaling+regulates+ovarian+prostaglandins+critical+for+reproduction.">Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction.</a> Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).</li><li>Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+maternal+phospholipid+composition+and+IP(3)-dependent+embryonic+membrane+dynamics+by+a+specific+fatty+acid+metabolic+event+in+C.+elegans.">Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans.</a> Genes Dev. 26 (3), 554-566 (2012).</li><li>Kosel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eicosanoid+formation+by+a+cytochrome+P450+isoform+expressed+in+the+pharynx+of+Caenorhabditis+elegans.">Eicosanoid formation by a cytochrome P450 isoform expressed in the pharynx of Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. J. 435, 689-700 (2011).</li><li>Kubagawa, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+signals+derived+from+polyunsaturated+fatty+acids+control+sperm+recruitment+in+vivo.">Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo.</a> Nat Cell Biol. 8, 1143-1148 (2006).</li><li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473, 226-229 (2011).</li><li>Gerisch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bile+acid-like+steroid+modulates+Caenorhabditis+elegans+lifespan+through+nuclear+receptor+signaling.">A bile acid-like steroid modulates Caenorhabditis elegans lifespan through nuclear receptor signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5014-5019 (2007).</li><li>Edison, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+pheromones+regulate+multiple+complex+behaviors.">Caenorhabditis elegans pheromones regulate multiple complex behaviors.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 378-388 (2009).</li><li>Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandins+and+leukotrienes:+advances+in+eicosanoid+biology.">Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology.</a> Science. 294, 1871-1875 (2001).</li><li>Wang, D., Dubois, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eicosanoids+and+cancer.">Eicosanoids and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 10, 181-193 (2010).</li><li>Cha, Y. I., Solnica-Krezel, L., DuBois, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+prostanoids:+deciphering+the+developmental+functions+of+cyclooxygenase-derived+prostaglandins.">Fishing for prostanoids: deciphering the developmental functions of cyclooxygenase-derived prostaglandins.</a> Dev. Biol. 289, 263-272 (2006).</li><li>Hata, A. N., Breyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacology+and+signaling+of+prostaglandin+receptors:+multiple+roles+in+inflammation+and+immune+modulation.">Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: multiple roles in inflammation and immune modulation.</a> Pharmacol. Ther. 103, 147-166 (2004).</li><li>Sugimoto, Y., Narumiya, S., Ichikawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+function+of+prostanoid+receptors:+studies+from+knockout+mice.">Distribution and function of prostanoid receptors: studies from knockout mice.</a> Prog. Lipid Res. 39, 289-314 (2000).</li><li>Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoprostanes:+novel+bioactive+products+of+lipid+peroxidation.">Isoprostanes: novel bioactive products of lipid peroxidation.</a> Free Radic. Res. 38, 105-122 (2004).</li><li>Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heterogenous+mixture+of+F-series+prostaglandins+promotes+sperm+guidance+in+the+C.+elegans+reproductive+tract.">A heterogenous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the C. elegans reproductive tract.</a> PLoS Genetics. 9 (1), e1003271 (2013).</li><li>Golovko, M. Y., Murphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+LC-MS/MS+procedure+for+brain+prostanoid+analysis+using+brain+fixation+with+head-focused+microwave+irradiation+and+liquid-liquid+extraction.">An improved LC-MS/MS procedure for brain prostanoid analysis using brain fixation with head-focused microwave irradiation and liquid-liquid extraction.</a> J. Lipid Res. 49, 893-902 (2008).</li><li>Murphy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+and+tandem+mass+spectrometry+of+eicosanoids.">Electrospray ionization and tandem mass spectrometry of eicosanoids.</a> Anal. Biochem. 346, 1-42 (2005).</li><li>Milne, G. L., Yin, H., Morrow, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+biochemistry+of+the+isoprostane+pathway.">Human biochemistry of the isoprostane pathway.</a> J. Biol. Chem. 283, 15533-15537 (2008).</li><li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes.">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chem. Biodivers. 5, 2431-2441 (2008).</li><li>Kulas, J., Schmidt, C., Rothe, M., Schunck, W. H., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450-dependent+metabolism+of+eicosapentaenoic+acid+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Cytochrome P450-dependent metabolism of eicosapentaenoic acid in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Arch. Biochem. Biophys. 472, 65-75 (2008).</li><li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+polyunsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).</li></ol>

Авторы не имеют конфликта интересов.

Мы описываем процедуру эйкозаноида извлечения и анализа, уделяя особое внимание F-серии ПГ. Есть несколько частей процедура, которая может быть проблематичным. Во-первых, очень важно, что червь культур не голодают, как голод может изменить метаболизм PG. Для дополнительного питания, бактерии na22 рекомендуется вместо более часто используемых OP50 бактерий, потому что na22 достигает более высокой плотности. Тем не менее, Na22 штамм не хватает устойчивости к антибиотикам и более подвержен загрязнению. Во-вторых, черви синтезировать отдельные изомеры PG в низкой численности относительно тканях млекопитающих. Это может быть отчасти из-за избыточности Среди многочисленных изомеров. Мы рекомендуем около 6 грамм ткани всестороннего анализа и более сильным сигналом. Менее ткани (1-2 г), может быть использован, если Высушенный экстракт ресуспендировали в менее метанол: водный раствор для увеличения концентрации ПГ. Тем не менее, от одного до двух инъекций могут быть выполнены. Предел обнаружения нашей системе ЖХ-МС/МС составляет около 10 пгPGF 2α / мл. Один мл плотно упакованных червей смешанной этап (около 1 г) дает примерно 25-50 мкг CePGF2. Более чувствительный системы масс-спектрометрии можно уменьшить количество червей ткани требуется для анализа. В-третьих, различия в эффективности добычи PG среди образцов может вызвать различные результаты. Мы обнаружили, что эффективность экстракции очень похож когда ткани извлекаются параллельно. Для определения эффективности, добавить 1,0 нг PGF 2α-D 4 на стадии гомогенизации в качестве внутреннего контроля. MRM использованием массовый переход м / Z 357/197 используется для измерения PGF 2α-d4 концентрации по отношению к 1 нг / мл стандартного раствора. Количество PGF 2α-D 4 потеряли при добыче затем рассчитывается. Хроматографии и масс параметры переходами учесть может быть изменена, чтобы обнаружить другие ПГ и эйкозаноидов. Несмотря на значительные усилия, мы не смогли определить D-серии и E-SerPGS х годов в экстрактах 17. Кроме того, мы не обнаружили 8-ISO PGF 2α и 8-ISO PGE 2, которые характерны для инициированной свободными радикалами перекисного окисления, которое генерирует неселективных смесь стереоизомеров PG 19. Независимо от червей синтезировать другие типы PG не известно. Эндоканнабиноиды и различных метаболитов эпоксидной смолы и гидрокси арахидоновой и эйкозапентаеновой кислоты были найдены в C. Элеганс извлекает 5,7,20,21. Мы рекомендуем использовать как MRM и МС / МС по сравнению с подлинными стандартами для определения количества и идентификации, соответственно. Для новых эйкозаноидов, эти анализы должны быть объединены с сравнительное исследование жир мутанты, которые лишены ПНЖК синтеза ферментов 22, а также функциональный анализ, если это возможно. Предостережение к анализу жира мутантов, что незначительное количество ПНЖК в настоящее червей достаточно для синтеза ПГ. Например, жиры-2 (wa17) мутантыимеют небольшое количество активность D12 десатуразы (~ 5% дикого типа 22), и эти мутанты все еще ​​производят ПГ 6. жира-3 (WA22) и жира-4 (WA14) мутанты не способны синтезировать протеогликанов, полученных из арахидоновой и эйкозапентаеновой кислоты 16 . Мы также обнаружили, что жир мутантов компенсировать потерю классов ПНЖК на повышающей регуляции синтеза ПГ от остальных классов. Например, жир-3 (WA22) мутанты не способны синтезировать наиболее ПГ, полученные из 20-углеродные ПНЖК. Вместо этого, они, кажется, активируют новые ПГ, полученные из 18-ПНЖК углерода 16. На сегодняшний день мы не выявили C. Элеганс штамм, который полностью дефицитный в синтез ПГ. Вполне возможно, что ПГС являются существенными для роста и развития.

Простагландинов (ПГ) являются важным классом липидов гормоны, которые были тщательно исследованы и участвует в регуляции размножения, иммунитет, и развитие в широком спектре организмов 12-14. PGs идеально подходят для всестороннего анализа системной биологии, потому что они представляют собой ряд липиды, полученные из общего предшественника (ы). Нематоды C. Элеганс является одним из наиболее широко используемых модельных организмов для решения основных вопросов в области генетики и системной биологии. Мы показали, что С. Элеганс синтезирует F-серии ПГ, что руководство подвижных сперматозоидов в ооциты 3,6,16. F-серии ПГ, полученные из 20-углерод ПНЖК с три, четыре, пять и двойными связями, содержащего F1, F2 и F3 классов, соответственно были идентифицированы 3,16. Эти ПГ синтезируются независимо от ферментов циклооксигеназы, но PGF 1α и PGF 2α стереоизомеров еще GEnerated. Для качественного и количественного анализа С. Элеганс ПГ, LC-MS/MS является мощной и чувствительной аналитической техники. Перед выполнением этого анализа, важно разработать оптимизированный метод добычи поскольку производительность аналитического процесса во многом зависит от качества экстракта. Жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии может обеспечить только ожидаемый массы к заряду (м / з), а также желаемой формы пика и время удерживания PG ион родителя. Метаболический профилирование PGS На C. Элеганс является сложной задачей, требующей приобретения MS различных стратегий. ЖХ-МС полное сканирование сканирования или обследования (Q1 сканирования), имеет преимущество, что наиболее ионизируемая ПГ будет генерировать масс-спектрометрического ответа. В то время как исследование сканирования предоставляет полезную информацию об общем объеме профилирование ПГ по отношению к дикого типа и мутантных C. Элеганс, обнаружение незначительных PGs находится под угрозой из-за низкой чувствительности. Тем неменьше, LC-MS обследования сканирование может дать общее представление о ПГ и особенно полезна для анализа мутантов прогнозам, влияют на обмен веществ большой популяции PG. В метаболита идентификация, анализ LC-MS/MS химически синтезированных стандартам PG сначала выполняется, чтобы получить их продукт ионных спектров в качестве эталонных соединений. Эти спектры можно сравнить спектр неизвестного метаболита. Несколько реакции мониторинга (MRM) режим используется для повышения чувствительности и специфичности. Эксперимент MRM осуществляется путем указания родительского иона / продукта иона массовый переход соединения. Зная массу и структуру целевых аналитов, можно предсказать теоретическим переходы MRM для многих неизвестных метаболитов. Оптимизированный метод LC-MS/MS для профилирования изомерных PGS На C. Элеганс не сообщалось. Здесь мы опишем добычи и комплексного подхода масс-спектрометрии, состоящий из LC-MS и LC-MS / MS методов выявления, количественной, и расследование C. Элеганс PG метаболитов. Этот подход может быть применен к другим эйкозаноидов.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-large (16 cm) plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875714</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain NA22</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>NA22</td>
			<td><a href="http://www.cgc.cbs.umn.edu" target="_blank">http://www.cgc.cbs.umn.edu</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone, 399.5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A928-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butylated Hydroxytoluene</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>101162</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H302-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid, 399%</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC27048-0010</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC26832-0010</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGF2&alpha;-d4</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>316010</td>
			<td>Cayman has a wide array of standards available for purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile screw cap self-standing 5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-651</td>
			<td>For use with Bullet Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm zirconium oxide beads</td>
			<td>Next &gt;&gt;&gt; Advance</td>
			<td>ZrOB05</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes</td>
			<td>Kimble Kimax</td>
			<td>45200-10</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml glass conical tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>8082-15</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmacote (Siliconizing reagent)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SL2-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V1235C-TFE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentraSL2 Clinical Centrifuge</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>2517N92-TS</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender 5 blue homogenizer</td>
			<td>Next &gt;&gt;&gt; Advance</td>
			<td>BBY5MB</td>
			<td>A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergi 4 &mu;m Hydro-RP 80 &Aring; LC Column 250 x 2.0 mm</td>
			<td>Phenomenenex</td>
			<td>00G-4375-B0</td>
			<td>HPLC Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm</td>
			<td>Phenomenenex</td>
			<td>AJ0-7510</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecurityGuard Guard Cartridges Kit</td>
			<td>Phenomenenex</td>
			<td>KJ0-4282</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler</td>
			<td>Shimadzu Scientific Instruments, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API 4000 triple quadrupole mass spectrometer</td>
			<td>Applied Biosystems/MDS SCIEX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="2">M9 buffer recipe (4 liter)</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>12 g</td>
						<td>KH2PO4</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>24 g</td>
						<td>Na2HPO4</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>20 g</td>
						<td>NaCl</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Up to 4 liter</td>
						<td>Deionized water</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">Aliquot to eight 1 liter bottles. Autoclave and cool.</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>0.5 ml/bottle</td>
						<td>1 M MgSO4</td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

prostaglandin extraction and analysis in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis Элеганс становится мощной модели животных для изучения биологии липидов 1-9. Простагландины представляют собой важный класс эйкозаноидов, которые липидов сигналов, полученных от полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), 10-14. Эти сигнальные молекулы трудно изучать из-за их низкой численности и реактивной природы. Характерной особенностью является простагландинов циклопентановым кольцевой структуры расположены в жирные кислоты позвоночник. У млекопитающих, простагландины могут быть сформированы посредством фермента циклооксигеназы-зависимый и-независимых путей 10,15. С. Элеганс синтезирует широкий спектр независимых простагландинов циклооксигеназы 6,16,17. Большой класс F-серии простагландинов была определена, но изучение эйкозаноиды находится на ранней стадии с достаточно места для новых открытий. Здесь мы описываем процедуру для извлечения и анализа простагландинов и других эйкозаноидов. Заряженного липидас извлекаются из массы культур червь использовании жидкостно-жидкостной экстракции техники и анализируют жидкостной хроматографией, соединенный с ионизацией электрораспылением тандемной масс-спектрометрии (LC-ESI-MS/MS). Включение в дейтерированном аналоги простагландинов, такие как PGF 2 α-д 4 в качестве внутреннего стандарта рекомендуется для количественного анализа. Несколько мониторинга реакции или MRM может использоваться для количественного определения и сравнение определенного типа простагландина между дикого типа и мутантных животных. Столкновение индуцированного разложения или MS / MS может быть использована для получения информации о важных структурных особенностей. Жидкий хроматографии масс-спектрометрии (ЖХ-МС) обзор сканирования выбранного диапазона массы, например, м / з 315-360 могут быть использованы для оценки глобального изменения уровни простагландина. Мы приводим примеры всех трех анализов. Эти методы будут предоставить исследователям набор инструментов для обнаружения новых эйкозаноидов и разграничения их метаболических путей.

Подготовка образцов проводили жидкостно-жидкостной экстракции адаптировано из Golovko и Мерфи 17. Это обеспечило отличную восстановление внутреннего стандарта (PGF 2α-d4). Общая схема PG извлечение из C. Элеганс показано на рисунке 1. Хроматографические условия были оптимизированы для обеспечения базового разделения&gt; 30 стандартов эйкозаноидов (Таблица 1 показывает 13 стандартов). Гидро-Rp колонка (250 х 2,0 мм внутренний диаметр) с водой и ацетонитрилом, содержащим 0,1% муравьиной кислоты, при условии лучшего разделения и чувствительности. Обзор сканирования дикого типа и жира-3 мутант экстракты показано на рисунке 2 документ глобального уровней ионов в диапазоне масс от 315-360 атомных единиц массы. Жира-3 (WA22) мутанты лишены наиболее 20-углерод ПНЖК. PG F3 класс будет выделен. На рисунке 3 MRM анализы дикого типа экстракта показать несколько изомеров ПГ F1 (рис. 3А </stro<html> нг&gt;), F2 (рис. 3В) и F3 (рис. 3C и 3D) классов. F3 класса могут быть выявлены с любой из двух переходов массы, м / Z 351/193 или м / Z 351/191. CePGF2, в основном, состоит из энантиомера PGF 2α. CePGF1, вероятно, будет PGF 1α или его энантиомер. 4 показаны индуцированных столкновениями разложение CePGF2 (RT = 11,8) по сравнению с α PGF2 стандарт (RT = 11,8). Незначительные различия в продукте ионов, вероятно, из-за низкой CePGF2 изобилия и сотрудничества элюирующие соединений в экстракте. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig1.jpg" /> Рисунок 1. Принципиальная схема C. Элеганс PGs добычи и ЖХ-МС анализа. Обратите внимание, что ацетон / солевые и хлороформ оба имеют 0,005% BHT, чтобы минимизировать окисление липидов. См. текст для более подробной информации.http://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg &quot;целевых =&quot; _blank &quot;&gt; Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок. <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2.jpg" /> Рисунок 2. Обзор сканирований м / з 315-360 дикого типа и жира-3 (WA22) мутант экстрактов. Жидкие время удержания хроматографии (RT), показано на графике [A]. Извлеченные ионов при RT = 11,3 показаны для дикого типа [B] и жира-3 (WA22) [C] экстрактов. PG F3 класса с массой т / Z 351 выделяется. К.п.н., имп / сек; Аму, атомная единица массы. <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3.jpg" /> ФигаЮр 3. MRM анализы дикого типа экстрактов. F1 ПГ класс обнаруживаются с массовым переходом м / з 355/311 [A]. Обратите внимание, что несколько гидрофобных соединений (RT&gt; 14 мин), которые вряд ли будут протеогликанов, также обнаружены с этим переходом. ПГ F2 класса выявляются с массовым переходом м / з 353/193 [B]. PGs F3 класса выявляются либо массовый переход м / Z 351/193 [C] или м / Z 351/191 [D]. Обратите внимание, что экстракты содержат несколько PG изомеров каждого класса. Числа соответствуют ПГ представлены в Таблице 2. Концентрация CePGF2 составляет 1,8 нг / мл. RT, время удерживания; CPS, импульсов / с. <img alt="Рисунок 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4.jpg" /> Рисунок 4. Индуцированные столкновениями разложения химически синтезаторesized PGF 2α и CePGF2. Стрелки на панели [A] указывают продукт или фрагментации ионов разделены между PGF 2α и CePGF2 (RT = 11,8). Продукт ионов при м / з 309 и м / з 193 генерируются из указанных сайтов расщепления (выделено и б) соответствуют структуры, показанные и характерные для F-серии ПГ [B]. К.п.н., импульсов / с. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig4large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок</a> . <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Стандартный </td><td> RT (мин) </td><td> [Н] - м / Z </td><td> Основные ионы продукт в MS / MS </td></tr><tr><td> 20-гидрокси PGE 2 </td><td> 9,43 </td><td> 367 </td><td> 349, 331, 287, 234, 189, 129, 109 </td></tr&gt; <tr><td> PGF 3 - </td><td> 11.26 </td><td> 351 </td><td> 333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> Тромбоксана В2 </td><td> 11.66 </td><td> 369 </td><td> 289, 191, 177, 169, 151 </td></tr><tr><td> PGF 2 - </td><td> 11.80 </td><td> 353 </td><td> 335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> PGF 1 - </td><td> 11.79 </td><td> 355 </td><td> 337, 319 311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195 </td></tr><tr><td> Lipoxin B 4 </td><td> 12.38 </td><td> 351 </td><td> 201, 191 189, 165, 155, 115, 107, 71, 59 </td></tr><tr><td> PGD ​​2 </td><td> 12.56 </td><td> 351 </td><td> 315, 271 203, 189 </td></tr><tr><td> 5 (S), 6 (R) - Lipoxin четыре </td><td> 12.83 </td><td> 351 </td><td> 235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59 </td></tr><tr><td> PGA 2 </td><td> 14.02 </td><td> 333 </td><td> 315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109 </td></tr><tr><td> Δ12-PGJ 2 </td><td> 14.20 </td><td> 333 </td><td> 271, 189, 123 </td></tr><tr><td> Лейкотриен B 4 </td><td> 14.73 </td><td> 335 </td><td> 181, 109, 93, 71, 69, 59, 57 </td></tr><tr><td> 15D-Δ 12,14 PGJ-2 </td><td> 16.80 </td><td> 315 </td><td> 297, 271, 217, 203, 158 </td></tr><tr><td> 5 (S)-HPETE </td><td> 17.88 </td><td> 335 </td><td> 97, 83, 81, 57 </td></tr></tbody></table> Таблица 1. Время удерживания и ключ ионов продукт 13 эйкозаноидов стандартам от метода LC-MS/MS 3. Более 30 стандартов были использованы для разработки LC-MS/MS программы. Хроматографических времен удерживания (РТС) отличаются, даже среди очень похожи ПГ. Исключением является PGF 1α и PGF 2α. Тем не менее, эти ПГ являются Distinguished их родителей масс ионов ([Н] - м / г) и индуцированных столкновениями спектров разложение (MS / MS). <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Простагландинов класса </td><td> Номер на рисунке 3 </td><td> [Н] - м / Z </td><td> Основные ионы продукт в MS / MS </td></tr><tr><td> F1 (CePGF1) </td><td> 1 </td><td> 355 </td><td> 319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157 </td></tr><tr><td> F1 </td><td> 2 </td><td> 355 </td><td> 311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157 </td></tr><tr><td> F2 (CePGF2) </td><td> 3 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127 </td></tr><tr><td> F2 </td><td> 4 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 5 </td><td> 351 </td><td> 315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 6 </td><td> 351 </td><td> 333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163 </td></tr></tbody></table> Таблица 2. Индуцированные столкновениями ионов продукт разложения для нескольких крупных C. Элеганс F1, F2, F3 и PGs показано на рисунке 3. МС / МС других меньших количествах изомеров не показаны. Эти данные из нескольких анализов, и не все ионы продукт может быть видимым в данном периоде. С учетом сложности экстракты, некоторые меньшем количестве ионов продукт может происходить от другого родительского иона с аналогичными времени удерживания или в результате вмешательства. Пик 2, вероятно, стереоизомер CePGF1 и пик 4, вероятно, стереоизомер CePGF2. См. Эдмондс, и соавт. (2010) для дополнительных данных 3.

Watch this Scientific Journal Video about Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

В этой статье мы описываем оптимизированные процедуры для извлечения и анализа простагландинов и других эйкозаноидов из<em&gt; C. Элеганс</em&gt; Использование LC-MS/MS.

Добыча простагландинов и анализа в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Выделение и В пробирке Активация Caenorhabditis Элеганс Сперма

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Покадровый Микроскопия раннего эмбриогенеза в Caenorhabditis Элеганс

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Основной<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Методы синхронизации и наблюдения

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Выращивание<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; В трех измерениях в лаборатории

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Комбинированные нуклеотидов и экстракции белка в Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Измерение коэффициентов потребления кислорода в неповрежденной Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Очищение и анализ Caenorhabditis elegans Внеклеточные Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Количественная оценка тканеспецифического снижения протеостатического снижения caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Моделирование Возраст-ассоциированных нейродегенеративных заболеваний в Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...