Name: preparation of the mgm101 recombination protein by mbp-based tagging strategy
Uploaded: 2013-06-25T14:00:00
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Ringraziamo Stephan Wilkens aiuto in microscopia elettronica a trasmissione. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di Grant R01AG023731.

Precedenti studi hanno dimostrato che i primi amino-terminali 22 residui di Mgm101 sono spaccati dopo l&#39;importazione in mitocondri 19. Per l&#39;espressione in Escherichia coli, la cornice di lettura aperta MGM101 mancano i primi 22 codoni viene amplificato mediante PCR e collocato a valle della sequenza codificante la proteina MASCHIO legante il maltosio (MBP) in una versione modificata del vettore di espressione pMAL-c2e. Questo genera la fusione MBP-Mgm101 con un linker che c...

<ol>
	<li>San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+eukaryotic+homologous+recombination.">Mechanism of eukaryotic homologous recombination.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).</li><li>Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMC1:+a+meiosis-specific+yeast+homolog+of+E.+coli+recA+required+for+recombination,+synaptonemal+complex+formation,+and+cell+cycle+progression.">DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression.</a> Cell. 69, 439-456 (1992).</li><li>Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad51+protein+involved+in+repair+and+recombination+in+S.+cerevisiae+is+a+RecA-like+protein.">Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein.</a> Cell. 69, 457-470 (1992).</li><li>Passy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Dmc1+protein+binds+DNA+as+an+octameric+ring.">Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).</li><li>Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+E.+coli+recA+protein+monomer+and+polymer.">The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer.</a> Nature. 355, 318-325 (1992).</li><li>Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+allele+of+RAD52+that+causes+severe+DNA+repair+and+recombination+deficiencies+only+in+the+absence+of+RAD51+or+RAD59.">A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59.</a> Genetics. 153, 1117-1130 (1999).</li><li>Bai, Y., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rad52+homolog+is+required+for+RAD51-independent+mitotic+recombination+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).</li><li>Paques, F., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+of+recombination+induced+by+double-strand+breaks+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).</li><li>Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+recombinases+in+bacteriophage+genomes+unveils+Rad52,+Rad51+and+Gp2.5+remote+homologs.">Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).</li><li>Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+structure+and+quaternary+organization+of+the+bacteriophage+P22+Erf+protein.">Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein.</a> J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).</li><li>Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rings+and+filaments+of+beta+protein+from+bacteriophage+lambda+suggest+a+superfamily+of+recombination+proteins.">Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).</li><li>Ploquin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+basis+for+a+bacteriophage+homolog+of+human+RAD52.">Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52.</a> Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).</li><li>Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MGM101,+a+nuclear+gene+involved+in+maintenance+of+the+mitochondrial+genome+in+Saccharomyces+cerevisiae.">MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).</li><li>Meeusen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mgm101p+is+a+novel+component+of+the+mitochondrial+nucleoid+that+binds+DNA+and+is+required+for+the+repair+of+oxidatively+damaged+mitochondrial+DNA.">Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA.</a> J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).</li><li>Mbantenkhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mgm101+is+a+Rad52-related+protein+required+for+mitochondrial+DNA+recombination.">Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination.</a> J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).</li><li>Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+properly+configured+ring+structure+is+critical+for+the+function+of+the+mitochondrial+DNA+recombination+protein.">A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein.</a> Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).</li><li>Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+core+of+the+mitochondrial+genome+maintenance+protein+Mgm101p+in+Saccharomyces+cerevisiae+determined+with+a+temperature-conditional+allele.">A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele.</a> FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).</li><li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+packaging+proteins+Glom+and+Glom2+coordinately+organize+the+mitochondrial+nucleoid+of+Physarum+polycephalum.">DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum.</a> Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).</li><li>Janicka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RAD52-like+single-stranded+DNA+binding+protein+affects+mitochondrial+DNA+repair+by+recombination.">A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination.</a> Plant J. 72, 423-435 (2012).</li></ol>

E &#39;stata una sfida per la produzione di una stalla, nativo Mgm101 proteina ricombinante da E. coli forse a causa della sua insolubilità in cellule batteriche. In questo rapporto, si dimostra che la strategia di MBP-fusione permette la proteina da esprimere ad un livello ragionevolmente elevato. Mediante microscopia elettronica a colorazione negativa e cromatografia ad esclusione dimensionale, abbiamo precedentemente dimostrato che la proteina di fusione MBP-forma oligomeri uniformi in vitro 1...

Ricombinazione omologa è importante per la riparazione delle rotture del doppio filamento (DSB) e interstrand legami crociati, e per la ripresa della replicazione del DNA da forche di replicazione crollate 1. Nel convenzionale ricombinazione omologa, la reazione è catalizzata centrale dalle ricombinasi ATP-dipendenti comprese RecA nei procarioti e Rad51 e Dmc1 negli eucarioti 1-3. Questi ricombinasi formano filamenti nucleoproteici sul ssDNA, che sono essenziali per l&#39;avvio ricerca di omologia e invasione filone all&#39;interno dei modelli di DNA duplex (Figura 1, pannello di sinistra) 4-7. Oltre alla schema convenzionale, ricombinazione omologa può avvenire anche in maniera RecA/Rad51-independent (figura 1, pannello di destra). Per esempio, il lievito e RAD52 Rad59 proteine ​​possono catalizzare direttamente la ricottura del complementari ssDNA filamenti che sono esposti per resezione di dsDNA pause. Questo processo di ricombinazione, noto come cantareLe filone ricottura, generalmente non comporta omologa l&#39;abbinamento con i modelli di DNA a doppia elica. Dopo la ricottura, code eterologhe vengono rimossi da esonuleasi e nick sono legatura a ripristinare genoma 8-10 di continuità. Riparazione da parte del singolo meccanismo di ricottura filo è spesso accompagnata da delezioni di sequenze genomiche tra regioni ripetute direttamente. RAD52 appartiene ad un gruppo eterogeneo di proteine ​​di ricombinazione che sono diffuse tra i batteriofagi 11. Queste proteine ​​sono conosciute anche come singolo filamento Proteine ​​ricottura (SSAPs), in base alla loro attività nel promuovere la ricottura di molecole di DNA a singolo filamento omologo. I migliori SSAPs batteriofagi sono caratterizzati Redβ e Erf dal batteriofagi λ e P22, rect dal profago RAC e la proteina Sak dal Lactococcal fago ul36. Le SSAPs sono strutturalmente caratterizzate da una tipica piega β-β-β-α, sebbene somiglianza è praticamente undetectgrado nelle loro sequenze primarie. Essi ogni forma di grandi anelli omo-oligomeri di 10-14 volte simmetria in vitro 12-14. Le implicazioni funzionali di questa caratteristica organizzazione strutturale ordine superiore non è ben compreso. Siamo interessati a capire il meccanismo di ricombinazione omologa nel genoma mitocondriale. Abbiamo precedentemente identificato il gene MGM101 che è essenziale per il mantenimento del mtDNA in Saccharomyces cerevisiae 15. MGM101 stato successivamente trovato per essere associato con nucleoidi mitocondriali ed è necessario per la tolleranza del mtDNA ad agenti che danneggiano il DNA 16. Tuttavia, lo studio di Mgm101 è stata frenata nell&#39;ultimo decennio dalla difficoltà di produrre Mgm101 ricombinante. Abbiamo recentemente riusciti a produrre Mgm101 solubile in grandi quantità da E. coli usando la strategia di MBP-fusion. Questo ci ha permesso di dimostrare che Mgm101 azionisimilitudini biochimiche e strutturali con il RAD52-famiglia di proteine ​​17,18. In questo rapporto, una procedura di purificazione in tre fasi è descritta, che produce Mgm101for analisi biochimiche e strutturali omogenee (Figura 2).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression vector pMAL-c2E</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#N8066S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreScission Protease</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>#27-0843-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells</td>
			<td>Strategene</td>
			<td>#230245</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#11034626001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#11359053001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#10837091001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#DN25-1G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#11411446001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose resin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#E8021L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Column chromatography column</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#7372512</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#732-4130</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO)</td>
			<td>Sartorius Stedium</td>
			<td>#VS15RH02</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 prep grade column</td>
			<td>Amersham Bioscirnces</td>
			<td>#17-0489-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO)</td>
			<td>Sartorius Stedium</td>
			<td>#VS0611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of the mgm101 recombination protein by mbp-based tagging strategy

Il gene è stato identificato MGM101 20 anni fa per il suo ruolo nel mantenimento del DNA mitocondriale. Studi condotti in diversi gruppi hanno suggerito che la proteina Mgm101 è coinvolta nella riparazione ricombinazione del DNA mitocondriale. Recenti indagini hanno indicato che Mgm101 è legato alla famiglia RAD52-tipo ricombinazione proteica. Queste proteine ​​formano grandi anelli oligomeriche e promuovere la ricottura di molecole di DNA a singolo filamento omologo. Tuttavia, la caratterizzazione di Mgm101 è stata ostacolata dalla difficoltà di produrre la proteina ricombinante. Qui, una procedura affidabile per la preparazione di Mgm101 ricombinante è descritto. Il maltosio Binding Protein (MBP)-tag Mgm101 è prima espressa in Escherichia coli. La proteina di fusione è inizialmente purificato mediante cromatografia di affinità amilosio. Dopo essere stato rilasciato da clivaggio proteolitico, Mgm101 è separato da MBP mediante cromatografia di scambio cationico. Monodisperso Mgm101 è quindi ottenutoper cromatografia ad esclusione dimensionale. Una resa di ~ 0,87 mg di Mgm101 per litro di coltura batterica può essere ottenuta routine. Il Mgm101 ricombinante ha la contaminazione minima di DNA. I campioni preparati sono utilizzati con successo per biochimici, strutturali e singola particella analisi dell&#39;immagine di Mgm101. Questo protocollo può essere utilizzato anche per la preparazione di altri grandi oligomeriche proteine ​​che legano il DNA che possono essere mal ripiegate e tossici per le cellule batteriche.

Mgm101 è una proteina di ricombinazione RAD52-correlati nei mitocondri. RAD52 è stato ampiamente studiato per il suo ruolo nella ricombinazione del DNA mitocondriale (Figura 1). Ricombinante Mgm101 può essere preparato da una procedura in tre fasi (Figura 2). Ciò è facilitato dall&#39;utilizzo della strategia MBP-tagging che permette Mgm101 essere espressi in una forma solubile e successivamente rilasciato dal tag da taglio proteolitico (Figura 3). <p class="jo...

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Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

Il lievito mitocondriale proteina nucleoide, Mgm101, è una proteina di ricombinazione RAD52-tipo che forma grandi anelli oligomeriche. Un protocollo è descritto da preparare Mgm101 solubile ricombinante utilizzando la proteina legante il maltosio (MBP)-tagging strategia accoppiato con scambio cationico e cromatografia ad esclusione dimensionale.

Preparazione del Mgm101 ricombinazione delle proteine ​​da Strategy Tagging MBP-based

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

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Preparazione del Mgm101 ricombinazione delle proteine ​​da Strategy Tagging MBP-based

Preparazione del Mgm101 ricombinazione delle proteine da Strategy Tagging MBP-based