Name: preparation of the mgm101 recombination protein by mbp-based tagging strategy
Uploaded: 2013-06-25T14:00:00
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우리는 투과 전자 현미경의 도움 스테판 켄스 감사합니다. 이 작품은 건강 그랜트 R01AG023731의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

이전 연구는 Mgm101의 첫 번째 아미노 말단 22 잔기가 미토콘드리아 19로 가져온 후 쪼개 것으로 나타났습니다. 대장균에서 발현를 들어, 첫 번째 22 코돈이 부족한 MGM101 오픈 읽기 프레임은 PCR에 의해 증폭되어 발현 벡터 PMAL - C2E의 수정 된 버전에 말토오스 결합 단백질 (MBP)를 코딩하는 남성 서열의 하류에 배치됩니다. 이 PreScission 프로테아제 (그림 3)를위한 ...

<ol>
	<li>San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+eukaryotic+homologous+recombination.">Mechanism of eukaryotic homologous recombination.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).</li><li>Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMC1:+a+meiosis-specific+yeast+homolog+of+E.+coli+recA+required+for+recombination,+synaptonemal+complex+formation,+and+cell+cycle+progression.">DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression.</a> Cell. 69, 439-456 (1992).</li><li>Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad51+protein+involved+in+repair+and+recombination+in+S.+cerevisiae+is+a+RecA-like+protein.">Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein.</a> Cell. 69, 457-470 (1992).</li><li>Passy, S. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+allele+of+RAD52+that+causes+severe+DNA+repair+and+recombination+deficiencies+only+in+the+absence+of+RAD51+or+RAD59.">A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59.</a> Genetics. 153, 1117-1130 (1999).</li><li>Bai, Y., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rad52+homolog+is+required+for+RAD51-independent+mitotic+recombination+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).</li><li>Paques, F., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+of+recombination+induced+by+double-strand+breaks+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).</li><li>Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+recombinases+in+bacteriophage+genomes+unveils+Rad52,+Rad51+and+Gp2.5+remote+homologs.">Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).</li><li>Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+structure+and+quaternary+organization+of+the+bacteriophage+P22+Erf+protein.">Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein.</a> J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).</li><li>Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rings+and+filaments+of+beta+protein+from+bacteriophage+lambda+suggest+a+superfamily+of+recombination+proteins.">Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).</li><li>Ploquin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+basis+for+a+bacteriophage+homolog+of+human+RAD52.">Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52.</a> Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).</li><li>Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MGM101,+a+nuclear+gene+involved+in+maintenance+of+the+mitochondrial+genome+in+Saccharomyces+cerevisiae.">MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).</li><li>Meeusen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mgm101p+is+a+novel+component+of+the+mitochondrial+nucleoid+that+binds+DNA+and+is+required+for+the+repair+of+oxidatively+damaged+mitochondrial+DNA.">Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA.</a> J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).</li><li>Mbantenkhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mgm101+is+a+Rad52-related+protein+required+for+mitochondrial+DNA+recombination.">Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination.</a> J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).</li><li>Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+properly+configured+ring+structure+is+critical+for+the+function+of+the+mitochondrial+DNA+recombination+protein.">A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein.</a> Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).</li><li>Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+core+of+the+mitochondrial+genome+maintenance+protein+Mgm101p+in+Saccharomyces+cerevisiae+determined+with+a+temperature-conditional+allele.">A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele.</a> FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).</li><li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+packaging+proteins+Glom+and+Glom2+coordinately+organize+the+mitochondrial+nucleoid+of+Physarum+polycephalum.">DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum.</a> Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).</li><li>Janicka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RAD52-like+single-stranded+DNA+binding+protein+affects+mitochondrial+DNA+repair+by+recombination.">A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination.</a> Plant J. 72, 423-435 (2012).</li></ol>

그것은 E.에서 안정적인 기본 재조합 Mgm101 단백질을 생산하기 위해 도전하고있다 박테리아 세포에서의 용해성을 가능성으로 인해 대장균. 이 보고서에서, 우리는 MBP 융합 전략은 단백질이 비교적 높은 수준에서 표현 될 수 있다는 점을 보여줍니다. 부정적인 염색 투과 전자 현미경 및 크기 배제 크로마토 그래피를 사용하여, 우리는 이전에 MBP-융합 단백질은 생체 18 균...

상동 재조합 이중 가닥 나누기의 수리 (DSBs) 및 interstrand 가교를 위해 및 축소 복제 포크 1 DNA 복제의 reinitiation 중요합니다. 기존의 상동 재조합에, 중앙 반응은 원핵 생물에서 RECA 및 Rad51와 1-3 진핵 생물 Dmc1 등 ATP-의존 recombinases에 의해 촉매된다. 이 recombinases 양면 DNA 템플릿 (그림 1 왼쪽 패널) 4-7에서 동성 검색 및 가닥의 침공을 시작하기에 필수적인 ssDNA에 핵 단백질 필라멘트를 형성한다. 기존의 방식에 더하여, 상동 재조합은 RecA/Rad51-independent 방식 (그림 1, 오른쪽 패널)에 자리를 취할 수 있습니다. 예를 들어, 효모 Rad52 및 Rad59 단백질은 직접 dsDNA 나누기 resectioning에 의해 노출되는 보완 ssDNA 가닥의 어닐링을 촉진 할 수 있습니다. 노래로 알려진이 재조합 과정르 가닥 어닐링, 일반적으로 동종 dsDNA 템플릿을 페어링 포함되지 않습니다. 어닐링 후, 이종 꼬리 exonucleases에 의해 제거하고 흠이 게놈 연속성 8-10을 복원 할 결찰하고 있습니다. 한 가닥 어닐링 기계의 수리는 종종 직접적으로 반복 영역 사이의 게놈 시퀀스의 삭제가 붙어 있습니다. Rad52는 살균 11 사이에 널리 퍼져 재조합 단백질의 다양한 그룹에 속한다. 이 단백질은 또한 동종 단일 가닥 DNA 분자의 풀림을 촉진 자신의 활동을 기반으로, 단일 가닥 어닐링 단백질 (SSAPs)로 알려져 있습니다. 가장 특징 박테리오파지 SSAPs는 Redβ 및 lactococcal 파지 ul36에서 prophage RAC와 Sak의 단백질에서 박테리오파지 λ와 P22, 사각형에서 ERF 수 있습니다. 유사성이 거의 undetect 있지만 SSAPs는 구조적으로, 전형적인 β-β-β-α 배로 특징자신의 기본 시퀀스 수. 10 그들은 모두 형태의 대형 호모 중합체 링 - 체외 12-14 14 배 대칭. 이러한 특성 고차 구조 조직의 기능 의미가 잘 이해되지 않습니다. 우리는 미토콘드리아 게놈의 상동 재조합의 메커니즘을 이해에 관심이 있습니다. 우리는 이전에 사카 cerevisiae의 15 미토콘드리아 DNA의 유지에 필수적입니다 MGM101 유전자를 발견했습니다. MGM101은 이후 미토콘드리아 nucleoids과 연관된 것으로 발견되었으며, DNA를 손상 요원 미토콘드리아의 허용 오차 16이 필요합니다. 그러나 Mgm101의 연구는 재조합 Mgm101을 생산하기 위해 어려움 지난 10 년 다시 개최되었습니다. 우리는 최근에 E.에서 대량으로 용해 Mgm101 생산에 성공했다 MBP 융합 전략을 사용 대장균. 이것은 우리가 그 Mgm101 주식을 보여줄 수있게되었습니다단백질 17,18의 Rad52 - 가족과 함께 생화학 및 구조 유사성. 이 보고서에서는 세 단계 정화 절차는 균일 Mgm101for 생화학 및 구조 분석 (그림 2)을 생산하는 기술입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression vector pMAL-c2E</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#N8066S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreScission Protease</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>#27-0843-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells</td>
			<td>Strategene</td>
			<td>#230245</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#11034626001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#11359053001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#10837091001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#DN25-1G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#11411446001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose resin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#E8021L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Column chromatography column</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#7372512</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#732-4130</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO)</td>
			<td>Sartorius Stedium</td>
			<td>#VS15RH02</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 prep grade column</td>
			<td>Amersham Bioscirnces</td>
			<td>#17-0489-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO)</td>
			<td>Sartorius Stedium</td>
			<td>#VS0611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of the mgm101 recombination protein by mbp-based tagging strategy

MGM101 유전자는 미토콘드리아 DNA의 유지에있는 그것의 역할을 위해 20 년 전에 발견되었다. 여러 그룹에서 연구 Mgm101 단백질이 미토콘드리아 DNA의 재조합 복구에 관여하는 것을 제안했습니다. 최근 조사 Mgm101이 Rad52 형 재조합 단백질의 가족과 관련된 지적했다. 이 단백질은 큰 올리고머 고리를 형성하고 일치하는 단일 가닥 DNA 분자의 풀림을 촉진합니다. 그러나 Mgm101의 특성은 재조합 단백질을 생산의 어려움에 의해 방해되었다. 여기 재조합 Mgm101의 준비를위한 믿을 수있는 절차를 설명합니다. 말토오스 결합 단백질은 (MBP) 태그 Mgm101 먼저 대장균에서 발현된다. 융합 단백질은 처음 아밀로오스 친 화성 크로마토 그래피로 정제한다. 단백질 가수 분해 분열에 의해 발표 된 후, Mgm101는 양이온 교환 크로마토 그래피로 MBP에서 분리됩니다. 단 분산 Mgm101은 다음 얻을 수있다크기 배제 크로마토 그래피 있습니다. 세균성 문화의 리터 당 Mgm101의 ~ 0.87 밀리그램의 수익률은 정기적으로 얻을 수 있습니다. 재조합 Mgm101는 DNA 최소한의 오염을 보유하고 있습니다. 준비된 샘플이 성공적으로 Mgm101의 생화학 적 구조 및 단일 입자 이미지 분석에 사용됩니다. 이 프로토콜은 또한으로 misfolded 및 박테리아 세포에 독성이 될 수있는 다른 큰 올리고머 DNA-결합 단백질의 준비를 위해 사용될 수있다.

Mgm101은 미토콘드리아에서 Rad52 관련 재조합 단백질이다. Rad52은 광범위 미토콘드리아 DNA 재조합 (그림 1)에서의 역할에 대해 연구하고있다. 재조합 Mgm101은 세 단계의 절차 (그림 2)에 의해 제조 될 수있다. 이 Mgm101는 수용성 형태로 표현하고 이후 (그림 3) 단백질 가수 분해 분열에 의해 태그에서 해제 할 수 있습니다 MBP를 붙이는 전략의 사용에 의해 촉진된다. <...

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Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

효모 미토콘드리아 핵 양체 단백질, Mgm101이 큰 올리고머 고리를 형성하는 Rad52 형 재조합 단백질이다. 프로토콜은 말토오스 결합 단백질 (MBP) 태그 양이온 교환 및 크기 배제 크로마토 그래피와 결합 전략을 사용하고 수용성 재조합 Mgm101 준비를 설명합니다.

MBP 기반 태깅 전략에 의해 Mgm101 재조합 단백질의 제조

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

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