Name: preparation of the mgm101 recombination protein by mbp-based tagging strategy
Uploaded: 2013-06-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy at JoVE.com

Мы благодарим Стефан Wilkens за помощью в просвечивающей электронной микроскопии. Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья грант R01AG023731.

Предшествующие исследования показали, что первый аминоконцевой 22 остатков Mgm101 расщепляются после импорта в митохондрии 19. Для экспрессии в E. coli, MGM101 открытую рамку считывания, лишенный первых 22 кодона, амплифицируют с помощью ПЦР и размещенный ниже по течению от мужс?...

<ol>
	<li>San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+eukaryotic+homologous+recombination.">Mechanism of eukaryotic homologous recombination.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).</li><li>Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMC1:+a+meiosis-specific+yeast+homolog+of+E.+coli+recA+required+for+recombination,+synaptonemal+complex+formation,+and+cell+cycle+progression.">DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression.</a> Cell. 69, 439-456 (1992).</li><li>Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad51+protein+involved+in+repair+and+recombination+in+S.+cerevisiae+is+a+RecA-like+protein.">Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein.</a> Cell. 69, 457-470 (1992).</li><li>Passy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Dmc1+protein+binds+DNA+as+an+octameric+ring.">Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).</li><li>Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+E.+coli+recA+protein+monomer+and+polymer.">The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer.</a> Nature. 355, 318-325 (1992).</li><li>Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+structure+and+dynamics+in+the+helical+filaments+formed+by+RecA+and+Rad51+on+DNA.">Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).</li><li>Conway, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+Rad51+filament.">Crystal structure of a Rad51 filament.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).</li><li>Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+allele+of+RAD52+that+causes+severe+DNA+repair+and+recombination+deficiencies+only+in+the+absence+of+RAD51+or+RAD59.">A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59.</a> Genetics. 153, 1117-1130 (1999).</li><li>Bai, Y., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rad52+homolog+is+required+for+RAD51-independent+mitotic+recombination+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).</li><li>Paques, F., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+of+recombination+induced+by+double-strand+breaks+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).</li><li>Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+recombinases+in+bacteriophage+genomes+unveils+Rad52,+Rad51+and+Gp2.5+remote+homologs.">Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).</li><li>Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+structure+and+quaternary+organization+of+the+bacteriophage+P22+Erf+protein.">Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein.</a> J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).</li><li>Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rings+and+filaments+of+beta+protein+from+bacteriophage+lambda+suggest+a+superfamily+of+recombination+proteins.">Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).</li><li>Ploquin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+basis+for+a+bacteriophage+homolog+of+human+RAD52.">Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52.</a> Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).</li><li>Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MGM101,+a+nuclear+gene+involved+in+maintenance+of+the+mitochondrial+genome+in+Saccharomyces+cerevisiae.">MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).</li><li>Meeusen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mgm101p+is+a+novel+component+of+the+mitochondrial+nucleoid+that+binds+DNA+and+is+required+for+the+repair+of+oxidatively+damaged+mitochondrial+DNA.">Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA.</a> J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).</li><li>Mbantenkhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mgm101+is+a+Rad52-related+protein+required+for+mitochondrial+DNA+recombination.">Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination.</a> J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).</li><li>Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+properly+configured+ring+structure+is+critical+for+the+function+of+the+mitochondrial+DNA+recombination+protein.">A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein.</a> Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).</li><li>Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+core+of+the+mitochondrial+genome+maintenance+protein+Mgm101p+in+Saccharomyces+cerevisiae+determined+with+a+temperature-conditional+allele.">A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele.</a> FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).</li><li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+packaging+proteins+Glom+and+Glom2+coordinately+organize+the+mitochondrial+nucleoid+of+Physarum+polycephalum.">DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum.</a> Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).</li><li>Janicka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RAD52-like+single-stranded+DNA+binding+protein+affects+mitochondrial+DNA+repair+by+recombination.">A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination.</a> Plant J. 72, 423-435 (2012).</li></ol>

Это был вызов для получения стабильного, родные рекомбинантного белка из Mgm101 E. кишечной возможно, из-за его нерастворимость в бактериальных клетках. В этом докладе, мы покажем, что MBP-Fusion стратегии позволяет белку быть выражены на достаточно высоком уровне. При использовании отриц?...

Гомологичной рекомбинации важных для ремонта разрывов двойной нити (ДР) и interstrand поперечные связи, а для повторной инициации репликации ДНК из-под разрушенных вилки репликации 1. В обычной гомологичной рекомбинации, центральный реакция катализируется АТФ-зависимый рекомбиназы включая RecA у прокариот и Rad51 и Dmc1 у эукариот 1-3. Эти рекомбиназ образуют нуклеопротеином нитей на одноцепочечной ДНК, которые необходимы для начала поиска гомологии и прядь вторжения в дуплекс ДНК-матриц (рис. 1, слева) 4-7. В дополнение к обычной схеме, гомологичной рекомбинации также может иметь место в RecA/Rad51-independent образом (рис. 1, справа). Например, дрожжи Rad52 и Rad59 белки могут непосредственно катализировать отжига комплементарных нитей оцДНК, которые подвергаются по резекции разрывов двухцепочечной ДНК. Этот процесс рекомбинации, известный как петьLe прядь отжига, как правило, не связаны с гомологичными сопряжения с шаблонами двухцепочечной ДНК. После отжига гетерологичных хвосты удаляются экзонуклеазами и ники лигируют к восстановлению 8-10 геном непрерывности. Ремонт по одной пряди механизмом отжига часто сопровождается делеции геномных последовательностей между непосредственно повторяется регионах. Rad52 принадлежит разнообразная группа белков, которые рекомбинации широко распространены среди бактериофагов 11. Эти белки также известны как Одноместный Strand отжига Белки (SSAPs), основанный на их деятельности в продвижении отжига гомологичных одноцепочечной молекулы ДНК. Лучше всего характеризует SSAPs бактериофага Redβ и Erf от бактериофагов λ и Р22, прямоугольный от профаге RAC и белок от Сак lactococcal ul36 фага. SSAPs структурно характеризуется типичным β-β-β-α раза, хотя сходство практически undetectсостоянии в их первичных последовательностей. Все они образуют большие гомо-олигомерных кольца из 10 - 14 кратной симметрии в пробирке 12-14. Функциональное значение этой характеристики высшего порядка структурной организации не очень хорошо понял. Мы заинтересованы в понимании механизма гомологичной рекомбинации митохондриального генома. Ранее мы уже определили MGM101 ген, который имеет важное значение для поддержания мтДНК в Saccharomyces CEREVISIAE 15. MGM101 Впоследствии было обнаружено, связаны с митохондриальной нуклеоидах и необходима для допуска мтДНК с ДНК-повреждающих агентов 16. Тем не менее, изучение Mgm101 был проведен еще в последнее десятилетие из-за сложности для получения рекомбинантного Mgm101. Мы недавно удалось получить растворимые Mgm101 в больших количествах из E. палочка помощью MBP-Fusion стратегии. Это позволило нам продемонстрировать, что Mgm101 акцийбиохимические и структурные сходства с Rad52-семейства белков, 17,18. В этом отчете, трехступенчатой ​​очистки процедура описана, который производит однородную Mgm101for биохимических и структурного анализа (рис. 2).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression vector pMAL-c2E</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#N8066S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreScission Protease</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>#27-0843-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells</td>
			<td>Strategene</td>
			<td>#230245</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#11034626001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#11359053001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#10837091001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#DN25-1G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#11411446001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose resin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#E8021L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Column chromatography column</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#7372512</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#732-4130</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO)</td>
			<td>Sartorius Stedium</td>
			<td>#VS15RH02</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 prep grade column</td>
			<td>Amersham Bioscirnces</td>
			<td>#17-0489-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO)</td>
			<td>Sartorius Stedium</td>
			<td>#VS0611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of the mgm101 recombination protein by mbp-based tagging strategy

Ген MGM101 был определен 20 лет назад за его роль в поддержании митохондриальной ДНК. Исследования, проведенные в нескольких группах показали, что белок Mgm101 участвует в рекомбинационной репарации митохондриальной ДНК. Недавние исследования показали, что Mgm101 связана с Rad52 типа белка семейства рекомбинации. Эти белки образуют крупные олигомерные кольца и содействие отжига гомологичных одноцепочечной молекулы ДНК. Тем не менее, характеристика Mgm101 было затруднено из-за сложности в производстве рекомбинантного белка. Здесь надежный способ получения рекомбинантного Mgm101 описано. Белок, связывающий мальтозу (МВР) с метками Mgm101 впервые экспрессируется в E. coli. Слитый белок сначала очищали аффинной хроматографией амилозы. После освобождения путем протеолитического расщепления, Mgm101 отделена от MBP с помощью хроматографии катионного обмена. Монодисперсные Mgm101 затем получаютпо размеру хроматографии. Выход ~ 0,87 мг Mgm101 на литр бактериальной культуры может быть получена регулярно. Рекомбинантный Mgm101 имеет минимальное загрязнение ДНК. Подготовленные образцы успешно используются для биохимических, структурных и одна частица изображений анализы Mgm101. Этот протокол может также использоваться для получения других больших олигомерные ДНК-связывающих белков, которые могут быть неправильно свернутых и токсичными для бактериальных клеток.

Mgm101 является Rad52 связанных рекомбинации белка в митохондриях. Rad52 была тщательно изучена за его роль в митохондриальной ДНК-рекомбинации (рис. 1). Рекомбинантный Mgm101 могут быть получены тремя этапами процедуры (рис. 2). Этому способствует использование MBP-тегов стратеги?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy at JoVE.com

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

Митохондриальных белков дрожжей нуклеоидом, Mgm101, является Rad52 типа рекомбинации белок, который образует крупные олигомерные кольцами. Протокол описан подготовить растворимых рекомбинантных Mgm101 использованием белок, связывающий мальтозу (МВР)-тегов стратегия в сочетании с катионообменной хроматографии и гель.

Подготовка Mgm101 рекомбинации белка на основе МВР тегов стратегии

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Predicting the Effectiveness of Population Replacement Strategy Using Mathematical Modeling

Прогнозирование эффективности населения Стратегия Замена использованием математического моделирования

Charles Taylor and John Marshall explain the utility of mathematical modeling for evaluating the effectiveness of population replacement strategy.  ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Использование GELFREE 8100 Фракционирование Система Молекулярный вес основе фракционирования с жидким этапе восстановления

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

Определение воздействия на Мутации BRCA1 гомологичной рекомбинации с использованием клеток, которые экспрессируют эндогенного дикого типа BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Генетическая модификация и рекомбинации слюнных желез органной культуры

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Улучшение Шанс белка кристаллизации случайным Microseed Matrix скрининга

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Подготовка сегментированных микротрубочек исследовать движение приводится в действие разборки микротрубочек Ends

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в<em&gt; Кишечная палочка</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Фекальные глюкокортикоиды Анализ: безоперационная Надпочечная Мониторинг в Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

Определение белка субцеллюлярные локализации зеленый флуоресценции белков пометки и 4', 6-Diamidino-2-phenylindole окрашивание Caenorhabditis elegans