Name: 4d multimodality imaging of citrobacter rodentium infections in mice
Uploaded: 2013-08-13T12:00:00
Duration: 12 min 38 s
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El servicio de imágenes en vivo en el Imperial College fue financiado por el MRC.

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	<li>Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Luciferase+to+Image+Bacterial+Infections+in+Mice.">Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice.</a> J. Vis. Exp. (48), e2547 (2011).</li><li>Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium.">In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infect Immun. 74, 5391-5396 (2006).</li><li>Wiles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+specificity,+colonization+and+clearance+dynamics+in+vivo+following+oral+challenges+with+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium.">Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Cell Microbiol. 6, 963-972 (2004).</li><li>Wiles, S., Dougan, G., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+a+'hyperinfectious'+bacterial+state+after+passage+of+Citrobacter+rodentium+through+the+host+gastrointestinal+tract.">Emergence of a 'hyperinfectious' bacterial state after passage of Citrobacter rodentium through the host gastrointestinal tract.</a> Cell Microbiol. 7, 1163-1172 (2005).</li><li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifidobacterial+surface-exopolysaccharide+facilitates+commensal-host+interaction+through+immune+modulation+and+pathogen+protection.">Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2108-2113 (2012).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li><li>Collins, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-treatment+with+Bifidobacterium+breve+UCC2003+modulates+Citrobacter+rodentium-induced+colonic+inflammation+and+organ+specificity+of+infection.">Pre-treatment with Bifidobacterium breve UCC2003 modulates Citrobacter rodentium-induced colonic inflammation and organ specificity of infection.</a> Microbiology. , 10-1099 (2012).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol. Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li><li>Hardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+replication+of+Listeria+monocytogenes+in+the+murine+gall+bladder.">Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder.</a> Science. 303, 851-853 (2004).</li><li>Szittner, R., Meighen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence,+expression,+and+properties+of+luciferase+coded+by+lux+genes+from+a+terrestrial+bacterium.">Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium.</a> J. Biol. Chem. 265, 16581-16587 (1990).</li><li>Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+antituberculosis+drug+activity+in+vitro+and+in+macrophages+using+bioluminescence.">Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence.</a> J. Antimicrob. Chemother. 67, 404-414 (2012).</li><li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging.">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J. Biomed. Opt. 12, 024007 (2007).</li><li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+in+vivo+bioluminescent+imaging+for+the+study+of+bacterial+tumour+targeting.">High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting.</a> PLoS One. 7, e30940 (2012).</li><li>Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrobacter+rodentium+of+mice+and+man.">Citrobacter rodentium of mice and man.</a> Cell Microbiol. 7, 1697-1706 (2005).</li><li>Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+variations+of+skin+pigmentation+in+C57BL/6+mice+affect+optical+bioluminescence+quantitation.">Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation.</a> Mol. Imaging Biol. 13, 1114-1123 (2011).</li><li>Wiles, S., Crepin, V. F., Childs, G., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+biophotonic+imaging+as+a+training+aid+for+administration+of+substances+in+laboratory+rodents.">Use of biophotonic imaging as a training aid for administration of substances in laboratory rodents.</a> Lab Anim. 41, 321-328 (2007).</li><li>Crepin, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+the+Tir:Nck+and+Tir:IRTKS/IRSp53+signalling+pathways+in+vivo.">Dissecting the role of the Tir:Nck and Tir:IRTKS/IRSp53 signalling pathways in vivo.</a> Mol. Microbiol. 75, 308-323 (2010).</li><li>Willekens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+radiation+dose+in+micro-CT+with+optimization+of+the+scan+protocol.">Evaluation of the radiation dose in micro-CT with optimization of the scan protocol.</a> ContrastMedia Mol. Imaging. 5, 201-207 (2010).</li><li>Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-animal+X-ray+dose+from+micro-CT.">Small-animal X-ray dose from micro-CT.</a> Mol Imaging. 3, 149-158 (2004).</li><li>Sato, F., Sasaki, S., Kawashima, N., Chino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+effects+of+whole+or+partial+body+x-irradiation+on+mice:+life+shortening.">Late effects of whole or partial body x-irradiation on mice: life shortening.</a> Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 39, 607-615 (1981).</li><li>Kohn, H. I., Kallman, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+strain+on+acute+x-ray+lethality+in+the+mouse.+II.+Recovery+rate+studies.">The influence of strain on acute x-ray lethality in the mouse. II. Recovery rate studies.</a> Radiat. Res. 6, 329-338 (1957).</li></ol>

La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por PerkinElmer. Los autores Kevin P, Francis, Jeff Meganck y Chaincy Kuo son empleados de pinza-A Company PerkinElmer. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los procedimientos científicos Animals Act 1986 y fueron aprobados por el Comité de Ética local.

La película 4D de infección bacteriana es una herramienta útil para visualizar e interpretar grandes cantidades de datos de imágenes multimodalidad rápida y fácilmente. Esta técnica facilita el análisis detallado de cómo una infección se propaga a través de un ratón individual y se puede utilizar para investigar cómo la eliminación de host o genes bacterianos o particular, las estrategias de intervención efecto de la carga bacteriana, la distribución, y la localización durante un estudio longitudinal 7. Estos videos también ofrecen materiales didácticos útiles y un medio de difusión de información al público. Hay varios pasos críticos en este protocolo que podrían afectar a la calidad de los datos obtenidos a partir de imágenes DLIT-μCT y la capacidad para compilar un video 4D de la infección. La parte más importante de este protocolo es el éxito de la infección y homogénea de los ratones con C. rodentium. Es esencial que los ratones utilizados para el estudio son entre 18-20 g y que la bacrial inóculos se preparan y aproximadamente 5 x 10 9 ufc, como se ha descrito previamente 2,3. Antes de la infección de los ratones es importante comprobar que el inóculo es bioluminiscente usando el espectro CT y una vez que el inóculo se ha preparado, que debe ser homogeneizada continuamente delante de cada ratón se gavaged para asegurar que los ratones reciben dosis infecciosas similares. La imagen DLIT-μCT de los ratones se ha optimizado para que la función de exposición automática en el software 4.3.1 Imagen Living determina automáticamente los parámetros de imagen óptimos para la señal de estar bien por encima del ruido. Sin embargo, la función de exposición automática se basa en la configuración y los parámetros definidos por el usuario que necesitan ser modificados como se describe en el procedimiento. De no hacerlo, dará lugar a imágenes de baja calidad con un bajo número de fotones recogidos que no den lugar a una progresión evidente en la infección, como los ajustes de fábrica del Spectrum CT de exposición automática se programan para los tumores que expresan imágenesla luciferasa de luciérnaga. Reconstrucciones realizaron con 560 a 620 nm dan la mejor concordancia entre los datos simulados y medidos y, por lo tanto, son los datos más fiables para incluir en la reconstrucción. Una limitación al uso de DLIT-μCT es que la radiación ionizante de la exploración μCT provoca daño de la radiación subletal que es acumulado en un estudio longitudinal 18. Exposición a la radiación subletal puede debilitar la respuesta inmune, provocar daños en el ADN, y la apoptosis en los órganos internos 19. En última instancia, daños por radiación subletal acumulada puede causar la muerte si la DL 50/30 para la radiación ionizante se excede, que está entre 5 y 7 Gy dependiendo de la cepa de ratón y la edad de los ratones utiliza 18,20,21. Aunque algunos de los daños molecular de las radiaciones ionizantes puede curar, ya que el principio general es el de estimar la dosis de forma conservadora, esto no suele ser contabilizada en la planificación del estudio. En cambio, el objetivo es mantenerse lo más below estos límites como sea posible al tiempo que el cumplimiento de los objetivos del estudio. Esto es particularmente importante en este estudio debido a la respuesta inmune normal a la infección, la frecuencia de formación de imágenes, y el hecho de que transgénico, inmuno-compuesto, o muy infectado animales pueden ser más susceptibles a la radiación ionizante. Al planificar el experimento para generar una película 4D de la infección, es importante tener en cuenta la longitud del experimento, el número de μCT escanea requerido durante este periodo y la DL 50/30 para la radiación ionizante para la cepa de ratón que está siendo utilizado. Otra limitación potencial de DLIT-μCT es la fuerza de la expresión del indicador dentro de la cepa bacteriana utilizada, ya que esto afectará límites de detección bacterianas y los tiempos de formación de imágenes. Es muy recomendable que los investigadores utilizan validados cepas bacterianas que son totalmente virulento, pero optimizado para máxima operón lux expresión, como se ha demostrado previamente para BLI2,3. Una advertencia para el diseño actual de la formación de imágenes 4D es que cada película se compone de exploraciones DLIT-μCT individuales que tienen diferente escala de fotones. Esto puede hacer que las imágenes difíciles de interpretar si los cambios en la localización de la BL focos, o su intensidad son sutiles, o si hay un foco BL intensa rodeada por múltiples focos débil. Por lo tanto, para visualizaciones longitudinales, es importante para mantener las barras de color consistente a través de los puntos de tiempo. El concepto de una película 4D de la infección se puede aplicar a cualquier patógeno bacteriano convenientemente etiquetado. El desarrollo futuro de esta técnica tendrá como objetivo utilizar la tomografía de imágenes de fluorescencia (FLIT), así como DLIT para facilitar la investigación de las respuestas del huésped a la infección usando una combinación de patógenos bacterianos y bioluminiscentes inyectables sondas fluorescentes cerca de infrarrojos para investigar las respuestas del huésped a la infección. Además de esto, en este protocolo sólodescriben el uso de bacterias bioluminiscentes para crear películas 4D de la infección. Sin embargo, en algunos casos, puede ser necesario el uso de bacterias marcadas fluorescentes, por ejemplo, etiquetado con IRFP, de modo que el reportero bioluminiscencia se puede utilizar para la investigación genética del huésped durante la infección. Es importante destacar que el uso de imágenes multimodalidad que combina DLIT / FLIT-μCT nos permitirá investigar de manera no invasiva varios parámetros durante una infección bacteriana, lo que contribuirá de manera significativa a la reducción, refinamiento y reemplazo del uso de animales en la investigación científica como se indica en la iniciativa del NC3R ( <a href="http://www.nc3rs.org.uk/" target="_blank">http://www.nc3rs.org.uk/</a> ).

Modelos animales pequeños, en particular, aquellos ratones que utilizan, se utilizan habitualmente para investigar la patogénesis bacteriana o para poner a prueba las estrategias de intervención para las infecciones, tales como antibióticos, probióticos, prebióticos y vacunas 1-7. Los principales lecturas experimentales de infecciones animales pequeños son la carga de patógenos, la localización espacial y temporal de la infección, y los cambios en la respuesta inmune del organismo infectado. En imagen óptica in vivo es una herramienta valiosa para la investigación de enfermedades infecciosas y se pueden utilizar para supervisar múltiples lecturas experimentales mediante el uso de genes informadores (luciferasa, proteínas fluorescentes, beta-lactamasa, etc), colorantes fluorescentes, nanopartículas o sondas quimioluminiscentes dirigidos a una proteína, proceso biológico, o microorganismo 6. Imágenes de bioluminiscencia (BLI) es una modalidad de imagen óptico utilizado para controlar la colonización de los animales pequeños, tales como ratones y ratas, por bac patógenaria 3,6,8,9. Los ratones se infectan con bacterias recombinantes que expresan una luciferasa, tales como el operón lux CDABE de Photorhabdus luminescens. Estas bacterias pueden entonces ser detectados a través de su producción de luz usando un CCD basado en formación de imágenes in vivo del sistema 3,6,9. Es importante destacar que sólo los microorganismos metabólicamente activas son bioluminiscentes (BL), es decir, sólo las células bacterianas viables se detectan mediante esta metodología 10,11. Uso de 2D BLI, la ubicación de la fuente de BL se infiere de la superficie del animal en el que se emitió la señal 8. La localización anatómica exacta de los focos BL in vivo tiene que ser determinada mediante el análisis ex vivo de órganos 3,6,9 En contraste, tomografía compuesto 3D difusa la luz de imagen (DLIT) puede ser utilizado para compilar una reconstrucción 3D cuantitativa de la BL fuente 12. DLIT se lleva a cabo mediante la recopilación de BL imágenes tomadas con filtros ópticos de paso de banda estrecha definidos yposteriormente insertando en ellos una tomografía óptica difusa algoritmo de reconstrucción 3D 1,7,12,13. Actualmente, modalidad de imágenes múltiples es la única metodología disponible para obtener verdadera localización anatómica no invasiva de bioluminiscente focos in vivo sin la necesidad de un análisis ex vivo. Recientemente, se utilizó una combinación de DLIT co-registrado con μCT formación de imágenes para evaluar Citrobacter rodentium (C rodentium) dinámica de colonización después del tratamiento profiláctico con una bacteria probiótica 7. C. rodentium es un patógeno entérico murino específico utilizado para modelar la infección humana por enteropatógenos y enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. infección rodentium causas de la colitis, típicamente asociado con la pérdida leve de peso, diarrea, polarizado respuesta inmune Th1 y cambios patológicos distintos, incluyendo hiperplasia de las criptas del colon y adhesión y borrado lesión formatiel 14. Además de esto, C. patogénesis rodentium se ha estudiado a fondo el uso de BLI y su dinámica de colonización en ratones C57BL/6J están bien documentadas, por lo que esta bacteria un microorganismo modelo ideal para su uso con múltiples modalidades de imagen 3,4,7. Este protocolo es el primero en describir una metodología para la formación de imágenes DLIT-μCT integrado de una infección bacteriana utilizando una única plataforma de formación de imágenes multimodalidad, el IVIS Spectrum CT, y la generación de una película de 4D que muestra la verdadera dinámica de esta infección no invasiva.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescent C. rodentium</td>
			<td>Frankel lab</td>
			<td>ICC180</td>
			<td>Wiles et al., 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet</td>
			<td>Boots</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane (100% v/v)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Oxygen</td>
			<td>BOC Medical</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td>25 g in 1L Demineralised water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.10283.0500</td>
			<td>37 g in 1L Demineralised water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Sigma (Fluka)</td>
			<td>60615</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Falcon tubes</td>
			<td>BD (Falcon)</td>
			<td>352070</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universals</td>
			<td>Corning (Gosselin)</td>
			<td>E5633-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD (Plastipak)</td>
			<td>300013</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved</td>
			<td>Vet Tech</td>
			<td>DE005</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbanks (Cryovial)</td>
			<td>Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td>PL.170/Y</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum CT</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>133577 Rev A/ Spectrum CT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6kVA UPS</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 anesthesia system</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>118918</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAF-8 Anaesthesia filter charcoal</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>118999/00</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image v4.3.1 SP1</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 44</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d multimodality imaging of citrobacter rodentium infections in mice

Este protocolo describe los pasos necesarios para el seguimiento longitudinal de una infección bacteriana bioluminiscente mediante tomografía 3D compuesta de imágenes con luz difusa integrada μCT (DLIT-μCT) y el uso posterior de estos datos para generar una película del ciclo de infección de cuatro dimensiones (4D). Para desarrollar las películas de infección 4D y para validar la formación de imágenes DLIT-μCT para estudios de infección bacteriana usando un espectro CT IVIS, hemos utilizado la infección con C. bioluminiscente rodentium, que causa colitis espontánea en ratones. En este protocolo, se esboza la infección de ratones con bioluminiscente C. rodentium y la monitorización no invasiva de la colonización por el diario de imágenes DLIT-μCT y enumeración de bacterias de las heces durante 8 días. El uso de la IVIS Spectrum CT facilita la co-registro sin fisuras de las exploraciones ópticas y μCT utilizando una única plataforma de imágenes. La modalidad μCT dosis bajas permite la generación de imágenes de los ratonesen múltiples puntos de tiempo durante la infección, proporcionando localización anatómica detallada de focos de bacterias bioluminiscentes en 3D sin causar artefactos de la radiación acumulativa. Es importante destacar que el cine 4D de ratones infectados proporcionan una poderosa herramienta de análisis para monitorear la dinámica de colonización bacteriana in vivo.

La infección de ratones C57BL/6J con 5 x 10 9 ufc C. rodentium es un modelo de infección bacteriana bien descrita y resulta en una infección gastrointestinal auto-limitante que los picos entre 6-8 días después de la infección y dura entre 3 a 4 semanas 2,14. La infección se limita a la luz intestinal por el sistema inmune murino y, como consecuencia, las bacterias se desprenden continuamente en las heces. La colonización de ratones por C. rodentium se puede controlar de forma no invasiva por enumeración bacteriana directa de las heces, o de formación de imágenes de bioluminiscencia 2,3. Este manuscrito describe un protocolo optimizado para la realización de 3D ​​y 4D de imágenes multimodalidad de C. rodentium dentro de ratones para monitorizar la carga bacteriana y la localización durante la infección. Los resultados presentados en la Figura 1 demuestran los controles que se requieren para el éxito de formación de imágenes 4D. Antes de la infección de los ratones, es esencial para disuadirmina que el inóculo bacteriano utilizado es bioluminiscente (Figura 1A) y que, tras la alimentación forzada oral de un ratón con bioluminiscente C. rodentium, que la señal se puede observar en el estómago del animal y no en los pulmones (Figura 1B) 16. Además de controlar la colonización bacteriana utilizando imágenes de bioluminiscencia, es una buena práctica para cuantificar el número de bacterias en las heces; que se utiliza como una medida indirecta de la colonización bacteriana de la mucosa gastrointestinal Figura 2 demuestra la carga bacteriana típica en las heces tomada de 8 ratones C57BL6 / J. ratones que han sido infectadas con el ~ 5 x 10 9 ufc ICC180 y monitoreados durante 8 días PI aumenta Colonización del día 2 PI hasta el día 6-7, donde los picos de infección en ~ 5 x 10 10 ufc / g, que está en consonancia con los informes anteriores 2,3,17. Para enfatizar la importancia de la evaluaciónting de la propagación de la infección en un solo ratón, Figuras 1b y 3, así como Video 1 se han generado a partir del mismo ratón después de C. rodentium infección, como se describió anteriormente. Diario DLIT-μCT se utilizó para evaluar la distribución espacial de las bacterias bioluminiscentes dentro de este ratón, utilizando el esqueleto como referencia anatómica. Figura 3 demuestra la reconstrucción DLIT-μCT de un ratón C57BL/6J infectado con ICC180 en 3 puntos de tiempo clave PI En día 3 PI pequeña bioluminiscente focos se puede observar en el colon, que exhiben un aumento moderado de la intensidad de bioluminiscencia por 5 días PI con poco cambio en la distribución espacial. En el día 7 PI se observó un aumento significativo en bioluminiscencia y los focos propagación bioluminiscente a través de todo el colon. Video 1 es una recopilación de las reconstrucciones 3D DLIT-μCT de 1-8 días PI con ICC180 e ilustra C.rodentium dentro del tracto gastrointestinal proximal entre 1-2 días PI que se extiende a los dos puntos en el día 3 PI De 4-6 días PI los números de bacterias en el colon se expanden hasta alcanzar un máximo de 7 días PI donde los focos bacteriana cubre todo el colon. En el día 8 PI sólo dos focos distintas de bacterias están presentes en el colon proximal y distal. La posibilidad de ver la reconstrucción en 3D en cada momento en orden cronológico representa una poderosa herramienta para analizar las interacciones patógeno de acogida y es más fácil de interpretar que un 3D aún del mismo conjunto de datos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig1.jpg" /> Figura 1. Bioluminiscencia de imágenes 2D de A) bioluminiscente C. rodentium ICC180 inóculo y B) un ratón después de una sonda oral con 200 l del inóculo. Punta de flecha (&gt;) ilustra bioluminiscente C. rodentium </<html> em&gt; en el estómago. <img alt="La figura 2" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig2.jpg" /> Figura 2. C. dinámica de colonización. rodentium cuantificación de C. rodentium unidades formadoras de colonias de las heces durante 8 días PI <img alt="Figura 3" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3.jpg" /> Figura 3. La luz difusa imagen de tomografía computarizada de μCT bioluminiscente C. infección rodentium de un ratón de un control en el día 3, 5 y 7 PI punta de flecha (&gt;) ilustra la colonización del colon. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50450/50450fig3large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . Video 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver el video. película 4D de la infección por C. rodentium de un ratón controlado de 1-8 días PI

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4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Imágenes multimodalidad es un enfoque valioso para el estudio de la colonización bacteriana en los modelos animales pequeños. Este protocolo describe la infección de ratones con bioluminiscente<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Y el seguimiento longitudinal de la colonización bacteriana mediante tomografía luz difusa 3D compuesto con μCT de imágenes para crear una película de 4D<em&gt; C. rodentium</em&gt; Infección.

4D de imágenes multimodalidad<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Las infecciones en ratones

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Luciferasa utilizando a las infecciones bacterianas de la imagen en ratones

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Investigación

Inmunología e Infección

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

La<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Modelo: Estudiar Contribuciones patógeno y del huésped a la colitis infecciosa

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Crónica a largo plazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infección de las vías respiratorias en los ratones

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

Los cultivos humanos de la placenta y Decidual de órganos para el Estudio de Infecciones en la interfase materno-fetal

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

En Vivo Investigación de Terapia de luz azul antimicrobianos para multirresistente Acinetobacter baumannii infecciones de quemaduras El uso de bioluminiscencia Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Proyección de imagen de tuberculosis del Mycobacterium en ratones con reportero enzima fluorescencia

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Imágenes de Ca2 + respuestas durante la infección de Shigella de células epiteliales

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Proyección de imagen confocal de ARN bicatenario y receptores de reconocimiento de patrón en la infección por Virus de ARN de sentido negativo

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Implantation and Monitoring by PET/CT of an Orthotopic Model of Human Pleural Mesothelioma in Athymic Mice

Implantación y monitorización por PET/CT de un modelo ortotópico de mesotelioma pleural humano en ratones atímicos

Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a rare and aggressive tumor arising in the mesothelium that covers the lungs, the heart, and the thoracic cavity. ...