Name: adenoviral transduction of naive cd4 t cells to study treg differentiation
Uploaded: 2013-08-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Lirui Du построения pCAGAdDU вектора и Оливер Горка для обеспечения фиксации протокола.

1. Клонирование гена в векторной записи <ol><li> Клонирование гена в векторной записи. ПЦР-амплификации гена, за которым лигирование тупых концов в топоизомеразы связью вектор (например pENTR / D-TOPO) или рестриктазы-опосредованного клонирование может быть использован для этой процедуры....

<ol>
	<li>Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+Foxp3++regulatory+T+cells+induces+a+scurfy-like+disease.">Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).</li><li>Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+and+expanding+regulatory+T+cell+populations+by+foreign+antigen.">Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen.</a> Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).</li><li>Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+CD25(+)CD4(+)+regulatory+T+cells+by+oral+antigen+administration.">Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).</li><li>Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymically+generated+regulatory+T+cells+control+mucosal+TH2+inflammation.">Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation.</a> Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).</li><li>Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+generation+of+regulatory+T+cells+in+placental+mammals+mitigates+maternal-fetal+conflict.">Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict.</a> Cell. 150 (1), 29-38 (2012).</li><li>Laurence, A., Amarnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+Transcription+Factor+Promotes+Instability+of+nTreg+Cells+and+Limits+Generation+of+iTreg+Cells+during+Acute+Murine+Graft-versus-Host+Disease.">STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease.</a> Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).</li><li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoregulatory+T+cells+in+tumor+immunity.">Immunoregulatory T cells in tumor immunity.</a> Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).</li><li>Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., H&#228;mmerling, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Treg+depletion+induces+T-cell+infiltration+and+rejection+of+large+tumors.">Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors.</a> European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).</li><li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4+CD25++regulatory+T+cells.">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li><li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3.">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li><li>Chen, W., Jin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Peripheral+CD4+CD25-+Naive+T+Cells+to+CD4+CD25++Regulatory+T+Cells+by+TGF-&#946;+Induction+of+Transcription+Factor+Foxp3.">Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-&#946; Induction of Transcription Factor Foxp3.</a> The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).</li><li>Xu, W., Lan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+induced-treg+cells+effectively+attenuates+murine+airway+allergic+inflammation.">Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation.</a> PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).</li><li>Circosta, P., Granziero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+(TCR)+gene+transfer+with+lentiviral+vectors+allows+efficient+redirection+of+tumor+specificity+in+naive+and+memory+T+cells+without+prior+stimulation+of+endogenous+TCR.">T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR.</a> Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).</li><li>Patel, C., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency,+Site-specific+Transfection+of+Adherent+Cells+with+siRNA+Using+Microelectrode+Arrays+(MEA).">High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA).</a> J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).</li><li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells.">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).</li><li>Leon, R. P., Hedlund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+gene+transfer+in+lymphocytes.">Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).</li><li>Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+expression+of+the+coxsackie/adenovirus+receptor+enables+adenoviral-mediated+gene+delivery+in+naive+T+cells.">Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).</li><li>Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+adenovirus-mediated+gene+transfer+into+primary+T+cells+and+thymocytes+in+a+new+coxsackie/adenovirus+receptor+transgenic+model.">Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model.</a> BMC Immunology. 3, 4 (2002).</li><li>Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+Carma1+by+PP2A+negatively+regulates+T-cell+activation.">Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation.</a> The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).</li><li>Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roquin+binds+inducible+costimulator+mRNA+and+effectors+of+mRNA+decay+to+induce+microRNA-independent+post-transcriptional+repression.">Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression.</a> Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).</li><li>Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5.">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li><li>Landy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+structural,+and+regulatory+aspects+of+lambda+site-specific+recombination.">Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination.</a> Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).</li><li>Bernard, P., Couturier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+killing+by+the+F+plasmid+CcdB+protein+involves+poisoning+of+DNA-topoisomerase+II+complexes.">Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes.</a> Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).</li><li>Thai, T. -. H., Calado, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Germinal+Center+Response+by+MicroRNA-155.">Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155.</a> Science. 316 (5824), 604-608 (2007).</li><li>Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+bic/microRNA-155+for+Normal+Immune+Function.">Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function.</a> Science. 316 (5824), 608-611 (2007).</li><li>Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Dicer+in+immune+regulation.">A role for Dicer in immune regulation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).</li><li>Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-&#947;+Production+in+Helper+T+Cells.">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-&#947; Production in Helper T Cells.</a> Immunity. , (2011).</li></ol>

Поколение Вирус и титрование Для получения оптимальных результатов трансфекции, качество и количество векторных линеаризованной представляются наиболее важными. Мы не наблюдали негативных последствий от производства сырья лизат из начальных разрастание культуры с ин...

Tregs имеют решающее значение для поддержания иммунной толерантности и, чтобы ослабить превышение иммунных реакций. Tregs подавлять наблюдателем активацию Т-клеток. Следовательно, абляция Tregs приводит к фатальным аутоиммунные и самоуничтожение обусловлен активированных Т-клеток 1. Tregs развиваться в тимусе при отрицательной селекции клеток CD4 одним положительным предшественников, но они также могут дифференцироваться в периферии от наивных CD4 Т-клеток при низких дозах антигена стимуляции с субоптимальной костимуляцию 1,2. Тимуса Tregs кажется подавить ткани аутоиммунные против аутоантигенов, в то время как периферийная Tregs были вовлечены в обеспечении толерантности в кишки или легкого. Эти индуцированные Tregs мощно предотвратить активацию Т-клеток после признания чужеродных антигенов в слизистой оболочке, в том числе экологических антигенов из пищи и воздуха, синантропных бактерий и аллергенов 3,4. Кроме того, Tregs имеют решающее значение для создания материнской толерантности к плода пептиды 5 и предварительновентиляционные трансплантат против хозяина 6. В то же время, Tregs также посредником нежелательных эффектов путем ослабления иммунного надзора опухолевых клеток 7,8. Отличительной особенностью Tregs является выражением подмножество указанием Foxp3-фактор транскрипции, вилка-головной домен-содержащий транскрипционный фактор, который является необходимым и достаточным для придания Treg функции 9,10. Некоторые сигнальных путей, которые могут индуцировать Foxp3 экспрессии, хорошо известны. Однако молекулярные процессы, контроля, регулирования, или модулировать Treg дифференцировка на Т-клеточный рецептор запуска менее понятны. Tregs может быть очень эффективно индуцированных в пробирке посредством стимуляции наивным Т-клеток CD4 анти-CD3 и анти-CD28 антитела в присутствии TGF-и ИЛ-2 11. Поскольку новые Tregs функциональны в естественных условиях, манипулирование молекулами, которые способствуют Treg дифференциации несет огромный потенциал для будущего therapiы, например, при лечении астмы, болезни Крона, и трансплантации 11,12. С другой стороны, терапевтическое модуляции молекул блокировать Treg дифференциации может принести пользу в будущем подходы комбинированного лечения онкологических больных. В анализах пробирке дифференциации играют важную роль для описания молекулярных изменений, которые связаны с Т дифференциации подмножество клетки. На данный момент экспериментальные попытки поиска или экран для генных продуктов, которые контролируют дифференцировки Т-клеток препятствует тот факт, что наиболее распространенными методами эктопической экспрессии гена неудачу в наивных Т-клеток. Например, электропорации и ретровирусной трансдукции эффективны только в активированных Т-клеток. В отличие от первоначальных ожиданий, лентивирусов трансдукции, которое обычно эффективны в покоящихся клеток, требует предварительной активации наивных Т-клеток цитокинами 13. Кроме того, передача кДНК или мРНК во время электропорациивключает деполяризацию мембраны плазмы, которая сама дает особенности активации Т-клеток и может даже мобилизации Са 2 + сигналов и активировать NFAT белков (неопубликованные наблюдения и реф. 14). Аналогично, для ретровирусов трансдукции, наивные Т-клетки должны быть активированы в течение 18 - 40 часов. В течение этого времени распада ядерной мембраны в процессе клеточного деления происходит и позволяет последующей интеграции геномной ретровирусный вектор 15. Эти методы являются, следовательно, не в состоянии решать начале молекулярный регулирование начальной Т встречи клетки с антигеном, который является решающей фазе помощник дифференцировки Т-клеток. Аденовирусной трансдукции, как известно, придают переходных эктопической экспрессии гена в ряде типов клеток человека, которые экспрессируют человеческий рецептор аденовируса Коксаки (CAR). Это продолжается без требования для активации клеток или клеточного цикла. Поверхностную экспрессию CAR необходимо эффективное присоединение вируса и интернализации и трансгенной экспрессии усеченной версии CARΔ1 под Т-клеток промотора было установлено, оказывают мышь тимоцитов и Т-клетки, восприимчивыми к аденовирусной инфекции 16. Важно отметить, что трансгенов не изменяет тимоцитов развития или в пробирке дифференцировки наивных CD4 Т-клеток в различные подмножества (данные не приводятся; ссылка 17.). Аденовирус трансдукции Т-клеток был ранее использован для сверхэкспрессию 17,18 и нокдауна подходы 19,20. Трансгенных клеток T может быть очищен из коммерчески доступных DO11.10 ТГ; CARΔ1 ТГ (Taconic, Inc и ссылка 17.). Важно отметить, что аденовирусной трансдукции позволяет с высокой экспрессией гена интереса к наивным Т-клеткам, не вызывая очевидных признаков активации. Т-клетки остаются наивными (CD44 низкий, CD62L высокий) и отдыха (CD25 -, CD69 -) после Infectiна и может быть активирована и дифференцировались в Treg похожа на неинфицированных клеток. Получение рекомбинантных аденовирусов может быть достигнута после трансфекции клетки HEK293A с аденовирусной плазмиды (фиг. 1). Эти плазмиды обычно содержат человеческий тип 5 геном аденовируса с E1 и E3 генов удален оказывать рекомбинантных аденовирусов репликации некомпетентные 21. HEK293A клетки дополняют репликации дефицита, как они были увековечены через стабильной интеграции стриженого аденовирус 22. С аденовирусных векторов большие (~ 40 Kb) и, следовательно, не очень хорошо подходит для традиционных ферментов рестрикции-опосредованной клонирование, мы использовали шлюза системы. Интерес ген первоначально клонировали в меньший входной вектор, из которого можно легко переносить в аденовирусный вектор назначения через лямбда реакции рекомбинации (LR) 23. Мы построили pCAGAdDu векторпутем объединения CAG промотор (курица промотор актина и энхансер CMV) счет экспрессирующей кассеты, содержащей LR сайтов, фланкирующих прокариотических выбор CCDB маркер 24. Эта кассета экспрессии слитого с внутреннего входа рибосом (IRES) элемент, который позволяет совместной экспрессии эукариотических инфекции маркер усиленный зеленый флуоресцентный белок (УЗФБ), которые слиты с последовательностью, содержащей бычьего гормона роста поли (А)-сигнала. Мы выбрали CAG цис-регуляторных последовательностей, так как прототип промотор CMV было обнаружено, что чрезвычайно-зависимой активации и, следовательно, неблагоприятных для экспрессии генов в наивным Т-клеток. Здесь мы приводим протокол для эффективной дифференциации в пробирке Treg и способу для трансдукции наивных CD4 Т-клеток без активации (фиг. 2). Метод позволяет эктопическая экспрессия гена или сбить предыдущего CD4 Т-клеток в наивной государства. Это позволяет тестирования эффекта overexpresseD интересующего гена в раннем сигнальных событий при первоначальной стимуляции TCR до T приверженность подмножество клетки. Наши эксперименты проверки также обеспечивают основу для создания аналогичных приложений аденовирус в дифференцировке клетки других подмножеств T, таких как Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, или TFH клеток.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K240020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R057S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPEI</td>
			<td>Polyplus-transfection</td>
			<td>101-10N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293A Cell Line</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R705-07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 cm tissue culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>168381</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&Delta;1)1Jdgr</td>
			<td>Taconic Farms</td>
			<td>Model Nr. 4285</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-094-131</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966-052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>1502-P110704</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaPyruvate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-115E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA 100x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-114E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-7522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential vitamin mixture (100x)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>13-607C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>114-56D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-beta 1</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>240B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proleukin S (18 x 106IE)</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-23105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc BlockT</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5773-82</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Probes Master</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>04902343001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adenoviral transduction of naive cd4 t cells to study treg differentiation

Регуляторные Т-клетки (Treg,) имеют важное значение для обеспечивать иммунную толерантность к себе, а также определенные чужеродные антигены. Tregs могут быть получены от наивных Т клеток CD4 в пробирке с TCR-и совместной стимуляции в присутствии TGF-и ИЛ-2. Это имеет огромный потенциал для будущих терапий, однако, молекулы и сигнальных путей, которые контролируют дифференциации в значительной степени неизвестными. Первичные Т-клетки можно манипулировать посредством эктопической экспрессии генов, но общие методы не позволяют нацелены на наиболее важных наивных состояние Т-клеток перед первичным распознавание антигена. Здесь мы предоставляем протокол выразить внематочной генов в наивных Т клеток CD4 в пробирке Перед тем как вызвать Treg дифференциации. Это относится трансдукции репликацию аденовируса-дефицитных и объясняет его поколения и производства. Аденовирус может занять до больших вставками (до 7 КБ) и может быть оборудован с промоутерами для достижения высоких и переходные ПЕРЕЭКСПression в Т-клетках. Он эффективно преобразовывает наивные Т-клетки мыши, если они выражают трансгенных аденовирус Коксаки рецепторов (CAR). Важно отметить, что после инфекции Т-клеток остаются наивных (CD44 низкий, CD62L высокий) и отдыха (CD25 -, CD69 -) и может быть активирована и дифференцировались в Tregs похожа на неинфицированных клеток. Таким образом, этот метод позволяет манипуляции дифференциации CD4 Т-клеток с самого начала. Это гарантирует, что эктопическая экспрессия гена уже на месте, когда в начале сигнальных событий начальной стимуляции TCR вызывает клеточный изменения, которые в конечном итоге ведут в Treg дифференциации.

Вирус Продакшн Для генерации высоких титров вируса, сроки HEK293A сбора клеток в первичном производстве вируса или усиления имеет решающее значение. Представитель флуоресцентные и фазового контраста изображения с визуальные признаки продукции вируса показаны на рису?...

Watch this Scientific Journal Video about Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation at JoVE.com

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Аденовирусные перенос гена в наивных CD4 Т-клеток с трансгенной экспрессии рецептора аденовируса Коксаки позволяет молекулярного анализа регуляторных Т-клеточной дифференцировки<em&gt; В пробирке</em&gt;.

Аденовирусной трансдукции наивного CD4 Т-клеток по изучению Treg Дифференциация

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Ретровирусные трансдукция Т-клеточных рецепторов в мышь Т-клеток

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток по отношению к Т-лимфоцитов

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Ускоренное диабета 1 типа у мышей Индукционная приемными Передача диабетогенные CD4 + Т-клеток

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Выделение и Th17 дифференцировки наивных CD4 Т-лимфоцитов

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Трансплантация кожи хвоста изучать Аллогенная лимфоцитов CD4 ответов у мышей

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Индукционная мышиных воспаление кишечника с помощью приемных передачи эффекторных CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Высокая</sup&gt; Т-клеток в иммунодефицитных мышей

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Мышь наивного CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток Выделение и<em&gt; В пробирке</em&gt; Дифференциация в Т-клеточных подмножеств

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Isolation and Ex Vivo Culture of VÃƒÅ½Ã‚Â´1+CD4+ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells, an Extrathymic ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â²T-cell Progenitor

Выделение и<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Культура Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ Т-клеток, А.Н. Extrathymic αβT-клеток-предшественников

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Ретровирусное Трансдукция костного мозга клеток-предшественников для генерации Т-клеточного рецептора Retrogenic Мыши

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Получение CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток для анализа GD3 и GD2 Ганглиозид Мембранная Expression микроскопией

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...