Name: adenoviral transduction of naive cd4 t cells to study treg differentiation
Uploaded: 2013-08-13T13:00:00
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Los autores desean agradecer a Lirui Du para construir el vector pCAGAdDU y Oliver Gorka para la prestación del protocolo de fijación.

1. La clonación de un gen de interés en un vector de entrada <ol><li> Clonar el gen de interés en un vector de entrada. Amplificación por PCR del gen seguido por ligación de extremos romos en un vector de la topoisomerasa-acoplado (por ejemplo pENTR / D-TOPO) o la enzima de restricción mediada por clonación puede ser usada para este procedimiento. </li></ol> 2. Transferencia del gen de interés en la pCAGAdDu Destino vectorial <ol><li> La transferencia del gen de interés a pa...

<ol>
	<li>Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+Foxp3++regulatory+T+cells+induces+a+scurfy-like+disease.">Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).</li><li>Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+and+expanding+regulatory+T+cell+populations+by+foreign+antigen.">Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen.</a> Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).</li><li>Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+CD25(+)CD4(+)+regulatory+T+cells+by+oral+antigen+administration.">Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).</li><li>Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymically+generated+regulatory+T+cells+control+mucosal+TH2+inflammation.">Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation.</a> Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).</li><li>Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+generation+of+regulatory+T+cells+in+placental+mammals+mitigates+maternal-fetal+conflict.">Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict.</a> Cell. 150 (1), 29-38 (2012).</li><li>Laurence, A., Amarnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+Transcription+Factor+Promotes+Instability+of+nTreg+Cells+and+Limits+Generation+of+iTreg+Cells+during+Acute+Murine+Graft-versus-Host+Disease.">STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease.</a> Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).</li><li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoregulatory+T+cells+in+tumor+immunity.">Immunoregulatory T cells in tumor immunity.</a> Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).</li><li>Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., H&#228;mmerling, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Treg+depletion+induces+T-cell+infiltration+and+rejection+of+large+tumors.">Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors.</a> European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).</li><li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4+CD25++regulatory+T+cells.">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li><li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3.">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li><li>Chen, W., Jin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Peripheral+CD4+CD25-+Naive+T+Cells+to+CD4+CD25++Regulatory+T+Cells+by+TGF-&#946;+Induction+of+Transcription+Factor+Foxp3.">Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-&#946; Induction of Transcription Factor Foxp3.</a> The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).</li><li>Xu, W., Lan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+induced-treg+cells+effectively+attenuates+murine+airway+allergic+inflammation.">Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation.</a> PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).</li><li>Circosta, P., Granziero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+(TCR)+gene+transfer+with+lentiviral+vectors+allows+efficient+redirection+of+tumor+specificity+in+naive+and+memory+T+cells+without+prior+stimulation+of+endogenous+TCR.">T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR.</a> Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).</li><li>Patel, C., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency,+Site-specific+Transfection+of+Adherent+Cells+with+siRNA+Using+Microelectrode+Arrays+(MEA).">High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA).</a> J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).</li><li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells.">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).</li><li>Leon, R. P., Hedlund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+gene+transfer+in+lymphocytes.">Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).</li><li>Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+expression+of+the+coxsackie/adenovirus+receptor+enables+adenoviral-mediated+gene+delivery+in+naive+T+cells.">Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).</li><li>Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+adenovirus-mediated+gene+transfer+into+primary+T+cells+and+thymocytes+in+a+new+coxsackie/adenovirus+receptor+transgenic+model.">Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model.</a> BMC Immunology. 3, 4 (2002).</li><li>Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+Carma1+by+PP2A+negatively+regulates+T-cell+activation.">Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation.</a> The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).</li><li>Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roquin+binds+inducible+costimulator+mRNA+and+effectors+of+mRNA+decay+to+induce+microRNA-independent+post-transcriptional+repression.">Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression.</a> Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).</li><li>Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5.">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li><li>Landy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+structural,+and+regulatory+aspects+of+lambda+site-specific+recombination.">Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination.</a> Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).</li><li>Bernard, P., Couturier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+killing+by+the+F+plasmid+CcdB+protein+involves+poisoning+of+DNA-topoisomerase+II+complexes.">Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes.</a> Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).</li><li>Thai, T. -. H., Calado, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Germinal+Center+Response+by+MicroRNA-155.">Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155.</a> Science. 316 (5824), 604-608 (2007).</li><li>Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+bic/microRNA-155+for+Normal+Immune+Function.">Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function.</a> Science. 316 (5824), 608-611 (2007).</li><li>Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Dicer+in+immune+regulation.">A role for Dicer in immune regulation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).</li><li>Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-&#947;+Production+in+Helper+T+Cells.">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-&#947; Production in Helper T Cells.</a> Immunity. , (2011).</li></ol>

Virus Generación y Titulación Para obtener resultados óptimos de transfección, la calidad y la cantidad de vector linealizado parecen más importantes. No se observaron efectos negativos en la producción primaria de lisado de un crecimiento excesivo inicial del cultivo ya que la infección se procederá rápidamente una vez que se produce la producción de virus eficiente. Sin embargo, la producción de virus por las células HEK293A puede verse afectado por las inserciones largas que dism...

Tregs son cruciales para mantener la tolerancia inmunológica y para amortiguar la respuesta inmune rebasamiento. Treg suprimen la activación de células T espectador. En consecuencia, la ablación de células T reguladoras conduce a la autoinmunidad fatal y la autodestrucción impulsado por las células T activadas 1. Desarrollar células T reguladoras en el timo durante la selección negativa de células CD4-positivas precursores sola, pero también puede diferenciar en la periferia de las células T naive CD4 tras la estimulación de antígeno con dosis baja subóptima 1,2 co-estimulación. Tímico células T reguladoras parece suprimir la autoinmunidad tejido contra antígenos propios, mientras que periférica células T reguladoras han sido implicados en el suministro de la tolerancia en el intestino o el pulmón. Estos inducida por células T reguladoras potentemente prevenir la activación de células T tras el reconocimiento de los antígenos extraños en la mucosa, incluyendo antígenos ambientales de los alimentos y el aire, las bacterias comensales, y los alérgenos 3,4. Además, células T reguladoras son cruciales para establecer la tolerancia materna a la fetal péptidos 5 y preventilación de la enfermedad de injerto contra huésped 6. Al mismo tiempo, células T reguladoras también median efectos no deseados mediante la atenuación de la vigilancia inmune de las células tumorales 7,8. La característica más distintiva de células T reguladoras es la expresión del subconjunto-especificando Foxp3 factor de transcripción, un factor de transcripción que contiene el dominio tenedor-cabeza que es necesario y suficiente para conferir función 9,10 Treg. Se sabe que algunas vías de señalización que pueden inducir la expresión de Foxp3. Sin embargo, los procesos moleculares que controlan, regulan o modulan Treg diferenciación en respuesta a la activación del receptor de células T son menos conocidos. Tregs puede ser inducida de manera muy eficaz in vitro a través de la estimulación de las células T ingenuas CD4 con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 en la presencia de TGF y la IL-2 11. A medida que el Tregs emergentes son funcionales in vivo, la manipulación de moléculas que promueven la diferenciación Treg lleva un enorme potencial para el futuro therapies, por ejemplo, el tratamiento del asma, la enfermedad de Crohn, y el trasplante 11,12. Por el contrario, la modulación terapéutica de las moléculas para bloquear la diferenciación de Treg puede proporcionar beneficio para futuros enfoques de tratamiento combinado de pacientes con tumores. En ensayos de diferenciación in vitro han sido instrumentales para la descripción de los cambios moleculares que están asociados con T diferenciación subconjunto de células. Por el momento, los intentos experimentales para buscar en pantalla o para los productos de genes que controlan la diferenciación de células T se ve obstaculizada por el hecho de que los métodos más comunes de la expresión génica ectópico no en las células T vírgenes. Por ejemplo, la electroporación y la transducción retroviral sólo son eficaces en las células T activadas. En contraste con las expectativas iniciales, la transducción lentiviral, que es normalmente eficaz en las células en reposo, requiere pre-activación de las células T ingenuas por citocinas 13. Además, la transferencia de ADNc o ARNm durante la electroporaciónimplica la despolarización de la membrana plasmática, que a su vez confiere características de activación de células T e incluso puede movilizar Ca 2 + señalización y activar las proteínas NFAT (observaciones no publicadas y ref. 14). Del mismo modo, para la transducción retroviral, las células T vírgenes tienen que activarse para 18 - 40 horas. Durante este tiempo, la ruptura de la membrana nuclear en el curso de la división celular se produce y permite la integración genómica posterior del vector retroviral 15. Estos métodos por lo tanto no son capaces de hacer frente a la temprana regulación molecular de encuentro de células T con el antígeno inicial, que es la fase decisiva de la diferenciación de células T ayudante. Transducción adenoviral es conocido para conferir expresión génica ectópica transitoria en un número de tipos de células humanas que expresan el receptor de adenovirus Coxsackie humano (CAR). Se procede sin requisito para la activación de las células o la progresión del ciclo celular. La expresión en la superficie de CAR es esencial para la fijación del virus y la internalización eficiente, y la expresión transgénica de la versión truncada CARΔ1 bajo un promotor de células T específica fue encontrado para hacer timocitos de ratón y células T susceptibles a la infección adenoviral 16. Es importante destacar que, el transgén no altera desarrollo de los timocitos o en la diferenciación in vitro de células T CD4 + naïve en diferentes subconjuntos (datos no mostrados; 17 ref.). Adenovirus mediada por la transducción de las células T se utilizó anteriormente para la sobreexpresión 17,18 y knock-down enfoques 19,20. Las células T transgénicas pueden purificarse a partir comercialmente disponible DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. y 17 ref.). Es importante destacar que, transducción adenoviral permite una alta expresión de un gen de interés en células T vírgenes sin inducir signos evidentes de activación. Las células T permanecen ingenua (CD44 baja, CD62L alta) y descanso (CD25 -, CD69 -) después infectien y se puede activar y diferenciado en Treg similares a las células no infectadas. La producción de adenovirus recombinantes se puede lograr después de la transfección de las células con plásmidos HEK293A adenovirales (Figura 1). Estos plásmidos contienen típicamente el genoma del adenovirus tipo 5 humano con genes E1 y E3 eliminados para hacer que los adenovirus recombinantes de replicación incompetente 21. Células HEK293A complementan la deficiencia de replicación, ya que han sido inmortalizados a través de la integración estable de adenovirus cortado 22. Desde vectores adenovirales son grandes (~ 40 kb) y por lo tanto no es apropiado para la enzima de restricción mediada por clonación tradicional, empleamos el sistema de puerta de enlace. El gen de interés se clonó inicialmente en un vector de entrada más pequeña, de la que se pueden transferir fácilmente en el vector adenoviral de destino a través de reacción de recombinación lambda (LR) 23. Hemos construido el vector pCAGAdDumediante la combinación del promotor CAG (promotor de actina de pollo y el potenciador de CMV) con un casete de expresión que contiene sitios LR que flanquean el marcador de selección ccdB procariota 24. Este casete de expresión está fusionado a un sitio de entrada interna del ribosoma (IRES) elemento que permite la coexpresión de la proteína eucariota infección marcador verde fluorescente mejorada (eGFP), que está fusionado a una secuencia que contiene la hormona de crecimiento bovino poli (A)-señal. Elegimos los CAG cis-secuencias reguladoras, ya que se encontró que el promotor de CMV prototípico para ser altamente dependiente de la activación y por lo tanto, desfavorable para la expresión génica en las células T vírgenes. Aquí, proporcionamos un protocolo para la eficiente en la diferenciación de Treg in vitro y un método para transducir células naive T CD4 sin activación (Figura 2). El método permite la expresión génica ectópico o derribar CD4 precedentes diferenciación de las células T en el estado ingenuo. Se permite probar el efecto de un overexpressed gen de interés durante los primeros eventos de señalización a la estimulación TCR inicial hasta el compromiso de T subconjunto de células. Nuestros experimentos de validación también proporcionan la base para establecer la aplicación de adenovirus similar en la diferenciación de otros subconjuntos de células T tales como Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, o células Tfh.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K240020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R057S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPEI</td>
			<td>Polyplus-transfection</td>
			<td>101-10N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293A Cell Line</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R705-07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 cm tissue culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>168381</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&Delta;1)1Jdgr</td>
			<td>Taconic Farms</td>
			<td>Model Nr. 4285</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-094-131</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966-052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>1502-P110704</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaPyruvate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-115E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA 100x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-114E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-7522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential vitamin mixture (100x)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>13-607C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>114-56D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-beta 1</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>240B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proleukin S (18 x 106IE)</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-23105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc BlockT</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5773-82</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Probes Master</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>04902343001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adenoviral transduction of naive cd4 t cells to study treg differentiation

Las células T reguladoras (Treg) son esenciales para proporcionar la tolerancia inmune a auto, así como a ciertos antígenos extraños. Tregs puede ser generada a partir ingenuas CD4 en las células T in vitro con TCR-y co-estimulación en presencia de TGF y la IL-2. Esto tiene un enorme potencial para las terapias futuras, sin embargo, las moléculas y vías de señalización que la diferenciación de control son en gran parte desconocidos. Las células T primarias se pueden manipular a través de la expresión del gen ectópico, pero los métodos comunes no atacan el estado ingenua más importante de la célula T antes del reconocimiento al antígeno primario. Aquí, ofrecemos un protocolo para expresar genes ectópicos de células T naive CD4 in vitro antes de inducir la diferenciación de Treg. Se aplica la transducción con el adenovirus de replicación deficiente y explica su generación y producción. El adenovirus puede tardar hasta grandes inserciones (hasta 7 kb) y se puede equipar con los promotores para lograr una alta y transitorios Sobreexpresión en las células T. Se transduce eficazmente las células T de ratones ingenuos si expresan un receptor de adenovirus Coxsackie transgénico (CAR). Es importante destacar que, después de la infección las células T permanecen ingenua (CD44 bajo, CD62L alta) y en reposo (CD25 -, CD69 -) y se pueden activar y diferenciarse en células T reguladoras similares a las células no infectadas. Por lo tanto, este método permite la manipulación de la diferenciación de células T CD4 desde sus inicios. Se asegura de que la expresión del gen ectópico ya está en su lugar cuando los eventos de señalización temprana de la estimulación inicial TCR induce cambios celulares que finalmente conducen a la diferenciación de Treg.

Producción Virus Para la generación de altos títulos de virus, el tiempo de cosecha de células HEK293A en la producción de virus primario o amplificación del virus es crucial. Representativos imágenes de contraste de fase fluorescentes y con signos visuales de la producción de virus se muestran en la Figura 3. El CPE se observaron 10 días después de la transfección de células HEK293A con pCAGAdDu vector de control sin inserto. CPE se caracteriza por la aparición de...

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Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Adenoviral la transferencia génica en células T con la expresión transgénica del receptor de adenovirus Coxsackie ingenuo CD4 permite el análisis molecular de la diferenciación de células T reguladoras<em&gt; In vitro</em&gt;.

La transducción adenoviral de células T CD4 + naïve a estudiar la diferenciación Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Investigación

Inmunología e Infección

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Diferenciación dirigida de células madre pluripotentes inducidas hacia los linfocitos T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Tipo 1 Diabetes inducción acelerada en ratones por transferencia adoptiva de células CD4 + células T diabetogénico

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Aislamiento y diferenciación de Th17 Naïve linfocitos T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

El trasplante de la cola de la piel para el Estudio alogénico de células T CD4 respuestas en ratones

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Isolation and Ex Vivo Culture of VÃƒÅ½Ã‚Â´1+CD4+ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells, an Extrathymic ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â²T-cell Progenitor

Aislamiento y<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Las células γδ T, una célula αβT Progenitor Extrathymic

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral transducción de células progenitoras de médula ósea para generar las células T del receptor Retrogenic ratones

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparación de CD4<sup&gt; +</sup&gt; Las células T para el Análisis de GD3 y GD2 gangliósidos membrana Expresión mediante microscopía

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...