Name: acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using grafts
Uploaded: 2013-07-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS at JoVE.com

우리는 소프트웨어에 대한 의견을 에밀리 잭슨, 여호수아 Zeidman, 그리고 니콜라스 렌 감사합니다. 이 작품은 GM95733 (NM)로, BBBE 103316와 MIT 시작 기금 (NM까지)에 의해 재정 지원되었다.

1. 미세 유체 챔버에서 성장하는 단일 효모 세포의 형광 현미경 동영상을 얻을 <ol><li> 갓 성장 플레이트의 세포와 1 ML SC 미디어 (2 % 포도당과 아미노산의 완전한 보완이 합성 정의 미디어) 접종하고, 30 ℃에서 롤러 드럼 ~ 16 시간 배양 밤새 배양 최종 OD 600nm의 조기 로그 단계 성장 ~ 0.1이다 문화 등 준비합니다. </li><li> OD 600nm의 = 0.1 스타터 필요에 따라 문화와 신선한 테스트 튜브?...

<ol>
	<li>Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells.">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Regulation+at+the+Single-Cell+Level.">Gene Regulation at the Single-Cell Level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).</li><li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system.">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li><li>Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling-mediated+bacterial+persister+formation.">Signaling-mediated bacterial persister formation.</a> Nature Chemical Biology. 8 (5), 431-433 (2012).</li><li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Observation+of+Transcription+Initiation+and+Elongation+on+an+Endogenous+Yeast+Gene.">Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li><li>Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+kinetics+of+gene+activity+in+individual+bacteria.">Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria.</a> Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).</li><li>Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Genes+Are+Transcribed+with+Widely+Different+Bursting+Kinetics.">Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics.</a> Science. 332 (6028), 472-474 (2011).</li><li>Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-dependent+variations+in+protein+concentration.">Cell cycle-dependent variations in protein concentration.</a> Nucleic Acids Research. 38 (8), 2676-2681 (2010).</li><li>Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+dependence+of+transcription+dominates+noise+in+gene+expression.">Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression.</a> , (2013).</li><li>Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+stochastic+switching+revealed+by+single-cell+genealogy.">Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy.</a> PLoS Biology. 5 (9), e239 (2007).</li><li>Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamics+of+single-cell+gene+expression+over+multiple+cell+cycles.">Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles.</a> Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024 (2005).</li><li>Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPK-mediated+bimodal+gene+expression+and+adaptive+gradient+sensing+in+yeast.">MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast.</a> Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).</li><li>Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+temporally+controlled+gene+expression+and+long-term+fluorescent+imaging+in+unperturbed+dividing+yeast+cells.">A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells.</a> PloS One. 3 (1), e1468 (2008).</li><li>Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+quantification+of+molecules+and+rates+using+open-source+microscope-based+cytometry.">Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry.</a> Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>Goranov, A. I., Cook, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+cell+growth+is+governed+by+cell+cycle+stage.">The rate of cell growth is governed by cell cycle stage.</a> Genes &amp; Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).</li><li>To, T. -. L., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+Can+Induce+Bimodality+in+Positive+Transcriptional+Feedback+Loops+Without+Bistability.">Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability.</a> Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).</li><li>O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+PHO4+nuclear+localization+by+the+PHO80-PHO85+cyclin-CDK+complex.">Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex.</a> Science. 271 (5246), 209-212 (1996).</li><li>Raser, J. M., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+stochasticity+in+eukaryotic+gene+expression.">Control of stochasticity in eukaryotic gene expression.</a> Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).</li></ol>

위의 프로토콜은 마이크로 유체 또는 소프트웨어 개발에 대한 경험과 형광 시계열 데이터를 확보하고 분석하는 간단한 방법을 설명합니다. 그것은 하나의 단일 효모 세포의 시간 경과 형광 영화를 얻을 수 있습니다, 부목사 추적 및 계보 할당; 해당 셀 크기와 표현 측정을 추출하고 상업적으로 이용 가능한 미세 배양 장치를 사용하여 시간과 다양한 그래픽 사용자를 통해 전체 세포의 동작을 분?...

유전자 발현의 단일 세포 분석은 유전자 조절의 여러 측면에 대한 우리의 이해를 발전한있다. 유동 세포 계측법 또는 현미경을 사용하여 형광 기자 표현식의 정적 스냅 샷은 단일 셀 표현의 분포에 대한 유용한 정보를 제공하지만, 역사와 직접적으로 유전자 발현 역학을 통보하는 데 필요한 시간 시리즈 데이터의 진화를 부족합니다. 형광 시간 경과 현미경 단일 세포 측정 및 그들의 역사를 모두 얻을 수있는 수단을 제공합니다. 다양한 실험 및 분석 기술은 따라서 이러한 휴대 전화의 변화 2,3, 세균 persister 형성 4, 전사 등의 유전자 조절 기능에 대한 통찰력을 (검토를 위해 1 참조) 부여, 형광 기자 식의 영화를 획득하고 정량화하기 위해 개발되었습니다 시작과 신장 5, 6,7 파열 전사, 세포주기 의존 8,9, 및 유전 10. 그러나 OBTaining 품질의 단일 세포 형광 시계열 배양에서 상당한 기술적 도전 제어 환경에서 획득 한 형광 영화의 높은 처리량 정량에있는 세포의 단일 층을 포함한다. 여기에, 우리는 S의 형광 영화를 획득하고 분석하는 절차를 설명 세포 배양 장치 제조 또는 소프트웨어 개발없이 필요한 경험 (그림 1) cerevisiae의. 첫째, 우리는 당신에게 세부 사항을 예를 들어 프로토콜을 하나 이상 형광 기자를 표현 신진 효모에 대한 형광 시계열 영화를 생성합니다. 사용자 정의 미세 배양 챔버를 구축하고 성공적으로 이전 11-13 사용되어 왔지만, 우리는 CellAsic (헤이워드, CA)에서 상업적으로 이용 가능한 미세 유체 장치를 사용하십시오. 시스템 경계 단층 성장 세포의 관류 환경을 지속적으로 제어 할 수 있습니다. 우리가 제시 현미경 프로토콜은 fluoresc를 얻을 수있는 간단한 방법입니다레퍼런스 신진 효모의 영화,하지만 수정 된 실험 프로토콜 (사용자 정의 문화 장치, 대안 미디어의 조건 등.) 단일 효모 세포의 유사 형광 동영상 데이터를 산출로 대체 할 수 있습니다. 다음으로, 우리는 시계열 데이터를 추출하는 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 기반 MATLAB에서 소프트웨어 패키지 (매스 웍스, 틱, MA), 형광 시계열의 신속한 분석 (이식)에 대한 GUI 별명을 사용하여 영화의 분석을 설명 단일 세포. 이식 세포를 분할 및 추적과 형광 강도 및 형상 정보를 추출에서 다양한 오픈 소스 소프트웨어 패키지 셀 ID (14)와 유사한 기능을 가지고 있습니다. 그러나 이식은 중요한 추가 기능을 제공합니다. 첫째, 세분화 및 데이터의 정확성보다는 분석 후 국외자 지역 트레이스 단지 통계 게이트를 확인하기 위해 추적 결과를 쉽게 대화 형 편집을 제공합니다. 또한, 그것은 automaticall에 분석을 확장Y 지명 한 계보와 신진 효모의 관심의 세포주기를 가리 킵니다. 어머니와 딸은 두 개의 독립적 인 셀 영역을 형성하기 위하여 분할하는 경우 결정하는 전체 세포 (연결된 새싹을 포함한 어머니) 세포주기 8에 걸쳐 측정을 결정하는 매우 중요합니다. 제품군은 이러한 작업을 수행하기 위해 3 개의 모듈로 구성되어 있습니다. 집중과 산만 시야 이미지 사이의 대비를 기반으로하며 첫 번째 세그먼트 셀 영역은 사용자가 분할 매개 변수를 정의하고 시각적으로 테스트 할 수 있습니다. 초 (.에서 제공 블레어 크로커 등 IDL 루틴 듀프 레인의 MATLAB 구현을 사용하여 : 트랙 <a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/" target="_blank">http://physics.georgetown.edu/MATLAB/</a> )과 시간을 통해 셀 영역을 측정, 자동 계보를 할당하고, 육안 검사를 수 및 오류 수정. 간단한 플로팅 GUI는 쿼리를 단일 셀 속성에 포함되어 있습니다. 세 번째 모듈은 꽃 봉오리 출현과 분열 티타늄을 돌린다MES, 및 전체 세포의 시계열 데이터뿐만 아니라 그들의 첫 번째와 두 번째 시간 미분을 (같이 9에서 설명)를 출력합니다. 분석 모듈은 선택의 통계 소프트웨어의 후속 연구를위한 공백으로 구분 된 텍스트 파일로 데이터를 출력합니다. 따라서, 패키지는 사용자가 그래픽 인터페이스를 통해 높은 품질의 시계열 데이터를 추출 할 수 있습니다. 우리는 세포주기 9의 함수로 하나의 신진 효모 세포에서 실시간 녹음 속도를 추정하기 위해이 방법을 사용했습니다. 모듈이 싹 트는 효모, 매개 변수 또는 최적화되어 있지만, 필요한 경우, 자유롭게 사용할 코드는 다른 생물 및 이미지 유형에 적용 할 수 있습니다. 분할, 추적, 혈통 할당 알고리즘은 할당 된 이미징 및 문제 유기체의 유형에 해당 할 수 있습니다. 기존의 알고리즘은 대체하지만 여전히 사용자 친화적 인 육안 검사와 분할의 보정 변함 occu 추적 오류를 허용하는 GUI 인터페이스를 유지 할 수어떤 알고리즘 연구.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y04C Yeast Perfusion Plate</td>
			<td>CellAsic</td>
			<td>Y04C-02</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ONIX Microfluidic Perfusion Platform</td>
			<td>CellAsic</td>
			<td>EV-262</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer.Z1 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440762-9904-000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cascade II EMCCD camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumen 200 metal-halide arc lamp</td>
			<td>PRIOR Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>set #89006</td>
			<td>Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAC 5000 controller and filter wheels</td>
			<td>Ludl Electronic Products</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB R2011a</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>64-bit version handles large data files better than 32-bit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using grafts

형광 시간 경과 현미경은 단일 세포 수준에서 많은 생물학적 과정의 연구에 강력한 도구가되고있다. 특히, 유전자 발현의 시간적 의존성을 묘사하는 영화는 규제의 역학에 대한 통찰력을 제공하지만, 단일 세포의 형광 영화를 획득하고 분석하는 많은 기술적 과제가있다. 우리는 여기에서 이러한 데이터를 생성하는 상업적으로 이용 가능한 미세 배양 장치를 사용하여 간단한 프로토콜 및 MATLAB 기반의 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 기반의 소프트웨어 패키지 형광 이미지를 정량화하는 방법에 대해 설명합니다. 소프트웨어 세그먼트와 트랙 세포는, 사용자가 시각적으로 데이터의 오류를 부젓가락 할 수 있도록, 자동으로 혈통과 분열 시간을 지정합니다. GUI는 또한 전체 셀 추적뿐만 아니라 첫 번째와 두 번째 유도체를 생산하는 시계열을 분석합니다. 소프트웨어는 S.를 위해 설계되었습니다 동안 cerevisiae의 그 모듈과 다양성은 그것에게 t을 허용해야몇 가지 수정을 다른 세포 유형을 공부하는 플랫폼 역할을 O를.

성공적으로 수행하고 분석 실험은 현실적으로 할당 봉오리 출현과 분열 시간을 갖는 단일 전체 셀에 대한 대부분의 연속적인 시계열을 얻을 것입니다. 예를 들어, 우리는 성장과 글로벌 식 단세포 시간 (표 4, Y47에 다를 수 있습니다 방법을 관찰하기 위해 제정 ADH1 프로모터에 의해 구동 리안 형광 단백질의 통합 사본 (CFP)를 표현하는 반수체 효모 균주 위의 프로토콜을 ?...

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Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

우리는 형광 성장 효모 세포의 현미경 영화, 단일 셀 시계열 데이터를 추출하는 GUI 기반의 소프트웨어 패키지를 얻을 수있는 간단한 프로토콜을 제시한다. 분석은 자동화 혈통과 육안 검사 및 추적 데이터를 수동으로 큐 레이션과 통합 부문 시간 할당을 포함합니다.

신진 효모의 형광 시간 경과 영화를 획득 및 이식을 사용하여 단일 세포 역학 분석

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

버딩 효모에 Replicative 수명 측정

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

연구

생물학

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

마이크로 유체 장치를 사용하면 단일 신진 효모 세포의 수명과 세포 표현형을 측정하는

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

고해상도 이미징 및 개인 별이 미세 소관 역학의 분석 신진 효모에서

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...