Name: acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using grafts
Uploaded: 2013-07-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS at JoVE.com

Vi takker Emily Jackson, Joshua Zeidman, og Nicholas Wren for kommentarer til programvaren. Dette arbeidet ble finansiert av GM95733 (til NM), 103 316 BBBE og MIT oppstart midler (til NM).

En. Skaff Fluorescent Mikroskopi Filmer av single gjærceller Økende i en Microfluidic Chamber <ol><li> Inokuler 1 ml medium SC (definerte syntetiske medier med 2% glukose og fullstendige komplement av aminosyrer) med celler fra en fersk voksende plate, og inkuber over natten kultur ~ 16 timer på en valse trommel ved 30 ° C. Forbered kulturen slik at den endelige OD 600nm er ~ 0,1 for tidlig log-fase vekst. </li><li> Fortynne forrett kultur som trengs og regrow 1 ml i en fersk test tube ytterligere 6-8 t...

<ol>
	<li>Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells.">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Regulation+at+the+Single-Cell+Level.">Gene Regulation at the Single-Cell Level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).</li><li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system.">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li><li>Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling-mediated+bacterial+persister+formation.">Signaling-mediated bacterial persister formation.</a> Nature Chemical Biology. 8 (5), 431-433 (2012).</li><li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Observation+of+Transcription+Initiation+and+Elongation+on+an+Endogenous+Yeast+Gene.">Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li><li>Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+kinetics+of+gene+activity+in+individual+bacteria.">Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria.</a> Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).</li><li>Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Genes+Are+Transcribed+with+Widely+Different+Bursting+Kinetics.">Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics.</a> Science. 332 (6028), 472-474 (2011).</li><li>Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-dependent+variations+in+protein+concentration.">Cell cycle-dependent variations in protein concentration.</a> Nucleic Acids Research. 38 (8), 2676-2681 (2010).</li><li>Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+dependence+of+transcription+dominates+noise+in+gene+expression.">Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression.</a> , (2013).</li><li>Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+stochastic+switching+revealed+by+single-cell+genealogy.">Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy.</a> PLoS Biology. 5 (9), e239 (2007).</li><li>Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamics+of+single-cell+gene+expression+over+multiple+cell+cycles.">Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles.</a> Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024 (2005).</li><li>Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPK-mediated+bimodal+gene+expression+and+adaptive+gradient+sensing+in+yeast.">MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast.</a> Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).</li><li>Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+temporally+controlled+gene+expression+and+long-term+fluorescent+imaging+in+unperturbed+dividing+yeast+cells.">A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells.</a> PloS One. 3 (1), e1468 (2008).</li><li>Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+quantification+of+molecules+and+rates+using+open-source+microscope-based+cytometry.">Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry.</a> Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>Goranov, A. I., Cook, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+cell+growth+is+governed+by+cell+cycle+stage.">The rate of cell growth is governed by cell cycle stage.</a> Genes &amp; Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).</li><li>To, T. -. L., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+Can+Induce+Bimodality+in+Positive+Transcriptional+Feedback+Loops+Without+Bistability.">Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability.</a> Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).</li><li>O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+PHO4+nuclear+localization+by+the+PHO80-PHO85+cyclin-CDK+complex.">Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex.</a> Science. 271 (5246), 209-212 (1996).</li><li>Raser, J. M., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+stochasticity+in+eukaryotic+gene+expression.">Control of stochasticity in eukaryotic gene expression.</a> Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).</li></ol>

Listen protokollen beskriver en enkel metode for å innhente og analysere fluorescens tidsserier med begrenset erfaring i MicroFluidics eller i programvareutvikling. Det gjør det mulig å få time-lapse fluorescens filmer av single gjærceller, trekke ut relevant celle størrelse og uttrykk målinger, kapellan sporing og avstamning oppdrag, og analysere atferden til hele celler over tid ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig microfluidic kultur-enhet og en allsidig grafisk brukergrensesnitt (GUI). Mens den eksperimen...

Encellet analyse av genuttrykk har fremmet vår forståelse av mange aspekter ved genregulering. Statiske øyeblikksbilder av fluorescerende reporter uttrykk ved hjelp av flowcytometri eller mikroskopi gi nyttig informasjon om fordelingen av encellede uttrykk, men mangler historien og utviklingen av tidsserier som kreves for å informere direkte genuttrykk dynamikk. Fluorescens time-lapse mikroskopi presenterer et middel for å oppnå begge encellede målinger og deres historie. Ulike eksperimentelle og analytiske teknikker har blitt utviklet for å skaffe og kvantifisere filmer av fluorescerende reporter uttrykk, og dermed formidle innsikt i genregulering funksjoner (se 1 for en gjennomgang) som celle-til-celle variasjon 2,3, bakteriell persister formasjon 4, transkripsjon initiering og fem forlengelse, transkripsjonell sprengning 6,7, celle-syklus avhengighet 8,9, og 10 arvbarhet. Men OBTaining kvalitet encellede fluorescens tidsserier innebærer betydelige tekniske utfordringer i dyrking en monolags av celler i et kontrollerbart miljø og i high-throughput kvantifisering av de oppkjøpte fluorescens filmer. Her beskriver vi en prosedyre for å innhente og analysere fluorescens filmer av S. cerevisiae uten nødvendig erfaring i cellekultur enhet produksjon eller i utvikling av programvare (figur 1). Først detalj vi et eksempel protokollen til å generere fluorescens tidsserier filmer for spirende gjær uttrykker en eller flere fluorescerende reportere. Selv tilpassede microfluidic kultur kamre har blitt bygget og vellykket ansatt tidligere 11-13, bruker vi en kommersielt tilgjengelig microfluidic enheten fra CellAsic (Hayward, CA). Systemet confines celler til monolag vekst og tillater kontinuerlig styring av perfusjon miljø. Den mikroskopi protokollen presenterer vi er et enkelt middel for å oppnå fluorescerendefaset filmer av spirende gjær, men noe modifisert eksperimentelle protokollen (en tilpasset kultur-enhet, alternative medier forhold, etc.) ved samme fluorescens filmdataene av single gjærceller kan erstattes. Deretter skissere vi analysen av filmer ved hjelp av et grafisk brukergrensesnitt (GUI)-basert programvarepakke i MATLAB (Mathworks, Framingham, MA), kalt GUI for Rapid Analyse av fluorescens Time Series (grafts), for å trekke tidsserier for enkeltceller. Grafts har lignende funksjoner til allsidig, open-source programvare pakken Cell-ID 14 i segmentering og sporing celler og i å trekke fluorescens intensitet og geometrisk informasjon. Imidlertid gir grafts viktige tilleggsfunksjoner. Først, det tilbyr enkel interaktiv redigering av segmentering og sporing resultater for å verifisere data nøyaktighet, heller enn bare statistisk gating av avvikende regionen spor etter analyse. Videre utvider den analysen til automatically utpeke avstamning og celle-syklus interessante av spirende gjær. Bestemme når mor og datter deler for å danne to uavhengige celle regionene er avgjørende for å avgjøre hele celler (mor inkludert eventuelle koblet knopp) målinger gjennom hele cellesyklus åtte. Suiten består av tre moduler for å utføre disse oppgavene. De første segmenter celle regioner basert på kontrasten mellom fokusert og ufokusert lyse felt bilder og tillater brukeren å definere og visuelt teste segmentering parametere. De andre spor (. Med Blair og Dufresne sin MATLAB gjennomføring av Crocker et al IDL rutine, tilgjengelig på: <a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/" target="_blank">http://physics.georgetown.edu/MATLAB/</a> ) og måler celle regioner gjennom tiden; automatisk tildeler linjene, og muliggjør visuell inspeksjon og feilretting. En enkel plotting GUI er inkludert for å spørring encellede egenskaper. Den tredje modulen tilskriver bud fremveksten og divisjon times, og utganger helcelle tidsserier samt deres første og andre gang derivater (som omtalt i 9). Analysen modulen sender dataene som en space-tekstfil for senere studie i statistisk programvare av valget. Dermed kan pakken brukeren til å trekke høy kvalitet tidsseriedata gjennom et grafisk grensesnitt. Vi har brukt denne metoden til å beregne i sanntid transkripsjon priser i enkelt spirende gjær-celler som en funksjon av cellesyklusen 9.. Mens moduler er optimalisert for spirende gjær, parametrene eller, om nødvendig, den fritt tilgjengelige koden kan være tilpasset for andre organismer og bilde-typer. Segmentering, sporing, og avstamning oppdrag algoritmer kan være spesifikke for typer bildebehandling tildelt og organismen i spørsmålet. De eksisterende algoritmer kan byttes ut, men likevel beholde det grafiske grensesnittet som gjør det mulig brukervennlig visuell inspeksjon og korrigering av segmentering og sporing feil som alltid tjenestepensjonr med noen algoritme.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y04C Yeast Perfusion Plate</td>
			<td>CellAsic</td>
			<td>Y04C-02</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ONIX Microfluidic Perfusion Platform</td>
			<td>CellAsic</td>
			<td>EV-262</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer.Z1 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440762-9904-000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cascade II EMCCD camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumen 200 metal-halide arc lamp</td>
			<td>PRIOR Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>set #89006</td>
			<td>Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAC 5000 controller and filter wheels</td>
			<td>Ludl Electronic Products</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB R2011a</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>64-bit version handles large data files better than 32-bit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using grafts

Fluorescens time-lapse mikroskopi har blitt et kraftig verktøy i studiet av mange biologiske prosesser på enkelt-celle-nivå. Spesielt filmer som skildrer den timelige avhengighet av genuttrykk gi innsikt i dynamikken i reguleringen sin, men det er mange tekniske utfordringer for å skaffe og analysere fluorescens filmer av enkeltceller. Vi beskriver her en enkel protokoll med en kommersielt tilgjengelig microfluidic kultur-enhet for å generere slike data, og en MATLAB-basert, grafisk brukergrensesnitt (GUI)-basert programvarepakke for å kvantifisere fluorescens bilder. Programvaren segmenter og spor celler, gjør det mulig for brukeren å visuelt kuratere feil i dataene, og automatisk tildeler avstamning og divisjon ganger. Det grafiske analyserer ytterligere tidsserien å produsere helcelle spor samt deres første og andre tidsderiverte. Mens programvaren er designet for S. cerevisiae, bør modularitet og fleksibilitet gjør det to tjene som en plattform for å studere andre celletyper med noen modifikasjoner.

En vellykket utført og analysert eksperimentet vil gi stort sett sammenhengende tidsserier for enslige hele celler med realistisk tildelt knopp fremveksten og divisjon ganger. Som et eksempel, utførte vi ovennevnte protokoll med en haploid gjærstamme som uttrykker en integrert kopi av Cerulean fluorescerende protein (CFP) som drives av den konstitutive ADH1-promotoren for å observere hvordan vekst og global ekspresjon kan variere over tid i enkle celler (tabell 4, Y47 ). Vi løp ti...

Watch this Scientific Journal Video about Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS at JoVE.com

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Vi presenterer en enkel protokoll for å få fluorescens mikroskopi filmer av voksende gjærceller, og et GUI-basert programvare pakke for å trekke encellede tidsserier. Analysen omfatter automatiserte avstamning og divisjon tid oppdraget integrert med visuell inspeksjon og manuell curation sporede data.

Anskaffelse Fluorescens Time-lapse filmer av Spirende gjær og analysere encellede Dynamics bruke grafts

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kvantitativ analyse av Random migrasjon av celler ved hjelp av Time-lapse video Mikroskopi

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Spirende Gjær Protein Extraction og rensing for studier av funksjon, interaksjoner, og posttranslasjonelle modifikasjoner

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Protein Purification teknikk som gjør at Påvisning av Sumoylation og ubiquitinering av Spirende gjær kinetochore Proteiner Ndc10 og Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høy oppløsning Time-lapse Imaging og automatisk analyse av mikrotubulidynamikk i levende menneske navleveneendotel Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Anvendelser av pHluorin for kvantitativ, Kinetic og High-throughput Analyse av Endocytose i spirende gjær

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Ved hjelp av mikrofluid enheter for å måle levetid og Cellular fenotyper i enkelt spirende gjærceller

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Høyoppløselig avbildning og analyse av enkelt Astral mikrotubulidynamikk i Budding gjær

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Undersøkelse av mitotisk og Meiotic fisjon gjær Nuclear Dynamics av fluorescens Live-Cell mikroskopi

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...