Name: acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using grafts
Uploaded: 2013-07-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS at JoVE.com

Мы благодарим Эмили Джексон, Джошуа Зейдман, а Николай Реном для комментариев на программное обеспечение. Эта работа финансировалась GM95733 (в Нью-Мексико), BBBE 103316 и Массачусетский технологический институт запуске фондов (в нм).

1. Получить флуоресцентная микроскопия Фильмы одиночных клеток дрожжей, растущих в Микрофлюидных палата <ol><li> Инокулируют 1 мл среды SC (синтетический средах определенного состава с 2% глюкозы и полное дополнение аминокислот) с клетками из только что растущий пластине и инкубировали в т...

<ol>
	<li>Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells.">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Regulation+at+the+Single-Cell+Level.">Gene Regulation at the Single-Cell Level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).</li><li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system.">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li><li>Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling-mediated+bacterial+persister+formation.">Signaling-mediated bacterial persister formation.</a> Nature Chemical Biology. 8 (5), 431-433 (2012).</li><li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Observation+of+Transcription+Initiation+and+Elongation+on+an+Endogenous+Yeast+Gene.">Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li><li>Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+kinetics+of+gene+activity+in+individual+bacteria.">Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria.</a> Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).</li><li>Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Genes+Are+Transcribed+with+Widely+Different+Bursting+Kinetics.">Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics.</a> Science. 332 (6028), 472-474 (2011).</li><li>Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-dependent+variations+in+protein+concentration.">Cell cycle-dependent variations in protein concentration.</a> Nucleic Acids Research. 38 (8), 2676-2681 (2010).</li><li>Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+dependence+of+transcription+dominates+noise+in+gene+expression.">Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression.</a> , (2013).</li><li>Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+stochastic+switching+revealed+by+single-cell+genealogy.">Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy.</a> PLoS Biology. 5 (9), e239 (2007).</li><li>Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamics+of+single-cell+gene+expression+over+multiple+cell+cycles.">Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles.</a> Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024 (2005).</li><li>Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPK-mediated+bimodal+gene+expression+and+adaptive+gradient+sensing+in+yeast.">MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast.</a> Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).</li><li>Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+temporally+controlled+gene+expression+and+long-term+fluorescent+imaging+in+unperturbed+dividing+yeast+cells.">A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells.</a> PloS One. 3 (1), e1468 (2008).</li><li>Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+quantification+of+molecules+and+rates+using+open-source+microscope-based+cytometry.">Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry.</a> Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>Goranov, A. I., Cook, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+cell+growth+is+governed+by+cell+cycle+stage.">The rate of cell growth is governed by cell cycle stage.</a> Genes &amp; Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).</li><li>To, T. -. L., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+Can+Induce+Bimodality+in+Positive+Transcriptional+Feedback+Loops+Without+Bistability.">Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability.</a> Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).</li><li>O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+PHO4+nuclear+localization+by+the+PHO80-PHO85+cyclin-CDK+complex.">Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex.</a> Science. 271 (5246), 209-212 (1996).</li><li>Raser, J. M., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+stochasticity+in+eukaryotic+gene+expression.">Control of stochasticity in eukaryotic gene expression.</a> Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).</li></ol>

Выше протоколе описывается простой метод для получения и анализа данных флуоресценции временных рядов с ограниченным опытом в микрофлюидики или в разработке программного обеспечения. Это позволяет получить покадровой фильмы флуоресценции одиночных клеток дрожжей; извлечь соответс...

Одноклеточные анализ экспрессии генов содействовало нашему пониманию многих аспектов регуляции генов. Статические снимки флуоресцентных выражения репортера использованием проточной цитометрии или микроскопии дать полезную информацию о распределении одноклеточные выражения, но не хватает истории и эволюции временных рядов данных, необходимых для непосредственно информировать динамики экспрессии генов. Флуоресценции покадровой микроскопии представляет собой средство для получения как одноклеточные измерений и их истории. Различные экспериментальные и аналитические методы были разработаны для получения и количественной флуоресцентной фильмы выражения репортером, передавая, таким образом взглянуть на особенности регуляции генов (см. 1 для обзора), такие как клетки к клетке изменения 2,3, бактериальной формирования стойкая бактерия 4, транскрипция инициирование и удлинение 5, транскрипционные разрыва 6,7, клеточного цикла зависимость 8,9, 10 и наследуемости. Тем не менее, OBTAining качество одноклеточные флуоресценции временной ряд включает в себя значительные технические проблемы в культивирования монослой клеток в контролируемой окружающей среде и в высокой пропускной количественного приобретенных фильмов флуоресценции. Здесь мы описываем процедуру для получения и анализа флуоресценции фильмов С. CEREVISIAE, без необходимого опыта в клеточной культуре производства устройства или в разработке программного обеспечения (рис. 1). Во-первых, мы подробно пример протокола для создания фильмов флуоресценции временных рядов для начинающих дрожжей, экспрессирующих один или более флуоресцентных журналистам. Хотя индивидуальные микрожидкостной камер культуры были построены и успешно использовались ранее 11-13, мы используем имеющиеся в продаже устройства от микрожидкостной CellAsic (Hayward, Калифорния). Система пределы клетки монослоя роста и обеспечивает постоянный контроль перфузии среды. Микроскопии протокола мы представляем собой простой способ получить fluorescENCE фильмы бутонизации дрожжи, но любое изменение экспериментальный протокол (индивидуальные устройства культуры, альтернативные условия среды и т.д.). обеспечивая такую ​​же данных флуоресценции фильм одиночных клеток дрожжей может быть замещен. Далее мы приводим анализ фильмов с помощью графического интерфейса пользователя (GUI) на основе пакета программного обеспечения в MATLAB (Mathworks, Натик, штат Массачусетс), получивший название графический интерфейс для быстрого анализа флуоресценции временных рядов (черенки) для извлечения данных временных рядов для отдельных клеток. ПРОТЕЗОВ имеет аналогичные характеристики с универсальным, открытым исходным кодом пакета Cell-ID 14 в сегментации и отслеживания клетки и в извлечении интенсивности флуоресценции и геометрическую информацию. Тем не менее, важно ПРОТЕЗОВ предоставляет дополнительные возможности. Во-первых, он предлагает легкий интерактивного редактирования сегментации и отслеживания результатов для проверки точности данных, а не только статистические стробирования выброс регионе следов после анализа. Более того, она расширяет анализ automaticallY назначают происхождение и клеточного цикла достопримечательности бутонизации дрожжей. Определение, когда мать и дочь делятся, для формирования двух независимых регионах ячейки имеет решающее значение для определения целой клетки (мать включая любые связанные BUD) измерений в течение всего клеточного цикла 8. Номер состоит из трех модулей для выполнения этих задач. Первая ячейка сегменты регионов на основе контраста между целенаправленной и сфокусировано яркие образы поля, а также позволяет пользователю определить и визуально проверить параметры сегментации. Вторых путей (. Блэр и использованием MATLAB реализации Dufresne о Крокер и др. рутинных IDL, по адресу: <a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/" target="_blank">http://physics.georgetown.edu/MATLAB/</a> ) и измеряет ячейку регионов во времени; автоматически назначает линий, а также дает возможность визуального контроля и коррекции ошибок. Простое построение GUI включен в запрос одноклеточные свойствами. Третий модуль приписывает появление бутон и деления Tiмес, и выводит целой клетки временные ряды данных, а также их первых и вторых производных по времени (как описано в 9). Модуль анализа выводит данные в виде разделенных пробелами текстовый файл для последующего исследования статистическим программным обеспечением выбора. Таким образом, пакет позволяет пользователю извлекать данные высокого качества времени последовательно через графический интерфейс. Мы использовали этот метод оценки в реальном времени цены транскрипции в одном перспективных дрожжевых клеток в зависимости от клеточного цикла 9. В то время как модуль оптимизирован для начинающих дрожжи, параметров или, при необходимости, свободно доступны код может быть адаптирован для других организмов и типов изображений. Алгоритмы сегментации, отслеживания и назначения линии могут быть специфическими для типов изображений и назначен рассматриваемого организма. Существующие алгоритмы можно было бы заменить, но все еще сохраняют GUI интерфейс, который позволяет удобный визуальный контроль и коррекция сегментации и отслеживания ошибок, которые неизменно OCCUR с любым алгоритмом.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y04C Yeast Perfusion Plate</td>
			<td>CellAsic</td>
			<td>Y04C-02</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ONIX Microfluidic Perfusion Platform</td>
			<td>CellAsic</td>
			<td>EV-262</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer.Z1 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440762-9904-000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cascade II EMCCD camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumen 200 metal-halide arc lamp</td>
			<td>PRIOR Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>set #89006</td>
			<td>Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAC 5000 controller and filter wheels</td>
			<td>Ludl Electronic Products</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB R2011a</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>64-bit version handles large data files better than 32-bit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using grafts

Флуоресценции покадровой микроскопии стал мощным инструментом в изучении многих биологических процессов на уровне одной клетки. В частности, фильмы изображающие временную зависимость экспрессии генов дают представление о динамике ее регулирования, однако, есть много технических проблем в получении и анализе фильмов флуоресценции одиночных клеток. Здесь описан простой протокол с использованием коммерчески доступной культуры микрожидкостных устройств для получения таких данных, и MATLAB основе, графический пользовательский интерфейс (GUI) на основе пакета программного обеспечения для количественного флуоресцентного изображений. Программное обеспечение сегментов и дорожек клетки, позволяет пользователю визуально отбора с ошибками в данных, и автоматически присваивает линии и разделения времени. GUI дальнейшем анализируются временные ряды для производства целого следы клеток, а также их первые и вторые производные по времени. В то время как программное обеспечение было разработано для S. CEREVISIAE, ее модульность и универсальность должна позволить его тØ служить в качестве платформы для изучения других типов клеток, с некоторыми изменениями.

Успешно проведен эксперимент проанализировал даст основном непрерывного времени для одно целых клеток с реально назначены появление бутонов и разделение раза. В качестве примера, мы провели выше протокол с гаплоидный штамм дрожжей, экспрессирующих интегрированную копию Серулин флу?...

Watch this Scientific Journal Video about Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS at JoVE.com

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Мы представляем простой протокол для получения флуоресцентного микроскопа фильмы растущих клеток дрожжей и на основе графического интерфейса программного пакета для извлечения одноклеточные данных временных рядов. Анализ включает в себя автоматизированные линии и временного разделения назначения интегрирована с визуальным осмотром и ручным курирование гусеничном данных.

Приобретение флуоресценции интервальной съемки бутонизации дрожжей и анализ Одноклеточный динамики с использованием ПРОТЕЗОВ

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Диапазона измерений репликативной Жизнь в почкующихся дрожжей

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Покадровый Визуализация Митоз После трансфекции миРНК

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Количественный анализ случайных миграции клеток помощью замедленной видео микроскопии

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Многообещающая Добыча дрожжевого белка и очистка по изучению функций, взаимодействия и пост-трансляционных модификаций

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Белок Очистка Техника, что позволяет выявлять и SUMOylation Убиквитинирование бутонизации дрожжей кинетохор белков Ndc10 и Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Высокое разрешение Покадровый изображений и автоматизированный анализ динамики микротрубочек в живых человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Применение pHluorin для количественного, Kinetic и высокой пропускной способностью анализа эндоцитоза у почкующихся дрожжей

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Использование микрофлюидальных устройств для измерения срок службы и сотовых фенотипов в одиночных дрожжевых клетках почкования

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Изображения с высоким разрешением и анализ индивидуальной астральных микротрубочек динамики в почкующихся дрожжах

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Изучение митотической и меиотической разложения дрожжей ядерной динамики флуоресценции Live-клеток Микроскопии

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...