Name: acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using grafts
Uploaded: 2013-07-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS at JoVE.com

Vi tackar Emily Jackson, Joshua Zeidman, och Nicholas Wren för kommentarer på programvaran. Detta arbete har finansierats av GM95733 (till NM), BBBE 103.316 och MIT start medel (till NM).

Ett. Skaffa fluorescensmikroskopi filmer av Single Jäst celler som växer i en Microfluidic avdelningen <ol><li> Inokulera 1 ml SC-medium (syntetiska definierade media med 2% glukos och fullständig komplement av aminosyror) med celler från en nyligen växande platta och inkubera över natten kultur ~ 16 timmar på en berg trumma vid 30 ° C. Förbered kulturen så att den slutliga OD 600nm är ~ 0,1 för tidig log-fas tillväxt. </li><li> Späd startkulturen som behövs och avkrävdes 1 ml i ett nytt pro...

<ol>
	<li>Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells.">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Regulation+at+the+Single-Cell+Level.">Gene Regulation at the Single-Cell Level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).</li><li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system.">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li><li>Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling-mediated+bacterial+persister+formation.">Signaling-mediated bacterial persister formation.</a> Nature Chemical Biology. 8 (5), 431-433 (2012).</li><li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Observation+of+Transcription+Initiation+and+Elongation+on+an+Endogenous+Yeast+Gene.">Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li><li>Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+kinetics+of+gene+activity+in+individual+bacteria.">Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria.</a> Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).</li><li>Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Genes+Are+Transcribed+with+Widely+Different+Bursting+Kinetics.">Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics.</a> Science. 332 (6028), 472-474 (2011).</li><li>Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-dependent+variations+in+protein+concentration.">Cell cycle-dependent variations in protein concentration.</a> Nucleic Acids Research. 38 (8), 2676-2681 (2010).</li><li>Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+dependence+of+transcription+dominates+noise+in+gene+expression.">Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression.</a> , (2013).</li><li>Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+stochastic+switching+revealed+by+single-cell+genealogy.">Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy.</a> PLoS Biology. 5 (9), e239 (2007).</li><li>Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamics+of+single-cell+gene+expression+over+multiple+cell+cycles.">Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles.</a> Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024 (2005).</li><li>Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPK-mediated+bimodal+gene+expression+and+adaptive+gradient+sensing+in+yeast.">MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast.</a> Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).</li><li>Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+temporally+controlled+gene+expression+and+long-term+fluorescent+imaging+in+unperturbed+dividing+yeast+cells.">A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells.</a> PloS One. 3 (1), e1468 (2008).</li><li>Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+quantification+of+molecules+and+rates+using+open-source+microscope-based+cytometry.">Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry.</a> Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>Goranov, A. I., Cook, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+cell+growth+is+governed+by+cell+cycle+stage.">The rate of cell growth is governed by cell cycle stage.</a> Genes &amp; Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).</li><li>To, T. -. L., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+Can+Induce+Bimodality+in+Positive+Transcriptional+Feedback+Loops+Without+Bistability.">Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability.</a> Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).</li><li>O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+PHO4+nuclear+localization+by+the+PHO80-PHO85+cyclin-CDK+complex.">Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex.</a> Science. 271 (5246), 209-212 (1996).</li><li>Raser, J. M., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+stochasticity+in+eukaryotic+gene+expression.">Control of stochasticity in eukaryotic gene expression.</a> Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).</li></ol>

Ovanstående protokoll beskriver en enkel metod för att inhämta och analysera fluorescens tidsseriedata med begränsad erfarenhet microfluidicsen eller inom mjukvaruutveckling. Det gör att man kan få tidsförlopp fluorescens filmer av enstaka jästceller, extrahera relevant cellstorlek och mätningar uttryck, komminister spårning och inlämningsuppgifter härstamning, och analysera beteendet hos hela celler över tiden med ett kommersiellt tillgängligt mikrofluidisk kultur-enhet och en mångsidig grafiskt använda...

Single-cell analys av genuttryck har främjat vår förståelse av många aspekter av genreglering. Statiska ögonblicksbilder av fluorescerande reporter uttryck med flödescytometri eller mikroskopi ger användbar information om fördelningen av encelliga uttryck, men saknar historia och utvecklingen av tidsseriedata som krävs för att direkt informera dynamiken genuttryck. Fluorescens tidsförlopp mikroskopi utgör ett medel för att erhålla både encelliga mätningar och deras historia. Olika experimentella och analytiska tekniker har utvecklats för att erhålla och kvantifiera filmer av fluorescerande reporter uttryck, därmed förmedla insikter funktioner genreglering (se 1 för en översikt) såsom cell-till-cell variation 2,3, bakteriell persister formation 4, transkription initiering och töjning 5, transkriptionella spricker 6,7, cell-cykeln beroendet 8,9, och ärftlighet 10. Emellertid OBTaining kvalitet encelliga fluorescens tidsserier innebär stora tekniska utmaningar inom odling ett monoskikt av celler i en kontrollerbar miljö och i high-throughput kvantifiering av de förvärvade fluorescens filmer. Här beskriver vi ett förfarande för att skaffa och analysera fluorescens filmer av S. cerevisiae utan erforderlig erfarenhet cellodlingsanordning tillverkning eller inom mjukvaruutveckling (Figur 1). Först, detalj vi ett exempel protokoll för att generera fluorescens filmer tidsserier för spirande jäst som uttrycker en eller flera fluorescerande reportrar. Även kundanpassade mikrofluidiska kultur kammare har byggts och framgångsrikt använts tidigare 11-13, använder vi en kommersiellt tillgänglig mikrofluidikanordning från CellAsic (Hayward, CA). Systemet begränsar celler till monoskikt tillväxt och möjliggör kontinuerlig kontroll av perfusionen miljön. Den mikroskopi protokoll vi presenterar är ett enkelt sätt att få fluorescerENCE filmer av spirande jäst, men något modifierad experimentellt protokoll (en anpassad kultur enhet, alternativa medier förhållanden, osv.), vilket gav liknande fluorescens filmen data för enstaka jästceller kan ersättas. Därefter skisserar vi en analys av filmer med ett grafiskt användargränssnitt (GUI)-baserad mjukvara i MATLAB (Mathworks, Natick, MA), dubbat GUI för snabb analys av fluorescens Time Series (transplantat), för att extrahera tidsseriedata för enskilda celler. Transplantat har likheter med den mångsidiga, open-source mjukvara Cell-ID 14 i segmentera och spåra celler och utvinna fluorescens intensitet och geometrisk information. Dock ger transplantat ytterligare viktiga funktioner. Först erbjuder det lätt interaktiv redigering av segmentering och spårning resultat för att verifiera uppgifternas korrekthet, snarare än bara statistiska slussning av utanförliggande region spår efter analys. Dessutom sträcker den analysen till automatically nominerade härstamning och cell-cykel punkter av intresse i spirande jäst. Bestämma när mor och dotter delar för att bilda två självständiga celler regioner är avgörande för att bestämma hela cellen (mor, inklusive alla anslutna knopp) mätningar under hela cellcykeln 8. Sviten består av tre moduler för att utföra dessa uppgifter. De första segmenten cell regioner bygger på kontrasten mellan fokuserad och ofokuserad ljusfält bilder, och tillåter användaren att definiera och visuellt testa segmentering parametrar. De andra spår (. Använder Blair och Dufresne s MATLAB genomförandet av Crocker et al IDL rutin, finns på: <a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/" target="_blank">http://physics.georgetown.edu/MATLAB/</a> ) och mäter cell regioner genom tiden, tilldelar automatiskt härstamningar, och möjliggör visuell inspektion och felkorrigering. En enkel plottning GUI ingår att fråga encelliga egenskaper. Den tredje modulen tillskriver knopp uppkomst och division times, och matar hela celler tidsseriedata samt deras första och andra derivat tid (vilket diskuteras i 9). Analysen Modulen matar datan som en rymd-textfil för senare studier i statistisk programvara val. Således möjliggör paketet för användaren att extrahera högkvalitativa tidsseriedata genom ett grafiskt gränssnitt. Vi har använt denna metod för att uppskatta realtid transkription klassar i enkla spirande jästceller som en funktion av cellcykeln 9. Medan de moduler har optimerats för spirande jäst, parametrarna eller, om så är nödvändigt, kan den fritt tillgängliga koden anpassas för andra organismer och bildtyper. Segmentering, tracking, och härstamning tilldelning algoritmer kan vara specifika för olika typer av särskilda imaging och organismen i fråga. De befintliga algoritmer kan ersättas, men ändå behålla det grafiska gränssnittet som tillåter användarvänlig visuell inspektion och korrigering av segmentering och följningsfel som undantagslöst yrkesr med någon algoritm.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y04C Yeast Perfusion Plate</td>
			<td>CellAsic</td>
			<td>Y04C-02</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ONIX Microfluidic Perfusion Platform</td>
			<td>CellAsic</td>
			<td>EV-262</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer.Z1 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440762-9904-000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cascade II EMCCD camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumen 200 metal-halide arc lamp</td>
			<td>PRIOR Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>set #89006</td>
			<td>Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAC 5000 controller and filter wheels</td>
			<td>Ludl Electronic Products</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB R2011a</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>64-bit version handles large data files better than 32-bit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using grafts

Fluorescens tidsförlopp mikroskopi har blivit ett kraftfullt verktyg i studiet av många biologiska processer vid encelliga nivå. I synnerhet filmer som skildrar den tidsmässiga beroendet av genuttryck ge insikt i dynamiken i dess reglering, men det finns många tekniska utmaningar för att erhålla och analysera fluorescens filmer av enskilda celler. Vi beskriver här ett enkelt protokoll med ett kommersiellt tillgängligt mikrofluidikanordning kultur anordning för att generera sådana uppgifter, och en MATLAB-baserad, grafiskt användargränssnitt (GUI)-baserad programvara för att kvantifiera fluorescens bilder. Programvaran segmenten och spår celler, gör det möjligt för användaren att visuellt komminister fel i uppgifterna, och automatiskt tilldelar härstamning och tider division. Den grafiska analyserar vidare tidsserierna att producera hela celler spår samt deras första och andra derivat tid. Medan programvaran var utformad för S. cerevisiae, bör dess modularitet och flexibilitet gör det möjligt to fungera som en plattform för att studera andra celltyper med några modifikationer.

Ett godkänt resultat och analyserade experiment kommer att ge mestadels kontinuerlig tidsserier för enskilda hela celler med realistiskt tilldelad knopp uppkomst och tider division. Som ett exempel, utförde vi ovanstående protokoll med en haploid jäststam som uttrycker en integrerad kopia av Cerulean fluorescerande protein (GFP) som drivs av den konstitutiva ADH1-promotorn för att observera hur tillväxt och global expression kan variera med tiden i enskilda celler (tabell 4, Y47...

Watch this Scientific Journal Video about Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS at JoVE.com

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Vi presenterar ett enkelt protokoll för att erhålla fluorescensmikroskopiska filmer av växande jästceller, och en GUI-baserad programvara paket för att extrahera encelliga tidsseriedata. Analysen omfattar automatiserad härstamning och division tidstilldelning integreras med visuell inspektion och manuell curation spårade uppgifter.

Förvärva Fluorescens Time-lapse filmer av knoppande jäst och analysera Encelliga Dynamics med transplantat

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Mätning Span replikationsförmåga Livet i den spirande Jäst

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kvantitativ analys av Random migration av celler med Time-lapse video Mikroskopi

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Spirande jästprotein extraktion och rening för studien av funktion, interaktioner, och post-translationella modifieringar

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Protein reningsteknik som möjliggör detektion av Sumoylation och ubikvitinering av knoppande jäst kinetochore Proteiner Ndc10 och Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Högupplöst time-lapse avbildning och automatiserad analys av mikrotubuli Dynamics i Living Human navelsträngsvenendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Tillämpningar av pHluorin för kvantitativ, kinetisk och hög kapacitet Analys av Endocytosis i knoppande jäst

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Använda mikroflödessystem enheter för att mäta livslängd och Cellular fenotyper i Single Budding jästceller

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Högupplöst avbildning och analys av enskilda Astral mikrotubuli Dynamics i knoppande jäst

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Undersökning av mitotiska och Meiotic fission jäst nukleär dynamik genom fluorescens Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...