Name: tissue engineering of a human 3d in vitro tumor test system
Uploaded: 2013-08-06T08:56:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) for hans teknisk støtte til at udvikle bioreaktorer og bioreaktor kuvøse.

1.. Decellularization af BioVaSc <ol><li> Skyl karsystemet porcine jejunal segment via kanyle arterielle og det intestinale lumen med PBS -. Gentag, indtil den er helt ren. </li><li> Forbered en diameter på 200 mm glas tank med 4 adaptere og forbinde dem via silicium rør til peristaltikpumpen (Ismatec). Trykket styreenhed kan overvåges via en trykføler, der er forbundet til en steril engangs kuppel (se figur 1). </li><li> Fyld reservoir flasker med decellularization (DZ) løsning, og tjek slangen systemet for eventuelle luftbobler. </li><li> Slut tarmens lumen med kabelstrips til glasset stik til luminale flow. Pumpe 500 ml DZ løsning i den røde arteriel adgang (figur 1B) i karsystemet. Afbryd pumpe proces hver 15 min kort tid til manuelt at trykke ud hele tarmens lumen. </li><li> Under decellularizatipå processen skal trykket af bufferen løsning være mellem 80-100 mm Hg, modelleret efter den naturlige blodtryk. </li><li> Vask BioVaSc med PBS - indtil den er fri af celle rester (&quot;helt hvid&quot;). </li><li> Fyld BioVaSc helt med DZ-opløsning og inkuber det nedsænkes i DZ opløsning natten over ved 4 ° C på rocking shaker. </li><li> Gentag trin 1.6. </li><li> Placer BioVaSc i DNase-opløsning og inkuberes natten over ved 4 ° C på gyngende ryster. </li><li> Fjern DNase løsning og skyl med vaskebuffer. </li><li> γ-sterilisering med 25 kGy </li></ol> 2. De forskellige celletyper 2.1 Isolering af primære humane dermale mikrovaskulære endotelceller (mvECs) og fibroblaster <ol><li> Skær hudbiopsi (helst preputium) i strimler af 2 - 3 mm bredde med skalpel og skyl dem 3x med PBS - løsning. </li><li> Dæk væv med Dispase opløsning og inkuber det til 16-18 timer ved 4 ° C. </li><li> Separate epidermis fra dermis med 2 pincetter og overføre både separat i petriskåle fyldt med PBS +. </li><li> Skyl dermis strimler 1x med Versene. </li><li> Tilsæt 10 ml trypsin / EDTA-opløsning til dermis strimler og inkuberes det i inkubatoren i 40 min. </li><li> Stop enzymreaktionen straks med 1% FCS. </li><li> Overfør skindstrimler til en petriskål fyldt med VascuLife og ridse ud hver strimmel med skalpel 8x hver side, tilføjer en lidt pres. </li><li> Overfør den producerede cellesuspensionen via en cellefilter til et centrifugerør og skyl cellefilter 3x med VascuLife. </li><li> Centrifuger røret ved 1.200 xg i 5 minutter og resuspender cellepelleten med VascuLife. </li><li> At isolere de fibroblaster, chop dermis strimler i små stykker ved hjælp af skalpel. </li><li> Tilsæt 10 ml collagenase løsning på dermis stykker. </li><li> Inkubér det i 45 min i inkubatoren, centrifugeres den, og fjern forsigtigt supernatant. </li><li> Vask pellet 1x med DMEM + 10% FCS +% PenStrep, centrifugeres den, og fjern forsigtigt supernatanten. </li><li> Pellet resuspenderes i dyrkningsmedium og overføre det til en T75 dyrkningskolbe at tillade celler til at vokse ud af vævet. </li></ol> 2.2 tumorcellelinien S462 Den tumorcellelinien S462 (venligst stillet til rådighed af Dr. Nikola Holtkamp, ​​Charité University Medicine Berlin) blev genereret fra en ondartet perifer nerve kappe tumor af en kvindelig patient med arvelig tumor disposition syndrom neurofibromatosis type 1 9. S462 er dyrket i DMEM suppleret med 10% FCS. Medium skal skiftes hver 2 - 3 dage. En gang om ugen cellerne skal opdeles. 3. Tumor Test System: stillestående kultur Betingelser Sammenlignet med Dynamic Kultur i bioreaktorsystemer <ol><li> Skær rørformede SIS-Muc åben på den ene side og ordne det mellem to metalringe (celle kroner, 10 mm i diameter, self constructed). Dæk SIS-Muc i cellekultur medium natten over. </li><li> Seed isolerede celler i definerede celletal (se nedenfor) på en eller begge sider af SIS (mono-eller co-kultur set-up). <ol><li> Seed 8.000 celler / cm2 af primære mvECs i et totalvolumen på 100 pi på den basolaterale overflade af SIS (tidligere serosa). 3 timer senere fylde godt med væske, at en nedsænket kultur. </li><li> Tillad endotelceller til at klæbe i 3 dage. Vend statiske kultur systemet ved 180 ° og overføre det til en 12-brønds plade. </li><li> Seed en blanding af primære dermale fibroblaster (8000 celler / cm 2) og tumorceller (15000 celler / cm 2) i et samlet volumen på 500 pi på den apikale overflade af SIS (ved siden af de tidligere lumen). </li><li> Tillad celler til at holde i 3 timer og fylde godt med medium (nedsænket kultur, medium: 50% Vasculife + 50% DMEM suppleret med 10% FCS). </li><li> Tumor testsystem dyrkes under statiske betingelser, ent 37 ° C, 5% CO2 i inkubatoren i yderligere 14 dage. Skift dyrkningsmedium hver 2 - 3 dage. </li></ol></li><li> For den dynamiske kultur, fix SIS-Muc mellem to metalringe og frø primære mvECs som beskrevet i 3.2.1. Efter 3 dage fjernes SIS Muc fra metalringe og indsæt membranen ind strømningsreaktoren (se figur 2C og 2D). Påfør den primære dermale fibroblaster og tumorceller med en sprøjte og kanyle på matrixen i bioreaktoren, og lade cellerne adhærere i 3 timer før påfyldning bioreaktorsystemet med dyrkningsmedium. </li><li> Den følgende dag dynamiske dyrkningsbetingelser med konstant medium flow (3,8 ml / min, 37 ° C og 5% CO 2) kan påbegyndes. Den dynamiske Kulturen opretholdes i 14 dage, er dyrkningsmediet ændres efter 7 dage. </li><li> Den dynamiske test setup er dyrket i et egenproduceret inkubator, der giver medierne flow gennem en pumpe og den nødvendige temperatur og CO 2 </sub&gt; Indhold. </li></ol> 4.. Karakterisering metoder til analyse 4.1 Fastsættelse og paraffin-indlejring af den udsåede collagenmatrix <ol><li> For (immuno-) histologiske karakteriseringer fjerne dyrkningsmediet og løse væv med 4% paraformaldehyd i 2 timer. </li><li> Fjern 4% paraformaldehyd og overføre SIS fra metalindlægget til et væv indlejring kassette. Vand vævet til at fjerne resterende fiksativ og dehydrere for paraffin infiltration. </li><li> Før indstøbning i paraffin blok, skåret SIS i 2 - 3 skiver, og læg dem i en paraffin fyldt metal base mug, så snitfladerne vender nedad. Tilsæt væv kassetten på toppen af ​​formen som underlag. </li><li> Skær 5 um skiver og flyde dem på en 40 ° C vandbad til opretning, derefter montere slides på passende objektglas. Ubelagte slides bruges til H &amp; E pletter, polylysin-belagt slides for immunhistologisk farvning til at forbedre vedhæftning.Lad skiverne tørre grundigt. </li><li> Smelt paraffin, fjerne det med xylen og rehydrere skiver for at følge farvning. </li></ol> 4.2 Farvning <ol><li> De rehydrerede skiver kan farves med hæmatoxylin / eosin som en standardiseret overblik farvning. </li><li> For immunhistological farvning, de faste og paraffin-infiltreret vævssnit skal gennemgå et antigen hentning at tillade antistoffer til at genkende og binde sig til deres specifikke epitoper. Derfor afparaffiniseret og rehydrerede slides anbringes i en dampkoger med opvarmet citratbuffer (pH 6,0) i 20 min. </li><li> Overfør dias til vaskebuffer (0,5 M TBS buffer + 0,5% Tween) og cirkel skiver med en PAP pen til at minimere det nødvendige volumen for farvningsopløsninger. </li><li> Placer dias i en fugt kammer. At sikre en specifik peberrodperoxidase-medieret visualisering af antigen-antistof-binding, skal den endogene peroxidase være mættet med 3% hydrogenperoxid. </li><li> Primær ANTIBODY fortyndinger påføres udsnittene inkuberet i 1 time ved stuetemperatur og forsigtigt vasket med vaskebuffer. </li><li> Til påvisning af specifikke antigen-antistof bindinger Ultra Vision Quanto Detection System HRP DAB (Thermo Scientific) anvendes i overensstemmelse med den anbefalede protokol. </li><li> Kerner modfarvet med hæmatoxylin i 1 min. </li><li> Objektglas monteres med et vandigt medium, tørres og afbildes ved hjælp af en omvendt mikroskop. </li></ol>

<ol>
	<li>Schenke-Layland, K., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+tissue+models--moving+towards+personalized+regenerative+medicine.">In vitro human tissue models--moving towards personalized regenerative medicine.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 63, 195-196 (2011).</li><li>Pusch, J., Votteler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+performance+of+a+three-dimensional+model+that+mimics+the+microenvironment+of+the+small+intestine.">The physiological performance of a three-dimensional model that mimics the microenvironment of the small intestine.</a> Biomaterials. 32, 7469-7478 (2011).</li><li>Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularised+human+tissue+models:+a+new+approach+for+the+refinement+of+biomedical+research.">Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research.</a> J. Biotechnol. 148, 56-63 (2010).</li><li>Lanza, R., Langer, R., Vacanti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of tissue engineering. , (2007).</li><li>Barron, V., Lyons, E., Stenson-Cox, C., McHugh, P. E., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactors+for+cardiovascular+cell+and+tissue+growth:+a+review.">Bioreactors for cardiovascular cell and tissue growth: a review.</a> Ann. Biomed. Eng. 31, 1017-1030 (2003).</li><li>Martin, I., Wendt, D., Heberer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+bioreactors+in+tissue+engineering.">The role of bioreactors in tissue engineering.</a> Trends Biotechnol. 22, 80-86 (2004).</li><li>Mertsching, H., Walles, T., Hofmann, M., Schanz, J., Knapp, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+vascularized+scaffold+for+artificial+tissue+and+organ+generation.">Engineering of a vascularized scaffold for artificial tissue and organ generation.</a> Biomaterials. 26, 6610-6617 (2005).</li><li>Linke, K., Schanz, J., Hansmann, J., Walles, T., Brunner, H., Mertsching, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+liver-like+tissue+on+a+capillarized+matrix+for+applied+research.">Engineered liver-like tissue on a capillarized matrix for applied research.</a> Tissue Eng. 13, 2699-2707 (2007).</li><li>Holtkamp, N., Atallah, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP-13+and+p53+in+the+progression+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.">MMP-13 and p53 in the progression of malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Neoplasia. 9, 671-677 (2007).</li><li>Weaver, V. M., Petersen, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Hutmacher, D. W., Horch, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+tissue+engineering+technology+platforms+into+cancer+research.">Translating tissue engineering technology platforms into cancer research.</a> J. Cell. Mol. Med. 13, 1417-1427 (2009).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Yang, S. -. T., Zhang, X., Wen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbioreactors+for+high-throughput+cytotoxicity+assays.">Microbioreactors for high-throughput cytotoxicity assays.</a> Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 11, 111-127 (2008).</li><li>Schultheiss, D., Gabouev, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+vascularized+matrix+for+bladder+tissue+engineering:+matrix+preparation,+reseeding+technique+and+short-term+implantation+in+a+porcine+model.">Biological vascularized matrix for bladder tissue engineering: matrix preparation, reseeding technique and short-term implantation in a porcine model.</a> J. Urol. 173, 276-280 (2005).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

<html> Ved sammenligning af 2D og 3D dyrkningssystemer i tumor forskning, 3D-systemer, på trods af at være dyrere fremgangsmåde har vist sig at efterligne betingelserne i biologiske mikromiljøer bedre. Det kunne påvises, at nogle tumorceller vokser meget langsommere i en 3D-kultur end i et fælles 2D kultur 12, som er i overensstemmelse med den situation, i en reel tumor. Bissell og kolleger viste i deres arbejde, at opførslen af kræftfremkaldende bryst celler afspejler in vivo situation, herunder celle morfologi og signalering, mere præcist, når et 3D-kultur i en matrix tilbyder celle-ECM interaktioner. Desuden har de understregede vigtigheden af ​​det ekstracellulære miljø i 3D ved at vise, at ændringer i de miljømæssige interaktioner førte til reversion af de maligne celler til en normal fænotype. Derudover og vigtigst af alt, kan disse resultater også blive bekræftet i in vivo dyremodeller 10,11. NDHOLDET &quot;&gt; Den direkte sammenligning af in vivo dyreforsøg og in vitro vævsmodellerne afslører fordele og ulemper i begge systemer. En fordel ved in vitro modeller er det tilladelse af en meget bedre realtid eller fast billeddannelse ved mikroskopi. En begrænsning er, at de efterligner statiske eller kortvarige forhold, hvorimod in vivo systemer ofte fremskridt. Den nuværende mangel på vaskulatur og normal transport af små molekyler, vært immunrespons og andre celle-celle-interaktioner er yderligere ulemper ved in vitro-modeller 12. Derfor 3D in vitro-systemer, som præsenteres i denne undersøgelse giver et lovende supplement til dyreforsøg. De giver en bedre sammenlignelighed for den menneskelige organisme og dermed minimere eksperimentelle fejlfortolkninger. Biomimetic in vivo modelsystemer vil dermed blive mere relevant at undersøge, hvordan kræft og metastatisk spredning er afhængig på microenvironmental betingelser, der regulerer tumorigenesis 11. Vores undersøgelse viser, at 3D-miljø, som SIS-Muc fører til en mere tumor-lignende væv dannelse af celler, der ikke er observeret i den fælles 2D cellekultur (se figur 3A). Endvidere er anvendelsen af ​​primære celler fra tumor biopsier er et meget vigtigt skridt i retning af skræddersyet medicin, en disciplin, der sigter på at identificere den bedste behandling afhængig af patientens individuelle behov. Omfattende primære patient-specifikke tumorceller isoleret fra biopsi materiale vil tillade in vitro afprøvning af terapeutiske strategier. Sådanne testsystemer vil gøre det muligt at undersøge forskellige lægemidler og kombinationer deraf i en tids-og omkostningsbesparende high-throughput screening. Derudover integration af tumorassocierede stromale celler som vist i denne undersøgelse er vigtig for den personlige fremgangsmåde, eftersom en tumor microenvironment påvirkninger tumorprogression 13 og kan vise sig som suitable terapeutisk mål. Alternativt til en personlig tilgang kan vores tumormodel modificeres til at tjene som en generaliseret tumor testsystem ved inkorporering af etablerede tumorigene cellelinjer. Dette er en lovende tilpasning til grundlæggende forskning. For både narkotika testning nærmer tilstedeværelsen af ​​en vaskulær struktur er nødvendig for at teste distributionen og udbredelsen af ​​terapeutiske stoffer. SIS-Muc matrix tillader basolaterale såning med primær mvEC for barriere optagelse undersøgelser vil tilsået af de bevarede vaskulære strukturer BioVaSc yderligere at forbedre studiet af drug delivery. For at skabe væv modeller kan en 3D bionedbrydelig matrix blive brugt som ramme for en co-kultur af forskellige celletyper 14. Anvendelsen af ​​sådanne 3D matricer ofte begrænset af manglen på et funktionelt vaskularisering. Dette problem kan løses ved anvendelse af BioVaSc, som tilbyder konserveret blodkar structures, som kan reseeded med endotelceller. Endvidere BioVaSc giver ekstracellulære komponenter, der sikrer adhæsionen af ​​cellerne og lette vævsdifferentiering. Det giver også lang tid væv specifikke funktion bioartificial 3D væv 7,8,15. Forudsætningen for projekteringen af ​​funktionelle vaskulære erstatninger er efterligning af menneskets fysiologiske og biomekaniske forhold. Derfor bioreaktor systemer, der kan implementere disse krav in vitro, er af ekstrem interesse for at skabe biologiske tumormodeller. Kombinationen af ​​BioVaSc, bioreaktoren teknologi og co-dyrkning af forskellige celletyper er en meget lovende metode til at generere vaskulariserede tumorvæv, som muliggør undersøgelse af mekanismer er relevante for udviklingen af ​​kræft, såsom angiogenese og metastase. Vi ser sådanne tumormodeller som en lovende metode til at supplere dyreforsøg ved at give en tilsvarendetil human tumor fysiologi.

Nye lægemidler skal valideres i forhold til deres kvalitet, sikkerhed og effektivitet, før markedsføringstilladelse. Til dato dyreforsøg er standardmetoden for drug test og validering. Men på grund af artsspecifikke forskelle dyreforsøg ofte ikke udtømmende evaluere virkningen af forbindelserne i mennesker 1. Af denne grund er det vigtigt at generere humane væv modeller, der kan anvendes til in vitro-test af nye lægemidler og stoffer. Et af de centrale punkter i vores gruppe er oprettelsen af in vitro-testmodeller med vores biologiske vaskulariseret stillads (BioVaSc) 2,3. Den BioVaSc kan anvendes som en statisk eller dynamisk 3D matrix system. Ved statisk kultur, er det decellulariserede svine jejunal segment (Small tarmsubmucosa SIS-MUC) placeret i en metalindsats for celle tilsået. Forskellige celler, såsom cancer og endotelceller kan dyrkes på stilladset. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; For dynamisk kultur er BioVaSc fastgjort til en bioreaktor, der anvender flow gennem vaskulaturen eller på tværs af overfladen på stilladset. Aktuelle bioreaktorer gennemføre biologiske, mekaniske eller elektriske stimuli, der virker på differentiering eller proliferation af celler 4. For bioreaktorer inden for Tissue Engineering, det grundlæggende koncept er at simulere forholdene i den menneskelige krop. Hvori, celler tilvejebragt et naturligt miljø, hvor de kan interagere med hinanden og deres omgivende ekstracellulære matrix. Til fremstilling af in vitro testsystemer eller transplantationer, evnen til at efterligne det naturlige miljø af celler med en passende bærer struktur og bioreaktor er kritisk 5. Derfor skal mere komplekse og teknisk krævende enheder blive udviklet for at opfylde disse opgaver 6. Det er endvidere muligt at bruge vores stillads til establishment af en vaskulariseret model på grund af de bevarede rørformede strukturer, som omfatter fodring arterie, vene, og den forbinder kapillarleje. Alle svineceller skal fjernes ved kemisk, mekanisk og enzymatisk decellularization og stilladset gamma-steriliseres. De gendannede rørformede karstrukturer kan efterfølgende reseeded med humane mikrovaskulære endotelceller ved hjælp af en recirkulation perfusionsbioreaktor 7, som efterligner de biomekaniske og / eller biokemiske parametre, såsom pH, temperatur, tryk, næringsstofforsyning og renovation 6. Den fornyede endotelialisering af de rørformede strukturer skaber en menneskelig blodkar svarer inden kollagen stillads 3,7. I det følgende trin, kan overfladen af de tidligere lumen (slimhinder) seedes med primære humane celler til at etablere co-kulturer 3,7,8. I denne undersøgelse en 3D-tumor test systemet er sat op ved co-dyrkning af en tumor cellelinje med primær stRomal celler under statiske og dynamiske forhold på SIS-Muc.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase solution</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>17454</td>
			<td>(500 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>(2.0 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high-glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>G0001,3010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DZ solution</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3484.2</td>
			<td>34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td>
			<td>DCS</td>
			<td>PD000KIT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical pressure transducer</td>
			<td>MEMSCAP</td>
			<td>SP844</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>M0616</td>
			<td>Clone F8/86 0.12 &mu;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-human p53</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>IS616</td>
			<td>Clone DO-7 ready-to-use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile disposable dome</td>
			<td>MEMSCAP</td>
			<td>844-28</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA solution</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-003</td>
			<td>0,05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife (VEGF-Mv)</td>
			<td>Lifeline</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-033</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue engineering of a human 3d in vitro tumor test system

Kræft er en af ​​de førende dødsårsager på verdensplan. Nuværende terapeutiske strategier er overvejende udviklet i 2D kultur-systemer, som ikke er tilstrækkeligt afspejler fysiologiske betingelser in vivo. Biologiske 3D matricer giver cellerne et miljø, hvor celler kan selv-organisere tillader undersøgelse af væv organisation og celledifferentiering. Sådanne stilladser kan podes med en blanding af forskellige celletyper for at studere direkte 3D celle-celle-interaktioner. At efterligne 3D kompleksitet kræftsvulster har vores gruppe udviklet en 3D in vitro tumor testsystemet. Vores 3D væv test-modeller in vivo situationen af maligne perifere nerve skede tumorer (MPNSTs), som vi etablerede med vores decellulariseret svin jejunal segment afledt biologisk vaskulariseret stillads (BioVaSc). I vores model, vi genpodedes en modificeret BioVaSc matrix med primære fibroblaster, mikrovaskulære endotelceller (mvECs) og S462 tumor cellelinie. Ved statisk kultur, er den vaskulære struktur BioVaSc fjernet, og den resterende stillads er skåret åben på den ene side (lille tarmsubmucosa SIS-Muc). Den resulterende matrix derefter fast mellem to metalringe (celle kroner). En anden mulighed er at dyrke cellen udsåede SIS Muc i en strøm bioreaktor, der udsætter cellerne for forskydningsspænding. Her bioreaktoren forbundet til en peristaltisk pumpe i et egenproduceret inkubator. En computer regulerer arteriel oxygen og næringsstofforsyning via parametre, såsom blodtryk, temperatur og strømningshastighed. Denne opsætning giver mulighed for en dynamisk kultur med enten tryk-regulerede pulserende eller konstant flow. I denne undersøgelse kunne vi kunne etablere både en statisk og dynamisk 3D dyrkningssystem for MPNSTs. Evnen til at modellere kræftsvulster i en mere naturlig 3D-miljø vil gøre det muligt opdagelse, afprøvning og validering affremtidige lægemidler i et menneske-lignende model.

Som vist i figur 1B, vi decellulariseret porcin jejunal segment (omkring 2 m i længden og 20 mm i diameter) med konserverede rørformede strukturer i det kapillære netværk. Efter kemiske, enzymatiske og mekanisk decellularization opnåede vi et kollagen I / III stillads, som kan bruges til 3D cellekultur. En Feulgen test blev udført for at demonstrere renhed (ingen DNA-rester) af matricen (data ikke vist). 2A og 2B viser den statiske kultur af SIS-Muc sikret ved celle kroner. Vi fast SIS-Muc i en in-house designet bioreaktor (Figur 2C) til dynamisk kultur. Figur 2D illustrerer den simulerede dynamiske flow gennem kammeret af bioreaktoren. Bioreaktoren er placeret i et egenproduceret inkubatorsystem og forbundet med en peristaltisk pumpe. Denne opsætning giver mulighed for en dynamisk kultur med enten tryk-regulerede pulserende flow eller c<html> onstant flow. Figur 3 giver en oversigt over den statisk dyrket S462 tumor cellelinie 2D monokultur (figur 3A) og i 3D cokultur (3B-3D). 3B viser tredobbelt kultur af tumorceller S462 og primære fibroblaster på den apikale side af SIS -Muc (tidligere indre lumen side) og mvEC på den basolaterale side (tidligere serosa side). Identifikationen af forskellige celletyper er muligt ved farvning celletype-specifikke markører, såsom von Willebrand-faktor til at mærke mvEC (figur 3C). P53-positive S462 celler kan skelnes fra p53-negative primære fibroblaster (figur 3D) og 3D-fordeling af celler kan analyseres Figur 4 viser farvninger svarende til figur 3 af det dynamisk dyrket tredobbelt kultur.. <html> 0460/50460fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1. Decellularization set-up. (A) bioreaktor og pumpe set-up for decellularizing af BioVaSc, overvåget af en pc. (B) decellulariserede BioVaSc i glas tank. Hulrummet og arteriel indløb er forbundet til adapterne. . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig2.jpg" /> Figur 2. Over betragtning af de forskellige kultur opsætninger. (A) CAD snitbillede af statisk kultur system mikrotiterbrønd plade (B) metalindlæg til statisk kultur, (C) mediestrøm simulering (hastighedsfelt [m / s]) til dynamisk kultur af den øvre låg af strømmen bioreaktoren , (D) strømning bioreaktor til dynamisk kultur forbundet til peristaltisk pumpe. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> ent &quot;fo: keep-together.within-side =&quot; altid &quot;&gt; <img alt="Figur 3" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig3highres.jpg" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig3.jpg" /> Figur 3. Oversigt over immunhistologisk karakterisering af statiske 3D tumormodel. (A) Hematoxylin plet på den statisk dyrket 2D monokultur af S462-celler på en Permanox dias, (B) H &amp; E farvning af statisk dyrket 3D tredobbelt kultur, pile markerer endotelceller (C) immunhistologisk farvning for von Willebrand-faktor, (D ) immunohistological farvning for p53. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> <img alt="Figur 4" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig4highres.jpg" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig4.jpg" /> <strong&gt; Figur 4.. Oversigt over immunhistologisk karakterisering af den dynamiske 3D tumormodel. (A) H &amp; E farvning af dynamisk dyrkede 3D ​​tredobbelt kultur, pile markerer endotelceller, (B) immunohistological farvning for von Willebrand-faktor, (C) immunohistological farvning for p53. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a>

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System at JoVE.com

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Metoder til at skabe menneskelige 3D tumorvæv som testsystemer er beskrevet. Disse teknologier er baseret på et decellulariserede biologiske vaskulariseret Scaffold (BioVaSc), primære humane celler og tumor-cellelinie, som kan dyrkes under statiske såvel som under dynamiske forhold i en strøm bioreaktoren.

Tissue Engineering af et menneske 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Tissue Engineering: Opførelse af en multicellulært 3D Stillads for levering af Layered celleark

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

Tissue Engineering af Tumor Stromal mikromiljø med Application til cancercelleinvasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Kirurgisk Retrieval, Isolering og<em&gt; In vitro</em&gt; Udvidelse af menneskelige Forreste korsbånd-afledte celler til vævsdyrkningsapplikationer

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produktion, karakterisering og potentielle anvendelse af en 3D-Tissue-manipuleret humant Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Engineering 3D Cellularized kollagengeler for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øjenirritation Test (EIT) for Hazard Identifikation af Eye Irriterer Kemikalier hjælp rekonstrueret human Cornea-lignende Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

En kombineret 3D manipuleret væv<em&gt; In vitro</em&gt; /<em&gt; I Silico</em&gt; Lunge Tumor Model for Forudsigelse Drug Effektivitet i specifikke mutations baggrunde

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering af Intrinsic Vaskularisering i en<em&gt; In vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting af brusk og huden væv analoger udnytter en roman passiv blanding enhed teknik for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

Tvinge System med lodrette V-bøjninger: en 3D In vitro- vurdering af elastisk og stive rektangulære Archwires

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...