Name: tissue engineering of a human 3d in vitro tumor test system
Uploaded: 2013-08-06T08:56:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) for sin tekniske støtte til å utvikle bioreaktorer og bioreaktoren kuvøse.

En. Decellularization av BioVaSc <ol><li> Skyll det vaskulære system av porcine jejunal segment via kanylert arteriell tilgang og tarmlumen med PBS -. Gjenta til den er helt ren. </li><li> Forbered en 200 mm diameter glass tank med 4 adaptere og koble dem via silisium rør til den peristaltiske pumpen (Ismatec). Kan overvåkes trykkstyreenhet via en trykksensor som er koblet til en steril engangs kuppel (se figur 1). </li><li> Fyll reservoar flasker med decellularization (DZ) løsning og sjekk rørsystem for mulige luftbobler. </li><li> Koble intestinal lumen med kabelbånd til glass kontakter for luminal flyt. Pumpe 500 ml DZ oppløsningen inn i den røde arteriepunksjon (figur 1 B) av det vaskulære system. Avbryte pumping prosessen hvert 15 min kort tid å manuelt trykke ut hele tarm lumen. </li><li> Under decellularizatipå prosessen, bør trykket i bufferoppløsningen være mellom 80 - 100 mm Hg, formet etter de naturlige blodtrykket. </li><li> Vask BioVaSc med PBS - før det er fritt for cellerester (&quot;helt hvite&quot;). </li><li> Fyll BioVaSc helt med DZ-løsning og inkuberes det dukke i DZ-løsning over natten ved 4 ° C på gynge shaker. </li><li> Gjenta trinn 1.6. </li><li> Plasser BioVaSc i DNase-løsning og inkuberes over natten ved 4 ° C på gynge shaker. </li><li> Fjern DNase-løsning og skyll med vaskebuffer. </li><li> γ-sterilisering med 25 kGy </li></ol> 2. De forskjellige celletyper 2.1 Isolering av primære humane dermal mikrovaskulær endotelceller (mvECs) og fibroblaster <ol><li> Skjær hudbiopsi (helst preputium) i strimler av 2 - 3 mm bredde med skalpell og skyll dem 3x med PBS - løsning. </li><li> Dekk til vev med Dispase løsning og ruge det for 16 - 18 timer ved 4 ° C. </li><li> Separate epidermis fra dermis med to pinsetter og overføre både hver for seg i petriskåler fylt med PBS +. </li><li> Skyll dermis strimler 1x med Versene. </li><li> Tilsett 10 ml Trypsin / EDTA-løsning til dermis strimler og inkuberes den i inkubator i 40 min. </li><li> Stanse enzymreaksjonen umiddelbart med 1% FCS. </li><li> Overfør hud strips til en petriskål fylt med VascuLife og skrape ut hver stripe med skalpell 8x hver side, og legger litt press. </li><li> Overfør den fremstilte cellesuspensjon via en celle sil i et sentrifugerør, og skylle celle sil 3x med VascuLife. </li><li> Sentrifuger røret ved 1200 xg i 5 min, og cellepelleten suspenderes med VascuLife. </li><li> Å isolere fibroblaster, hogge dermis strimler i små biter ved hjelp av skalpell. </li><li> Tilsett 10 ml kollagenase løsning dermis stykker. </li><li> Inkuber det for 45 min i kuvøse, så sentrifuger det og forsiktig fjerne supernatant. </li><li> Vask pellets 1x med DMEM + 10% FCS +% PenStrep, sentrifuger den og fjern forsiktig supernatanten. </li><li> Resuspender pelleten i kulturmedium, og overføre den til en T75 kulturflaske for å tillate cellene å vokse ut av vevet. </li></ol> 2.2 Tumor Cell Linje S462 Svulsten cellelinje S462 (vennlig levert av Dr. Nikola Holtkamp, ​​Charité Universitetet Medicine Berlin) ble generert fra en ondartet perifere nerve sliren svulst av en kvinnelig pasient med arvelig tumor predisposisjon syndrom Nevrofibromatose type 1 9. S462 blir dyrket i DMEM supplert med 10% FCS. Medium må skiftes hver 2 - 3 dager. En gang i uken cellene må splittes. Tre. Tumor Test System: Statiske Kultur betingelser Sammenlignet med dynamisk kultur i bioreaktorsystemer <ol><li> Kutt rørformet SIS-Muc åpne på den ene siden og fikse det mellom to metallringer (celle kroner, mm diameter 10, selv constructed). Dekk til SIS-Muc i cellekulturmedium over natten. </li><li> Seed isolerte celler i definerte celletall (se nedenfor) på en eller begge sider av SIS-(mono-eller ko-kultur set-up). <ol><li> Seed 8000 celler / cm 2 av primær mvECs i et totalvolum på 100 ul på basolateral overflaten av SIS (former serosa). 3 timer senere fylle brønnen med medium for å sikre en nedsenket kultur. </li><li> Tillat endotelceller til å følge i 3 dager. Flip den statiske kultursystem 180 ° og overfører det til en 12-brønns plate. </li><li> Seed en blanding av primære dermale fibroblaster (8000 celler / cm 2) og tumor celler (15000 celler / cm 2) i et totalvolum på 500 ul på den apikale overflate av SIS (ved siden av de tidligere lumen). </li><li> Tillat celler til å følge i 3 timer og fylle brønnen med medium (nedsenket kultur, medium: 50% Vasculife + 50% DMEM supplert med 10% FCS). </li><li> Svulsten testsystemet er dyrket under statiske forhold ent 37 ° C, 5% CO2 i inkubatoren i ytterligere 14 dager. Endre kultur medium hver 2 - 3 dager. </li></ol></li><li> For den dynamiske kultur, fikse SIS-Muc mellom to metallringer og frø primære mvECs som beskrevet i 3.2.1. Etter 3 dager fjernes SIS-MUC fra metallringer og sette membranen inn i strømningsreaktoren (se figur 2C og 2D). Påfør primære dermale fibroblaster og tumorceller med en sprøyte og kanyle til matrisen i bioreaktoren, og la cellene få feste seg i 3 timer før fylling av bioreaktor-systemet med kulturmedium. </li><li> Dagen etter dynamiske kultur forhold med konstant medium flow (3,8 ml / min, 37 ° C, og 5% CO 2) kan igangsettes. Den dynamiske Kulturen holdes i 14 dager, blir dyrkningsmediet byttet etter 7 dager. </li><li> Den dynamiske testoppsettet er dyrket i en selv konstruert inkubator som inneholder mediet strømme gjennom en pumpe, og den nødvendige temperatur og CO to </sub&gt; Innhold. </li></ol> 4. Karakterisering metoder for analyse 4.1 Feste og parafin-embedding av seeded kollagene matrise <ol><li> For (immuno-histologiske) karakteriseringer fjernes kulturmediet og fikse vevet med 4% paraformaldehyd i 2 timer. </li><li> Fjern 4% paraformaldehyde og overføre SIS fra metallinnsatsen til en vev embedding kassett. Vanne vev for å fjerne gjenværende fiksativ og virke uttørrende for parafin infiltrasjon. </li><li> Før innstøping i en parafinblokk, kutte SIS i 2 - 3 skiver og legg dem i en parafin-fylt metall base mugg slik at snittflatene vender nedover. Legg vevet kassetten på toppen av formen som et underlag. </li><li> Skjær 5 mikrometer skiver og flyte dem på et 40 ° C vannbad for retting, og deretter montere lysbilder på egnede glassplater. Ubestrøket lysbilder brukes for H &amp; E flekker, polylysin-belagt lysbilder for immunohistological flekker å forbedre vedlegg.La skivene tørke grundig. </li><li> Smelt parafin, fjerne den med xylen og rehydrere skiver for å følge farging. </li></ol> 4.2 Farging <ol><li> De rehydrerte skiver kan farges med Hematoxylin / eosin som en standardisert oversikt farging. </li><li> For immunhistological farging, de faste og parafin-infiltrert vev skiver må gjennomgå et antigen gjenfinning å tillate antistoffer å gjenkjenne og binde seg til deres spesifikke epitoper. Derfor deparaffinized og rehydratiserte lysbilder er plassert i en dampkoker med oppvarmet citratbuffer (pH 6,0) i 20 min. </li><li> Overfør glir da til vaskebuffer (0,5 M TBS-buffer + 0,5% Tween) og sirkelskiver med en PAP-penn for å minimalisere det nødvendige volumet for farging løsninger. </li><li> Plasser lysbildet i fuktkammeret. For å sikre en bestemt pepperrot-peroxydase-mediert visualisering av antigen-antistoff-binding, må endogen peroksidase være mettet med 3% hydrogenperoksyd. </li><li> Primær AntibOdy fortynningene påføres på stykker, inkubert i 1 time ved romtemperatur og ble grundig vasket med vaskebuffer. </li><li> For påvisning av spesifikke antigen-antistoff bindinger Ultra Vision Quanto Detection System HRP DAB (Thermo Scientific) brukes i henhold til anbefalt protokollen. </li><li> Atomkjerner er kontra med Hematoxylin for 1 min. </li><li> Objektglassene montert med et vandig medium, tørket og fotografert ved å bruke et inverst mikroskop. </li></ol>

<ol>
	<li>Schenke-Layland, K., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+tissue+models--moving+towards+personalized+regenerative+medicine.">In vitro human tissue models--moving towards personalized regenerative medicine.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 63, 195-196 (2011).</li><li>Pusch, J., Votteler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+performance+of+a+three-dimensional+model+that+mimics+the+microenvironment+of+the+small+intestine.">The physiological performance of a three-dimensional model that mimics the microenvironment of the small intestine.</a> Biomaterials. 32, 7469-7478 (2011).</li><li>Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularised+human+tissue+models:+a+new+approach+for+the+refinement+of+biomedical+research.">Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research.</a> J. Biotechnol. 148, 56-63 (2010).</li><li>Lanza, R., Langer, R., Vacanti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of tissue engineering. , (2007).</li><li>Barron, V., Lyons, E., Stenson-Cox, C., McHugh, P. E., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactors+for+cardiovascular+cell+and+tissue+growth:+a+review.">Bioreactors for cardiovascular cell and tissue growth: a review.</a> Ann. Biomed. Eng. 31, 1017-1030 (2003).</li><li>Martin, I., Wendt, D., Heberer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+bioreactors+in+tissue+engineering.">The role of bioreactors in tissue engineering.</a> Trends Biotechnol. 22, 80-86 (2004).</li><li>Mertsching, H., Walles, T., Hofmann, M., Schanz, J., Knapp, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+vascularized+scaffold+for+artificial+tissue+and+organ+generation.">Engineering of a vascularized scaffold for artificial tissue and organ generation.</a> Biomaterials. 26, 6610-6617 (2005).</li><li>Linke, K., Schanz, J., Hansmann, J., Walles, T., Brunner, H., Mertsching, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+liver-like+tissue+on+a+capillarized+matrix+for+applied+research.">Engineered liver-like tissue on a capillarized matrix for applied research.</a> Tissue Eng. 13, 2699-2707 (2007).</li><li>Holtkamp, N., Atallah, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP-13+and+p53+in+the+progression+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.">MMP-13 and p53 in the progression of malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Neoplasia. 9, 671-677 (2007).</li><li>Weaver, V. M., Petersen, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Hutmacher, D. W., Horch, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+tissue+engineering+technology+platforms+into+cancer+research.">Translating tissue engineering technology platforms into cancer research.</a> J. Cell. Mol. Med. 13, 1417-1427 (2009).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Yang, S. -. T., Zhang, X., Wen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbioreactors+for+high-throughput+cytotoxicity+assays.">Microbioreactors for high-throughput cytotoxicity assays.</a> Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 11, 111-127 (2008).</li><li>Schultheiss, D., Gabouev, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+vascularized+matrix+for+bladder+tissue+engineering:+matrix+preparation,+reseeding+technique+and+short-term+implantation+in+a+porcine+model.">Biological vascularized matrix for bladder tissue engineering: matrix preparation, reseeding technique and short-term implantation in a porcine model.</a> J. Urol. 173, 276-280 (2005).</li></ol>

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

<html> Når man sammenligner 2D-og 3D-kultur-systemer i tumor forskning, 3D-systemer, til tross for at den dyrere tilnærming, har vist seg å etterligne forholdene i biologiske microenvironments bedre. Det kan bli vist at noen tumorceller vokse langt langsommere i en 3D-kultur enn i en vanlig 2D kultur 12, som er i henhold til situasjonen i et fast tumor. Bissell og kolleger viste i sitt arbeid at atferden til kreftfremkallende brystcellene reflekterer in vivo situasjon, inkludert celle morfologi og signalering, mer nøyaktig når et 3D-kultur i en matrise tilbyr celle-ECM interaksjoner. Videre er understreket de viktigheten av det ekstracellulære miljø i 3D ved å demonstrere at endringer i miljøvern interaksjoner førte til tilbakeføring av de ondartede cellene til en normal fenotype. I tillegg, og viktigst, kan disse resultatene også bli bekreftet i in vivo dyremodeller 10,11. ontent &quot;&gt; Den direkte sammenligning av in vivo-dyreforsøk og in vitro vev modeller viser fordeler og ulemper i begge systemer. Én fordel av in vitro-modeller er tillatelse av en mye bedre i sanntid eller fast avbildning ved mikroskopi. En begrensning er at de etterligner statisk eller kortsiktige forhold, mens in vivo-systemer ofte fremgang. Den nåværende mangelen på blodkar og normal transport av små molekyler, vert immunreaksjoner, og andre celle-celle interaksjoner er flere ulemper ved in vitro-modeller 12. Derfor 3D in vitro-systemer som presenteres i denne studien har en lovende tillegg til dyreforsøk. De gir et bedre sammenlignbarhet for den menneskelige organisme, og dermed minimere eksperimentelle feiltolkninger. Biomimetic in vivo modellsystemer vil derfor bli mer relevant å studere hvordan kreft og metastatisk spredningen er avhengig på microenviron forhold som regulerer tumorigenesis 11. Vårt studium viser at den 3D miljø tilbys av SIS-MUC fører til en mer tumor-lignende vev dannelse av celler, som ikke er observert i den felles 2D cellekultur (se figur 3A). Videre er bruken av primære celler avledet fra tumor biopsier et svært viktig skritt i retning av personlig medisin, en disiplin som tar sikte på å identifisere den beste behandling avhengig av pasientens individuelle behov. Innlemming primære pasient-spesifikke tumorceller isolert fra biopsimateriale vil tillate in vitro testing av terapeutiske strategier. Slike testsystemer vil gjøre det mulig å undersøke forskjellige medikamenter og kombinasjoner derav, i en tid-og kostnadssparende high-throughput screening. I tillegg, er integrering av tumorassosierte stromale celler, som vist i denne studien viktig for personlig tilnærming, siden en tumor er mikromiljøet påvirker tumorprogresjon 13, og kan vise seg som suitable terapeutisk mål. Alternativt til en personlig tilnærming kan vår tumormodell bli endret for å tjene som en generalisert tumortest-system ved inkorporering av etablerte tumorigene cellelinjer. Dette er en lovende tilpasning for grunnleggende forskningsformål. For begge medikamenttesting nærmer nærvær av en vaskulær struktur er nødvendig for å teste fordeling og opptak av terapeutiske stoffer. SIS-Muc matrise lar basolateral seeding med primær mvEC for barriere opptak studier, vil reseeding av de bevarte vaskulære strukturer av BioVaSc ytterligere forbedre studiet av levering av legemidler. For å skape vev modeller, kan en 3D bionedbrytbar matrise brukes som rammeverk for en ko-kultur i forskjellige celletyper 14. Bruken av slike 3D matrikser er ofte begrenset ved fravær av et funksjonelt vaskularisering. Dette problemet kan løses ved bruk av BioVaSc, som har bevart blodkar structures, som kan reseeded med endotelceller. Videre gir BioVaSc ekstracellulære komponenter, som sikrer vedheft av cellene og legge til rette vev differensiering. Det gjør det også på lang tid vev spesifikk funksjon av kunstig biologisk 3D vev 7,8,15. Forutsetningen for prosjektering av funksjonelle vaskulære substitutter er hermet av menneskets fysiologiske og biomekaniske forhold. Derfor bioreaktorsystemer, som kan implementere disse kravene in vitro, er av ekstrem interesse for å lage biologiske tumor modeller. Kombinasjonen av BioVaSc, i bioreaktoren teknologi og ko-dyrking av ulike celletyper en svært lovende metode for å generere vascularized tumorvev, noe som vil gjøre det mulig å studere mekanismene er relevante for progresjon av kreft slik som angiogenese og metastase. Vi ser slike tumormodeller som en lovende tilnærming for kompletterer dyrestudier ved å gi en tilsvarendetil den menneskelige tumor fysiologi.

Nye legemidler må godkjennes i forhold til kvalitet, sikkerhet og effekt før markedsgodkjennelse. Til dags dato, dyreforsøk er standard metode for narkotika testing og validering. Men på grunn av artsspesifikke forskjeller, dyreforsøk ofte ikke omfattende evaluere effekten av forbindelsene hos mennesker 1. Av denne grunn er det viktig å generere humane vev modeller som kan brukes for in vitro-tester av nye stoffer og stoffer. En av de fokuserer på vår gruppe er etableringen av in vitro testmodeller med vår biologiske vaskularisert stillas (BioVaSc) 2,3. Den BioVaSc kan brukes som en statisk eller dynamisk 3D matrisesystem. For statisk kultur, er det decellularized svin jejunal segmentet (Small Intestinal submukosa SIS-Muc) plassert i en metallinnlegg for celle reseeding. Forskjellige celler, slik som kreft og endoteliale celler kan dyrkes på stillaset. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; For dynamisk kultur, er BioVaSc festet til en bioreaktor-systemet som gjelder flyte gjennom vaskulaturen eller over overflaten av stillaset. Omløps bioreaktorer implementere biologiske, mekaniske eller elektriske stimuli som fungerer på differensiering eller spredning av celler fire. For bioreaktorer innen Tissue Engineering, er det grunnleggende konseptet for å simulere forholdene i menneskekroppen. Hvori, er celler gitt et naturlig miljø der de kan samhandle med hverandre og deres omkringliggende ekstracellulære matrise. For fremstilling av in vitro-testsystemer eller transplantasjoner, er evnen til å etterligne det naturlige miljøet i cellene med en passende bærerstruktur og bioreactor system kritisk 5. Derfor må mer komplekse og teknisk krevende enheter være utviklet for å oppfylle disse oppgavene seks. Det er videre mulig å bruke vår stillaset for etablishment av en vaskularisert modell på grunn av de bevarte rørformede strukturer, som omfatter foring arterie, vene, og forbindelses kapillær sengen. Alle svin celler må fjernes ved kjemisk, mekanisk og enzymatisk decellularization, og stillaset gamma-sterilisert. De gjenopprettede rørformede vaskulære strukturer kan deretter sådd på nytt med humane mikrovaskulære endotelceller ved hjelp av en resirkulerings-perfusjon bioreaktor 7, som etterligner de biomekaniske og / eller biokjemiske parametre som pH, temperatur, trykk, næringstilførsel og avfallsfjerning 6.. Den re-endothelialization av de rørformede strukturer skaper en menneskelig blodkar ekvivalent innenfor den kollagene stillaset 3,7. I det neste trinnet, kan overflaten av det tidligere lumen (mucosa) bli sådd med primære humane celler for å etablere ko-kulturer 3,7,8. I denne studien en 3D svulst testsystem er satt opp av co-dyrkning en tumor cellelinje med primær stRomal cellene under statiske og dynamiske forhold på SIS-Muc.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase solution</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>17454</td>
			<td>(500 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>(2.0 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high-glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>G0001,3010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DZ solution</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3484.2</td>
			<td>34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td>
			<td>DCS</td>
			<td>PD000KIT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical pressure transducer</td>
			<td>MEMSCAP</td>
			<td>SP844</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>M0616</td>
			<td>Clone F8/86 0.12 &mu;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-human p53</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>IS616</td>
			<td>Clone DO-7 ready-to-use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile disposable dome</td>
			<td>MEMSCAP</td>
			<td>844-28</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA solution</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-003</td>
			<td>0,05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife (VEGF-Mv)</td>
			<td>Lifeline</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-033</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue engineering of a human 3d in vitro tumor test system

Kreft er en av de ledende dødsårsakene i verden. Nåværende terapeutiske strategier er hovedsakelig utviklet i 2D kultur-systemer, som er mangelfullt gjenspeiler fysiologiske forhold i vivo. Biologiske 3D matriser gir celler et miljø der celler kan selv-ordne, slik at undersøkelse av vev organisasjon og celledifferensiering. Slike stillasene kan bli seedet med en blanding av ulike celletyper å studere direkte 3D-celle-celle-interaksjoner. Å etterligne 3D kompleksiteten av kreftsvulster, har vår gruppe utviklet en 3D in vitro svulst testsystem. Våre 3D vevsprøve systemmodeller in vivo situasjonen for ondartet perifere nerve slire svulster (MPNSTs), som vi etablerte med vår decellularized svin jejunal segment avledet biologisk vaskularisert stillas (BioVaSc). I vår modell, reseeded vi en modifisert BioVaSc matrise med primære fibroblaster, mikrovaskulære endotelceller (mvECs) og S462 tumor-cellelinjen. For statisk kultur, er den vaskulære strukturen av BioVaSc fjernet og den gjenværende stillaset skjæres åpent på den ene side (Small Intestinal submucosa SIS-MUC). Den resulterende matriks blir deretter fast mellom to metallringer (celle kroner). Et annet alternativ er å kultur cellen-seeded SIS-Muc i en flyt bioreaktor system som eksponerer cellene til å skjære stress. Her blir bioreaktor koblet til en peristaltisk pumpe i et selv konstruert inkubator. En datamaskin regulerer arterielle oksygen og næringstilførsel via parametre slik som blodtrykket, temperatur og strømningshastighet. Dette oppsettet gir en dynamisk kultur med enten trykkregulerte pulsatile eller konstant flyt. I denne studien, kunne vi med hell etablere både en statisk og dynamisk 3D kultur system for MPNSTs. Evnen til å modellere kreftsvulster i en mer naturlig 3D-miljø vil gjøre oppdagelsen, testing, og validering avfremtidige legemidler i en menneskelignende modell.

Som vist i figur 1B, decellularized vi den porcine jejunal segment (ca. 2 m i lengde og 20 mm i diameter) med konserverte rørformede strukturer av den kapillære nettverk. Etter kjemisk, enzymatisk og mekanisk decellularization, erholdt vi et collagen I / III stillas, som kan benyttes for 3D-cellekultur. En Feulgen test ble utført for å demonstrere renhet (uten DNA-rester) av matrisen (data ikke vist). Figurene 2A og 2B viser den statiske kultur SIS-MUC sikret ved cellekroner. Vi fikset SIS-Muc i en in-house designet bioreaktor (figur 2C) for dynamisk kultur. Figur 2D illustrerer simulert dynamisk strømning gjennom kammeret av bioreaktoren. Den bioreaktor er plassert i en selv konstruert inkubator system og forbundet med en peristaltisk pumpe. Dette oppsettet gir en dynamisk kultur med enten trykkregulering av pulserende strømning eller c<html> ONSTANT flyt. Figur 3 gir en oversikt over den statisk kultivert S462 tumor cellelinje i 2D monokultur (figur 3A) og i 3D coculture (Tall 3B-3D). Figur 3B viser trippel kultur av kreftceller S462 og primær fibroblaster på den apikale siden av SIS -Muc (tidligere indre lumen side) og mvEC på basolateral side (tidligere serosa side). Identifiseringen av forskjellige celletyper er mulig ved farging celletypespesifikke markører, slik som von Willebrand faktor til å merke mvEC (figur 3C). De p53-positive S462-celler kan skilles fra den p53-negative primære fibroblaster (fig. 3D) og 3D-fordelingen av celler kan bli analysert. Figur 4 viser stainings tilsvarende til figur 3 av den dynamisk kultivert trippel kultur. <html> 0460/50460fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1. Decellularization set-up. (A) bioreaktor og pumpe oppsett for decellularizing den BioVaSc, overvåket av en PC. (B) Decellularized BioVaSc i glass tank. Den lumen og den arterielle innløp er forbundet til adaptere. . <img alt="Fig. 2" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig2.jpg" /> Figur 2. Over lys av de ulike kultur set-ups. (A) CAD snittriss av statisk kultur-system i mikrotiter-brønn plate, (B) metallinnlegg for statisk kultur, (C) medium strømningssimulering (hastighetsfelt [m / sek]) for dynamisk kultur av den øvre lokk av strømnings bioreaktor , (D) flyt bioreaktor for dynamisk kultur som er koblet til den peristaltiske pumpen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 3" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig3highres.jpg" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig3.jpg" /> Figur 3. Oversikt over immunohistological karakterisering av den statiske 3D-tumormodellen. (A) Hematoxylin flekk av den statisk cultured 2D monokultur av S462 celler i et Permanox lysbilde, (B) H &amp; E flekk av den statisk cultured 3D trippel kultur, piler markerer endotelceller, (C) immunohistological farging for von Willebrand-faktor, (D ) immunohistological farging for p53. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> <img alt="Figur 4" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig4highres.jpg" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig4.jpg" /> <strong&gt; Figur 4. Oversikt over immunohistological karakterisering av den dynamiske 3D-tumormodellen. (A) H &amp; E flekken av dynamisk kultivert 3D trippel kultur, piler markere endotelceller, (B) immunohistological farging for von Willebrand faktor, (C) immunohistological farging for p53. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a>

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System at JoVE.com

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Metoder for å lage humane 3D tumorvev som testsystemer er beskrevet. Disse teknologier er basert på et biologisk decellularized vaskularisert Stillas (BioVaSc), primære humane celler, og en tumorcellelinje som kan dyrkes i henhold til statiske så vel som under dynamiske forhold i en strømnings bioreaktor.

Tissue Engineering av en menneskelig 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Tissue Engineering: Bygging av en Flercellede 3D Stillas for levering av Lagdelte Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

Tissue Engineering av Tumor stromal mikromiljøet med Søknad til Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Kirurgisk henting, isolasjon og<em&gt; In vitro</em&gt; Utvidelse av Menneskelig Fremre korsbånd-deriverte celler for tissue engineering applikasjoner

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produksjon, karakterisering og potensielle bruk av en 3D Tissue-konstruert Menneskelig Esophageal slimhinnene Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingeniør 3D Cellularized Kollagen Geleer til Vaskulær Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øyeirritasjonstest (EIT) for fareidentifikasjon for Eye irriterende kjemikalier som bruker Rekonstruert Menneskelig Hornhinnen lignende Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

En Kombinert 3D Tissue Konstruert<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; I Silico</em&gt; Lung Tumor modell for å forutsi Drug Effective i Spesifikke mutasjons bakgrunner

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering ved Intrinsic vaskularisering i en<em&gt; I Vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting brusk og huden vev Analogs utnytte en roman passiv miksing enhet teknikk for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

Tvinge System med vertikale V-svinger: en 3D In Vitro vurdering av elastisk og stive rektangulære Archwires

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...