Name: tissue engineering of a human 3d in vitro tumor test system
Uploaded: 2013-08-06T08:56:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System at JoVE.com

Författarna vill tacka Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) för sin tekniska support för att utveckla bioreaktorer och bioreaktor inkubatorn.

1. Decellularisering av BioVaSc <ol><li> Skölj kärlsystemet hos svin jejunal segmentet via kanyle arteriell tillgång och tarmlumen med PBS -. Upprepa tills den är helt ren. </li><li> Förbered en 200 mm diameter glastank med 4 adaptrar och ansluta dem via silikonrören till den peristaltiska pumpen (Ismatec). Trycket styrenhet kan övervakas via en trycksensor som är ansluten till en steril engångs kupol (se figur 1). </li><li> Fyll reservoarflaskor med decellularization (DZ) lösning och kontrollera rörsystemet för eventuella luftbubblor. </li><li> Anslut intestinala lumen med buntband glas kontakter för luminala flödet. Pump 500 ml DZ-lösning i den röda artären (Figur 1B) i kärlsystemet. Bryt pumpprocessen var 15 min inom kort att manuellt trycka ut hela tarmlumen. </li><li> Under decellularizatiom processen bör trycket hos buffertlösningen är mellan 80 - 100 mm Hg, modellerad efter den naturliga blodtrycket. </li><li> Tvätta BioVaSc med PBS - tills den är fri från cellrester (&quot;helt vit&quot;). </li><li> Fyll BioVaSc fullständigt med DZ lösning och inkubera det nedsänkas i DZ lösningen över natt vid 4 ° C på rocking shaker. </li><li> Upprepa steg 1.6. </li><li> Placera BioVaSc i DNas-lösning och inkubera över natten vid 4 ° C på rocking shaker. </li><li> Ta DNas lösning och skölj med tvättbuffert. </li><li> γ-sterilisering med 25 kGy </li></ol> 2. De olika celltyper 2,1 Isolering av primära humana dermala mikrovaskulära endotelceller (mvECs) och fibroblaster <ol><li> Skär hudbiopsi (helst preputium) i strimlor av 2-3 mm bredd med skalpell och skölj dem 3x med PBS - lösning. </li><li> Täck vävnaden med Dispase lösning och inkubera den för 16-18 h vid 4 ° C. </li><li> Separata epidermis från dermis med 2 pincetter och överföra både separat i petriskålar fyllda med PBS +. </li><li> Skölj dermis remsor 1x med Versene. </li><li> Tillsätt 10 ml trypsin / EDTA-lösning till dermis remsor och inkubera den i inkubatorn under 40 min. </li><li> Stoppa enzymreaktionen omedelbart med 1% FCS. </li><li> Överför hud remsor till en petriskål fylld med VascuLife och skrapa ut varje remsa med skalpellen 8x varje sida, lägga lite tryck. </li><li> Överför producerade cellsuspension genom en cell sil till ett centrifugrör och skölj cell sil 3x med VascuLife. </li><li> Centrifugera röret vid 1200 xg under 5 minuter och resuspendera cellpelleten med VascuLife. </li><li> För att isolera fibroblaster, chop dermis remsor i små bitar med hjälp av skalpell. </li><li> Tillsätt 10 ml kollagenas lösning på dermis bitar. </li><li> Inkubera den för 45 min i inkubatorn, centrifugera sedan den och ta bort försiktigt supernatant. </li><li> Tvätta pellets 1x med DMEM + 10% FCS +% PenStrep, centrifugera den och försiktigt bort supernatanten. </li><li> Suspendera pelleten i odlingsmedium och överföra den till en T75 odlingskolv för att låta cellerna växa ur vävnaden. </li></ol> 2,2 tumörcellinje S462 Den tumörcellinje S462 (vänligen tillhandahållen av Dr Nikola Holtkamp, ​​Charité University Medicine Berlin) genererades från en malign perifer nerv slida tumör i en kvinnlig patient med ärftligt tumör predisposition syndrom neurofibromatos typ 1 9. S462 odlas i DMEM kompletterat med 10% FCS. Medium måste bytas var 2 - 3 dagar. En gång i veckan cellerna behöva delas. 3. Tumör Test System: Statiska Kultur Villkor Jämfört med Dynamic Kultur I bioreaktorsystem <ol><li> Skär den rörformiga SIS-Muc öppna på ena sidan och fixa det mellan två metallringar (cell kronor, 10 mm diameter, själv constructed). Täck SIS-Muc i cellodlingsmedium över natten. </li><li> Seed isolerade celler i definierade cell nummer (se nedan) på en eller båda sidor av SIS (mono-eller co-kultur set-up). <ol><li> Seed 8000 celler / cm 2 av primära mvECs i en total volym av 100 jil på den basolaterala ytan av SIS (fd serosa). 3 h senare fylla brunnen med mediet för att säkerställa en nedsänkt kultur. </li><li> Tillåt endotelceller vidhäfta under 3 dagar. Vänd på statiska kultursystemet 180 ° och överföra den till en 12-brunnar. </li><li> Seed en blandning av primära dermala fibroblaster (8000 celler / cm 2) och tumörceller (15.000 celler / cm 2) i en total volym av 500 jil på den apikala ytan av SIS (vid sidan av de tidigare lumen). </li><li> Låt cellerna vidhäfta under 3 h och fylla brunnen med medium (nedsänkt kultur, medium: 50% Vasculife + 50% DMEM kompletterat med 10% FCS). </li><li> Tumören testsystem odlas under statiska förhållanden at 37 ° C, 5% CO2 i inkubatorn i ytterligare 14 dagar. Byt odlingsmedium var 2 - 3 dagar. </li></ol></li><li> För den dynamiska kulturen, fixa SIS-Muc mellan två metallringar och utsäde primära mvECs enligt 3.2.1. Efter 3 dagar bort SIS-Muc från metallringar och sätt membranet in reaktorn flödet (se figur 2C och 2D). Applicera den primära dermala fibroblaster och tumörceller med en spruta och kanyl på matrisen i bioreaktorn, och låta cellerna vidhäfta under 3 h före fyllning bioreaktorn systemet med odlingsmedium. </li><li> På följande dag dynamiska odlingsbetingelser med konstant medelflöde (3,8 ml / min, 37 ° C och 5% CO 2) kan initieras. Den dynamiska kulturen upprätthålles under 14 dagar, odlingsmedium byts efter 7 dagar. </li><li> Den dynamiska provningen setup är odlas i egentillverkade inkubator som ger medierna passerar genom en pump och den nödvändiga temperaturen och CO2 </sub&gt; Innehåll. </li></ol> 4. Karakteriseringsmetoder för analys 4.1 Fastställande och paraffin-inbäddning av den seedade kollagenmatrisen <ol><li> För (immuno-) histologiska karakteriseringar avlägsna odlingsmediet och fixera vävnaden med 4% paraformaldehyd under 2 timmar. </li><li> Ta bort 4% paraformaldehyd och överföra SIS från metallinsatsen till en vävnad bädda kassett. Vattna vävnaden för att ta bort kvarvarande fixativ och torka för paraffin infiltration. </li><li> Innan du bädda in ett paraffin-block, skär SIS i 2 - 3 skivor och placera dem i en paraffinfyllda metallbasen mögel så att snittytorna vända nedåt. Lägg vävnadskassett ovanpå gjutformen som en uppbackning. </li><li> Skär 5 ìm skivor och flyta dem på en 40 ° C vattenbad för riktning, sedan montera diabilder på lämpliga glasskivor. Obestruket diabilder används för H &amp; E fläckar, polylysin belagda bilder för immunhistologisk färgning för att förbättra infästning.Låt skivorna torka ordentligt. </li><li> Smält paraffin, ta bort den med xylen och rehydrera skivor för efter färgning. </li></ol> 4,2 Färgnings <ol><li> De rehydrerade skivor kan färgas med hematoxylin / eosin som en standardiserad överblick färgning. </li><li> För immunhistological färgning, den fasta och paraffin infiltrerat vävnadsskivor måste genomgå en antigenåtervinning för att låta antikroppar att känna igen och binda till deras specifika epitoper. Därför avparaffineras och rehydrerade glasen placeras i en ångkokare med uppvärmd citratbuffert (pH 6,0) under 20 min. </li><li> Överför bilder till tvättbuffert (0,5 M TBS buffert + 0,5% Tween) och cirkelskivor med en PAP penna för att minimera den nödvändiga volymen för färglösningar. </li><li> Placera objektglaset i en fuktkammare. För att säkra en specifik pepparrotsperoxidas-medierad visualisering av antigen-antikropp-bindning, måste endogent peroxidas vara mättad med 3% väteperoxid. </li><li> Primär antibODY utspädningar appliceras på segment, inkuberades under 1 h vid RT och omsorgsfullt tvättas bort med tvättbuffert. </li><li> För detektion av specifika antigen-antikroppsbind Ultra Vision Quanto Detection System HRP DAB (Thermo Scientific) används i enlighet med den rekommenderade protokoll. </li><li> Kärnorna motfärgades med hematoxylin under 1 min. </li><li> Objektglasen monteras med ett vattenhaltigt medium, torkas och avbildades med användning av en invers mikroskop. </li></ol>

<ol>
	<li>Schenke-Layland, K., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+tissue+models--moving+towards+personalized+regenerative+medicine.">In vitro human tissue models--moving towards personalized regenerative medicine.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 63, 195-196 (2011).</li><li>Pusch, J., Votteler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+performance+of+a+three-dimensional+model+that+mimics+the+microenvironment+of+the+small+intestine.">The physiological performance of a three-dimensional model that mimics the microenvironment of the small intestine.</a> Biomaterials. 32, 7469-7478 (2011).</li><li>Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularised+human+tissue+models:+a+new+approach+for+the+refinement+of+biomedical+research.">Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research.</a> J. Biotechnol. 148, 56-63 (2010).</li><li>Lanza, R., Langer, R., Vacanti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of tissue engineering. , (2007).</li><li>Barron, V., Lyons, E., Stenson-Cox, C., McHugh, P. E., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactors+for+cardiovascular+cell+and+tissue+growth:+a+review.">Bioreactors for cardiovascular cell and tissue growth: a review.</a> Ann. Biomed. Eng. 31, 1017-1030 (2003).</li><li>Martin, I., Wendt, D., Heberer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+bioreactors+in+tissue+engineering.">The role of bioreactors in tissue engineering.</a> Trends Biotechnol. 22, 80-86 (2004).</li><li>Mertsching, H., Walles, T., Hofmann, M., Schanz, J., Knapp, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+vascularized+scaffold+for+artificial+tissue+and+organ+generation.">Engineering of a vascularized scaffold for artificial tissue and organ generation.</a> Biomaterials. 26, 6610-6617 (2005).</li><li>Linke, K., Schanz, J., Hansmann, J., Walles, T., Brunner, H., Mertsching, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+liver-like+tissue+on+a+capillarized+matrix+for+applied+research.">Engineered liver-like tissue on a capillarized matrix for applied research.</a> Tissue Eng. 13, 2699-2707 (2007).</li><li>Holtkamp, N., Atallah, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP-13+and+p53+in+the+progression+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors.">MMP-13 and p53 in the progression of malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Neoplasia. 9, 671-677 (2007).</li><li>Weaver, V. M., Petersen, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Hutmacher, D. W., Horch, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+tissue+engineering+technology+platforms+into+cancer+research.">Translating tissue engineering technology platforms into cancer research.</a> J. Cell. Mol. Med. 13, 1417-1427 (2009).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Yang, S. -. T., Zhang, X., Wen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbioreactors+for+high-throughput+cytotoxicity+assays.">Microbioreactors for high-throughput cytotoxicity assays.</a> Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 11, 111-127 (2008).</li><li>Schultheiss, D., Gabouev, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+vascularized+matrix+for+bladder+tissue+engineering:+matrix+preparation,+reseeding+technique+and+short-term+implantation+in+a+porcine+model.">Biological vascularized matrix for bladder tissue engineering: matrix preparation, reseeding technique and short-term implantation in a porcine model.</a> J. Urol. 173, 276-280 (2005).</li></ol>

Författarna har ingenting att lämna ut.

<html> Vid en jämförelse mellan 2D och 3D kultursystem som tumörforskning, 3D-system, trots att de dyrare metod, har visat att efterlikna förhållandena i biologiska mikromiljöer bättre. Det kunde visas att vissa tumörceller växer mycket långsammare i en 3D-kultur än i en vanlig 2D-kultur 12, vilket är i överensstämmelse med situationen i en riktig tumör. Bissell och medarbetare visade i sitt arbete att beteendet hos cancerframkallande bröstceller speglar situationen in vivo, inklusive cell morfologi och signalering, mer exakt när en 3D-kultur inom en matris erbjuder cell-ECM-interaktioner. Vidare betonade de vikten av den extracellulära miljön i 3D genom att visa att förändringar i miljö interaktioner ledde till återgång av de maligna cellerna till en normal fenotyp. Dessutom, och viktigast av allt, kan dessa resultat också bekräftas i in vivo djurmodeller 10,11. ontent &quot;&gt; Den direkt jämförelse av in vivo djurförsök och in vitro-vävnadsmodeller avslöjar för-och nackdelar i båda systemen. En fördel med in vitro-modeller är det tillstånd av en mycket bättre realtid eller fast avbildning av mikroskopi. En begränsning är att de härmar statisk eller kortsiktiga förhållanden, medan in vivo-system utvecklas ofta. Den nuvarande bristen på kärlsystemet och normal transport av små molekyler, värd immunsvar, och andra cell-cell interaktioner är ytterligare nackdelar med in vitro-modeller 12. Därför 3D in vitro-system som presenteras i denna studie ger ett lovande komplement till djurförsök. De ger en bättre jämförbarhet för den mänskliga organismen och därmed minimera experimentella feltolkningar. Biomimetic in vivo modellsystem kommer därmed att bli mer relevant att studera hur cancer och metastasering är beroende på microenvironmental betingelser som reglerar tumorigenesis 11. Vår studie visar att 3D-miljön som tillhandahålls av SIS-Muc leder till en tumörliknande vävnadsbildning av celler, som inte observerats i den vanliga 2D cellkultur (se figur 3A). Dessutom är användningen av primära celler från tumörbiopsier ett mycket viktigt steg mot personlig medicin, en disciplin som syftar till att identifiera den bästa behandlingen beroende på patientens individuella behov. Införliva primära patientspecifika tumörceller isolerade från biopsimaterial kommer att tillåta in vitro testning av terapeutiska strategier. Sådana testsystem kommer att göra det möjligt att undersöka olika läkemedel och kombinationer därav i en tids-och kostnadsbesparande high-throughput screening. Dessutom är det viktigt för den individanpassade strategin integrationen av tumörassocierade stromala celler, såsom visas i denna studie, eftersom en tumörs microenvironment influenser tumörprogression 13 och kan visa sig som suitable terapeutiskt mål. Alternativt till ett personligt förhållningssätt kan vårt tumörmodellen modifieras för att tjäna som en generaliserad tumör testsystem genom införlivandet av etablerade tumörogena cellinjer. Detta är ett lovande anpassning för grundläggande forskning. För både drogtestning närmar närvaro av en vaskulär struktur krävs för att testa fördelning och upptagning av terapeutiska ämnen. SIS-Muc matris gör det basolaterala sådd med primär MVEC för barriärupptagsstudier kommer omläggning av de bevarade kärlstrukturer BioVaSc ytterligare förbättra studie av läkemedelstillförsel. För att skapa vävnadsmodeller, kan en 3D-biologiskt nedbrytbar matris användas som ram för en co-kultur av olika celltyper 14. Användningen av sådana 3D-matriser begränsas ofta av brist på en fungerande vaskularisering. Detta problem kan lösas genom användning av BioVaSc, som erbjuder bevarade blodkärl structures som kan reseeded med endotelceller. Vidare BioVaSc ger extracellulära komponenter, som säkerställer vidhäftningen av cellerna och underlättar vävnadsdifferentiering. Det möjliggör också lång tid vävnadsspecifik funktion bioartificial 3D vävnader 7,8,15. Förutsättningen för konstruktion av funktionella kärl substitut är imitera mänskliga fysiologiska och biomekaniska förhållanden. Därför bioreaktor system, som kan genomföra dessa krav in vitro, är av yttersta intresse för att skapa biologisk tumörmodeller. Kombinationen av BioVaSc är bioreaktorn tekniken och co-odling av olika celltyper en mycket lovande metod för att generera vaskulariserade tumörvävnader, vilket gör att studier av mekanismer som är relevanta för cancerfort såsom angiogenes och metastas. Vi ser sådana tumörmodeller som en lovande strategi för att komplettera djurstudier genom att tillhandahålla en likvärdigtill den humana tumör physiology.

Nya läkemedel måste valideras i fråga om kvalitet, säkerhet och effektivitet före marknadsgodkännande. Hittills djurförsök är standardmetoden för drogtester och validering. Men på grund av artspecifika skillnader, djurförsök ofta inte uttömmande utvärdera effekten av de föreningar i människor 1. Av denna anledning är det viktigt att generera humana vävnadsmodeller som kan användas för in vitro-test av nya läkemedel och ämnen. En av tyngdpunkterna i vår grupp är att skapa in vitro-testmodeller med vår biologiska vaskulariserad byggnadsställning (BioVaSc) 2,3. Den BioVaSc kan användas som ett statiskt eller dynamiskt 3D-matrissystem. För statisk kultur, är det decellularized svin jejunal segmentet (Small Intestinal submucosa SIS-MUC) placeras i ett metallinlägg för cell omläggning. Olika celler, såsom cancer och endotelialceller kan odlas på ställningen. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; För dynamiska kultur är BioVaSc fäst till en bioreaktor som applicerar flöde genom hela kärlsystemet eller över ytan av ställningen. Aktuella bioreaktorer genomföra biologiska, mekaniska eller elektriska stimuli som verkar på differentiering eller proliferation av celler 4. För bioreaktorer inom området vävnadsteknik, är det grundläggande konceptet för att simulera betingelserna i den mänskliga kroppen. Vari, celler tillhandahålls en fysisk miljö i vilken de kan interagera med varandra och deras omgivande extracellulära matrisen. För framställning av in vitro-testsystem eller transplantationer, är förmågan att efterlikna den naturliga miljön i celler med en lämplig bärare struktur och bioreaktorsystem kritisk 5. Därför måste mer komplexa och tekniskt krävande enheter utvecklas för att fullgöra dessa uppgifter 6. Det är vidare möjligt att använda vår byggställning för establishment av en vaskulariserad modell på grund av den konserverade rörformiga strukturer, vilka innefattar matning artär, ven, och den förbindande kapillära bädden. Alla svin celler måste avlägsnas genom kemisk, mekanisk och enzymatisk decellularisering, och skelettet gammasteriliserade. De återställda rörformiga vaskulära strukturer kan därefter reseeded med humana mikrovaskulära endotelceller genom att använda en återcirkulations perfusionsbioreaktor 7, som härmar de biomekaniska och / eller biokemiska parametrar såsom pH, temperatur, tryck, tillförsel av näringsämnen och avlägsnande av avfall 6. Den återendotelisation av rörformiga strukturer skapar en människa blodkärl motsvarande inom den kollagen schavotten 3,7. I nästa steg, kan ytan av de tidigare lumen (mucosa) seedas med primära humana celler för att etablera co-kulturer 3,7,8. I denna studie en 3D-tumör testsystem är inrättat genom samtidig odling av en tumör cellinje med primär stRomal celler under statiska och dynamiska förhållanden på SIS-Muc.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase solution</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>17454</td>
			<td>(500 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>(2.0 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high-glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>G0001,3010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DZ solution</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3484.2</td>
			<td>34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td>
			<td>DCS</td>
			<td>PD000KIT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical pressure transducer</td>
			<td>MEMSCAP</td>
			<td>SP844</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>M0616</td>
			<td>Clone F8/86 0.12 &mu;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-human p53</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>IS616</td>
			<td>Clone DO-7 ready-to-use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile disposable dome</td>
			<td>MEMSCAP</td>
			<td>844-28</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA solution</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-003</td>
			<td>0,05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife (VEGF-Mv)</td>
			<td>Lifeline</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-033</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue engineering of a human 3d in vitro tumor test system

Cancer är en av de vanligaste dödsorsakerna i världen. Aktuella terapeutiska strategier är främst utvecklad i 2D kultursystem, som otillräckligt speglar fysiologiska förhållanden in vivo. Biologiska 3D matriser ger cellerna en miljö där celler kan självorganisation, vilket gör studiet av vävnad organisation och celldifferentiering. Sådana ställningar kan ympas med en blandning av olika celltyper att studera direkta 3D cell-cell-interaktioner. För att efterlikna 3D komplicerade cancertumörer, har vår grupp utvecklat en 3D in vitro tumör testsystem. Våra 3D vävnadsprov systemmodeller situationen för maligna perifera nerv slida tumörer (MPNSTs), som vi etablerade med vår decellularized svin jejunal segment härrör biologisk vaskulariserad byggnadsställning (BioVaSc) in vivo. I vår modell, reseeded vi en modifierad BioVaSc matris med primära fibroblaster, mikrovaskulära endotelceller (mvECs) och S462 tumörcellinje. För statisk kultur, är kärlstruktur BioVaSc bort och resterande schavotten skärs öppen på ena sidan (Small Intestinal submucosa SIS-MUC). Den resulterande matrisen sedan fast mellan två metallringar (cell kronor). Ett annat alternativ är att odla cellsådd SIS-Muc i en flödes bioreaktorsystem som exponerar cellerna för skjuvspänning. Här är bioreaktorn ansluten till en peristaltisk pump i egentillverkade inkubator. En dator reglerar arteriell syre-och näringstillförsel via parametrar såsom blodtryck, temperatur och flödeshastighet. Denna inställning gör det möjligt för en dynamisk kultur med antingen tryckreglerad pulserande eller konstant flöde. I denna studie kunde vi framgångsrikt etablera både en statisk och dynamisk 3D-odlingssystem för MPNSTs. Möjligheten att modellera cancertumörer på ett mer naturligt 3D-miljö kommer att möjliggöra upptäckten, testning och validering avframtida läkemedel i en människoliknande modell.

Såsom visas i figur 1B, decellulariseras vi den porcina jejunala segment (ca 2 m i längd och 20 mm i diameter) med bevarade rörformiga strukturer av det kapillära nätverket. Efter kemisk, enzymatisk och mekanisk decellularisering erhöll vi en kollagen I / III scaffold, som kan användas för 3D-cellkultur. En Feulgen-test utfördes för att påvisa renheten (ingen DNA-rester) hos matrisen (data visas ej). Figurerna 2A och 2B visar statisk kultur av SIS-Muc säkras av cellkronor. Vi fixade SIS-Muc i en in-house designad bioreaktor (figur 2C) för dynamisk kultur. Figur 2D visar den simulerade dynamiska flöde genom kammaren i bioreaktorn. Bioreaktorn placeras i en egen konstruerad inkubatorsystemet och ansluten med en peristaltisk pump. Denna inställning gör att en dynamisk kultur med antingen tryckreglerad pulserande flöde eller c<html> onstant flöde. Figur 3 ger en översikt över den statiskt odlad S462 tumörcellinje i 2D monokultur (figur 3A) och i 3D samodling (Figurerna 3B-3D). Figur 3B visar trippel kultur av tumörceller S462 och primära fibroblaster på den apikala sidan av SIS -Muc (tidigare inre lumen sidan) och MVEC på basolaterala sidan (tidigare serosa sidan). Identifieringen av olika celltyper är möjlig genom färgning av celltyp specifika markörer, såsom von Willebrand-faktor för att märka MVEC (Figur 3C). P53-positiva S462-celler kan skiljas från de p53-negativa primära fibroblaster (figur 3D) och 3D-fördelning av celler kan analyseras Figur 4 visar färgningar motsvarande fig. 3 av den dynamiskt odlades trippel kultur.. <html> 0460/50460fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1. Decellularization set-up. (A) Bioreaktor och pump installation för decellularizing den BioVaSc, övervakas av en dator. (B) decellularized BioVaSc i glasbehållaren. Lumen och artär inlopp är anslutna till de adaptrar. . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig2.jpg" /> Figur 2. Överblick av de olika kultur uppställningar. (A) CAD tvärsnittsvy av statisk odling system mikrotiterbrunn platta, (B) metallskär för statisk odling, (C) medelflödessimulering (hastighetsområdet [m / sek]) för dynamisk kultur av det övre ögonlocket hos flödes bioreaktor , (D) flödes bioreaktor för dynamisk kultur som är ansluten till den peristaltiska pumpen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; alltid &quot;&gt; <img alt="Figur 3" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig3highres.jpg" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig3.jpg" /> Figur 3. Översikt över immunhistologisk karakterisering av den statiska 3D-tumörmodell. (A) Hematoxylin fläck av den statiskt odlad 2D monokultur av S462-celler på en Permanox slide, (B) H &amp; E-färgning av den statiskt odlad 3D trippel kultur, Pilarna markerar endotelceller, (C) immunhistologisk färgning för von Willebrands faktor, (D ) immunhistologisk färgning för p53. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> <img alt="Figur 4" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig4highres.jpg" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig4.jpg" /> <strong&gt; Figur 4. Översikt över immunhistologisk karakterisering av den dynamiska 3D tumörmodell. (A) H &amp; E färgning av dynamiskt odlade 3D ​​triple kultur, pilar markerar endotelceller, (B) immunhistologisk färgning för von Willebrands faktor, (C) immunhistologisk färgning för p53. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a>

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System at JoVE.com

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Metoder för att skapa mänskliga 3D-tumörvävnad som testsystem beskrivs. Dessa tekniker är baserade på en decellulariserad Biologisk vaskulariserad Ställning (BioVaSc), primära humana celler och en tumörcell-linjen, som kan odlas under statiska såväl som under dynamiska förhållanden i ett flöde bioreaktorn.

Tissue Engineering av en Human 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumör Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Tissue Engineering: Konstruktion av en flercellig 3D Scaffold för Leverans av Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

Tissue Engineering av tumör Stromal mikromiljö med Ansökan till Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Kirurgisk Retrieval, isolering och<em&gt; In vitro</em&gt; Utbyggnad av mänskliga Främre korsband-härledda celler för Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produktion, karakterisering och potentiella användningsområdena för en 3D vävnadstekniska Human Esophageal Mucosal Modell

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingenjörs 3D Cellularized kollagengeler för kärlvävnad Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Ögonirritationstest (EIT) för Hazard Identifiering av Eye irriterande kemikalier med hjälp av rekonstruerad Human Cornea liknande Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

En kombinerad 3D vävnadstekniska<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In silico</em&gt; Lungtumör modell för att förutsäga läkemedelseffektivitet i specifika Mutations bakgrunder

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering av Intrinsic Vascularization i en<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Engineering avdelningen

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting av brosk och hud vävnad analoger utnyttja en roman passiv enhet blandningsteknik för Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

Tvinga systemet med vertikala V-böjar: en 3D In Vitro -bedömning av elastiska och styva rektangulära Archwires

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...