Name: transplantation into the anterior chamber of the eye for longitudinal, non-invasive in vivo imaging with single-cell resolution in real-time
Uploaded: 2013-03-10T14:00:00
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Reconhecemos os drs. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, Stephan Speier e Daniel Nyqvist para discussões frutíferas. Agradecemos também Eleut Hernandez e Diego Espinosa-Heidmann para assistência técnica, e Mike Valdes e Margaret Formoso ajuda com gravação de vídeo. Byron Maldonado gravados, editados e produziu o vídeo final. Apoio à pesquisa foi fornecido pelo Instituto de Pesquisa do Diabetes Foundation ( <a href="http://www.DiabetesResearch.org" target="_blank">www.DiabetesResearch.org</a> ), o NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 a MHA; NIH RO3DK075487 a AC; U01DK089538 para PO.B.). Apoio à pesquisa adicional para PO.B foi fornecido através de fundos do Karolinska Institutet, da Suécia Research Council, a Fundação Diabetes sueca, a Família Erling Persson-Fundação, a Família Knut e Alice Wallenberg Foundation, a Skandia Insurance Company Ltd., VIBRANTE ( FP7-228933-2), Programa de Pesquisa Estratégica em Diabetes no Karolinska Institutet, a Novo Nordisk Foundation e Fundação Berth von Kantzow de.

O procedimento seguinte é realizado sob a estereoscópio em 2 passos, o primeiro passo envolve o carregamento das ilhotas para dentro da cânula e a segunda etapa é o transplante de real no ACE. Todos os procedimentos realizados em animais foram aprovados pelo cuidado com os animais institucional e comissão de uso (IACUC), da Universidade de Miami. 1. Ilhotas de carga em cânula para Transplante <ol><li> Centro das ilhotas no prato de cultura girando o prato em círculos mais estreitos....

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	<li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem. Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).</li><li>Leibiger, I. B., Caicedo, A., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+?-cell+function+and+survival+-+a+perspective.">Non-invasive in vivo imaging of pancreatic ?-cell function and survival - a perspective.</a> Acta Physiol. 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D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choreography+of+cell+motility+and+interaction+dynamics+imaged+by+two-photon+microscopy+in+lymphoid+organs.">Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).</li><li>Khorshidi, M. A., Vanherberghen, B., Kowalewski, J. M., Garrod, K. R., Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transient+migration+behavior+of+natural+killer+cells+imaged+in+situ+and+in+vitro.">Analysis of transient migration behavior of natural killer cells imaged in situ and in vitro.</a> Integr. Biol. (Camb). 3 (7), 770-778 (2011).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. 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Protoc. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Falck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site+of+production+of+oestrogen+in+the+ovary+of+the+rat.">Site of production of oestrogen in the ovary of the rat.</a> Nature. 184, 1082 (1959).</li><li>Bickford-Wimer, P., Granholm, A. C., Bygdeman, M., Hoffer, B., Olson, L., Seiger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+cerebellar+and+cortical+tissue+transplanted+to+the+anterior+eye+chamber+of+athymic+rats:+electrophysiological+and+structural+studies.">Human fetal cerebellar and cortical tissue transplanted to the anterior eye chamber of athymic rats: electrophysiological and structural studies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (16), 5957-5961 (1987).</li><li>Adeghate, E., Donath, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+findings+in+long-term+pancreatic+tissue+transplants+in+the+anterior+eye+chamber+of+rats.">Morphological findings in long-term pancreatic tissue transplants in the anterior eye chamber of rats.</a> Pancreas. 5 (3), 298-305 (1990).</li><li>Abdulreda, M. H., Faleo, G., Molano, R. D., Lopez-Cabezas, M., Molina, J., Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution,+noninvasive+longitudinal+live+imaging+of+immune+responses.">High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).</li><li>Unutmaz, D., Xiang, W., Sunshine, M. J., Campbell, J., Butcher, E., Littman, D. 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D., Berney, T., Cattan, P., Vizzardelli, C., Oliver, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme+oxygenase-1+induction+in+islet+cells+results+in+protection+from+apoptosis+and+improved+in+vivo+function+after+transplantation.">Heme oxygenase-1 induction in islet cells results in protection from apoptosis and improved in vivo function after transplantation.</a> Diabetes. 50 (9), 1983-1991 (2001).</li></ol>

Ilhéus pancreáticos de murino foram isolados usando a digestão com colagenase seguido por purificação em gradiente de densidade, tal como descrito previamente 33. Ilhotas isoladas foram cultivadas durante a noite antes do transplante. Embora isto possa não ser necessário, é recomendado para permitir que as ilhotas para recuperar do procedimento de isolamento. Isto é crítico, quando é realizado o transplante em receptores diabéticos uma vez que irá assegurar o transplante de ilhéus sobreviventes ...

Os avanços na microscopia intravital revelaram fenómenos fisiológicos não preditos por estudos in vitro 1. Isto realça o desafio na tradução resultados obtidos por métodos in vitro convencional para o animal vivo. Na última década, a visualização de tecidos em animais vivos foi consideravelmente melhorada por avanços tecnológicos em modalidades de imagem 2, 3, 4, 5, 6. Isto estimulou a necessidade de abordagens de imagiologia in vivo, com aplicação possível em modelos animais experimentais, para permitir a visualização de tecidos-alvo longitudinal de forma não invasiva. Técnicas de imagem, como ressonância magnética e tomografia por emissão de pósitrons ou bioluminescência permitiram não-invasivas de órgãos / tecidos profundos dentro do corpo 7-8, 9. Mas estas técnicas não podem atingir única célula de resolução devido aos sinais de fundo elevados e de resolução espacial baixa, a despeito do uso of materiais de elevado contraste ou tecido específico 4 luminescência. Esta foi tratada com o advento de dois fotões microscopia de fluorescência confocal 10. Dois fótons de microscopia intravital habilitado estudos de imagem para visualizar e quantificar eventos celulares com detalhes sem precedentes 11, 12. Isto conduziu à caracterização dos principais processos biológicos na saúde e na doença de 13, 14, 15, 16. Embora os estudos de imagem pioneiras intravital têm essencialmente &quot;imitada&quot; em condições in vivo em tecido excisado (por exemplo, nódulos linfáticos), outros estudos usaram abordagens invasivas em tecidos-alvo de imagem expostos in situ 17, 18, ​​19, 20, 21. Outros estudos também têm utilizado &quot;modelos de janelas de câmara&quot; para contornar limitações associadas a abordagens invasivas e resolução de imagem limitada in vivo 22, 23, 24, 25. No modelo de câmara de janela, uma câmara com uma janela transparente é implantado cirurgicamente na pele em difelocais de rendas (pele dorsal ou na orelha, almofada de gordura mamaria, no fígado, etc) no animal (por exemplo, rato, rato, coelho). Enquanto esta abordagem é claramente facilitador de alta resolução em imagiologia in vivo, requer uma cirurgia invasiva para implante da câmara e pode não ser capaz de acomodar os estudos de imagem longitudinais ao longo de semanas ou meses 22. Recentemente, foi demonstrado que a combinação de alta resolução de microscopia confocal com um procedimento minimamente invasivo, isto é, o transplante para a câmara anterior do olho (ACE) fornece uma &quot;janela de corpo natural&quot;, como um. Poderosa e versátil in vivo plataforma de imagem 26, 27 O transplante para o ACE tem sido utilizado nas últimas décadas para estudar aspectos biológicos de uma variedade de tecidos 28, 29, 30, e sua combinação recente com alta resolução de imagem permitiu o estudo da fisiologia das ilhotas pancreáticas, com uma única célula de resolução não- invasiva e longitudinalmente &lt;sup&gt; 26, 27. Esta abordagem foi utilizada para estudar as respostas auto-imunes, durante o desenvolvimento de diabetes do tipo 1 em modelos animais (dados não publicados). Também foi usado para estudar o desenvolvimento do pâncreas, bem como, em estudos de função renal através do transplante de pâncreas em papilas ECA ou individuais nos glomérulos renais, respectivamente (dados não publicados). Um relatório recente usando essa abordagem demonstrou ainda a sua aplicação para estudar as respostas imunes após transplante de ilhotas de pâncreas 31. Importante, este estudo mostrou que o transplante para a câmara anterior do olho fornece uma janela natural do corpo para realizar: (1) longitudinal, de imagem não invasiva de tecidos transplantados in vivo, (2) in vivo cytolabeling para avaliar o fenótipo celular e da viabilidade em situ, (3) acompanhamento em tempo real do infiltrado de células imunitárias no tecido alvo, e (4) a intervenção local por aplicação tópica ou por injecção intraocular. Aqui, nós demonstrate como realizar o transplante para a câmara anterior do olho utilizando ilhotas pancreáticas.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Descrição / Comentários </td></tr><tr><td> IsoTHESIA (isoflurano) </td><td> Buttler Abastecimento Saúde Animal </td><td> 11695-6775-2 </td><td> 99,9% de isoflurano / ml </td></tr><tr><td> Ketaset (ketamina HCL) </td><td> Fort Dodge Animal Health </td><td> 0856-2013-01 </td><td> Anestesia injetável alternativa </td></tr><tr><td> Beprenex (buprenorfina HCL) </td><td> Reckitt Benckiser Saúde (UK) Ltd. </td><td> 12496-075-7-1 </td><td> 0,3 mg / ml </td></tr><tr><td> Eritromicina pomada oftálmica USP, 0,5% </td><td> Akron </td><td> 17478-070-35 </td><td> Aplicada profilaticamente a olho transplantado </td></tr><tr><td> Cloreto de Sódio a 0,9% (Solução salina) </td><td> Hospira Inc. </td><td> 0409-7983-03 </td><td> Para injecção iv. Estéril </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010-023 </td><td> 1X. Estéril </td></tr><tr><td> CMRL médio 1066 </td><td> Cellgro </td><td> 98-304 CV- </td><td> Complementada, modificação CIT. Meios preferidos para ilhotas </td></tr></tbody></table>

transplantation into the anterior chamber of the eye for longitudinal, non-invasive in vivo imaging with single-cell resolution in real-time

Intravital imagem surgiu como uma ferramenta indispensável na pesquisa biológica. No processo, muitas técnicas de imagiologia têm sido desenvolvidos para estudar diferentes processos biológicos em animais não-invasiva. No entanto, uma das principais limitações na técnica existentes modalidades de imagens intravital é a incapacidade de combinar não-invasivos de imagem, com as capacidades longitudinal de uma única célula de resolução. Mostramos aqui como o transplante para a câmara anterior do olho contorna limitação significativa tal que oferece uma plataforma versátil experimental que permite a não-invasivos de imagem, com a resolução longitudinal celular in vivo. Demonstramos o procedimento de transplante em ratinhos e proporcionam resultados representativos utilizando um modelo com relevância clínica, nomeadamente o transplante de ilhéus pancreáticos. Além de permitir a visualização directa de uma variedade de tecidos transplantados para a câmara anterior do olho, esta abordagem fornece uma plataforma para Screedrogas n realizando acompanhamento a longo prazo eo acompanhamento em tecidos-alvo. Devido à sua versatilidade o transplante, o tecido / célula para dentro da câmara anterior do olho, não só as terapias de transplante benefícios, estende-se a outras aplicações in vivo para o estudo de processos fisiológicos e patológicos tais como o cancro e a transdução do sinal ou o desenvolvimento da doença auto-imune.

Existem alguns parâmetros que definem um transplante &quot;bom&quot;. Um transplante é um bom que prossegue sem hemorragia ao fazer a incisão, como pode ser visto no vídeo. Sangramento é impedido / minimizada por penetrar apenas a ponta do bisturi (agulha) para dentro do ACE (figura 3a). Isso também irá ajudar a evitar o contato e punção da íris. Ele também irá garantir uma pequena incisão que vai curar muito bem sem causar nebulosidade da córnea ao longo do tempo (Figura 3c, d).</...

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Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Uma nova abordagem combinando transplantação intra-ocular e microscopia confocal permite longitudinal, não-invasivo de imagem em tempo real, com uma única célula de resolução dentro dos tecidos enxertados<em&gt; In vivo</em&gt;. Demonstramos como transplantar ilhéus pancreáticos para dentro da câmara anterior do olho do rato.

Transplante para a câmara anterior do olho para longitudinal, não-invasivo<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging com uma única célula de resolução em tempo real

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

High-frequency High-resolution Echocardiography: First Evidence on Non-invasive Repeated Measure of Myocardial Strain, Contractility, and Mitral Regurgitation in the Ischemia-reperfused Murine Heart

De alta freqüência Ecocardiografia de alta resolução: primeira evidência de não-invasivos Medida repetida de Strain miocárdico, contratilidade, e regurgitação mitral no coração Isquemia-reperfundidos murino

Ischemia-reperfusion (IR) was surgically performed in murine hearts which were then subjected to repeated imaging to monitor temporal changes in ...

Medicina

Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology

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The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical ...

Non-invasive Imaging of Acute Allograft Rejection after Rat Renal Transplantation Using 18F-FDG PET

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Desenvolvimento de um ambiente de jogo de áudio baseada Virtual para ajudar com habilidades de navegação em Cegos

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Induzida pela quimioterapia Vascular Toxicidade - em tempo real<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de Impairment Vessel

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Avaliação não invasiva da eficácia de novos Therapeutics para Intestinal Patologias Usando imagem endoscópica série da Vivo Ratos

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Encapsulation termogênico pré-adipócitos para transplante em adiposo Depots Tissue

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagens do Cerebrovasculature: Relevância para doenças do SNC

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re-Arterialized transplante de fígado parcial de rato com na vivo orientado a embarcação 70% Hepatectomy

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. ...