Name: an isolated semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium for electrophysiology and high-resolution two-photon microscopy
Uploaded: 2013-06-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy at JoVE.com

Finansieringen af ​​dette arbejde blev leveret af en Garnett Passe og Rodney Williams Memorial Foundation Project tilskud til R. Lim og AJ Camp.

1.. Dyr <ol><li> Mus blev opnået fra den australske Rodent Center (ARC, Perth, Australien) og afholdes på University of Sydney Bosch Animal Facility på en normal 12-timers lys / mørke-cyklus med miljøberigelse. Alle beskrevne eksperimenter blev godkendt af The University of Sydney Animal Ethics Committee. </li><li> Mandlige og kvindelige mus (C57/Bl6) blev anvendt til alle eksperimenter, da denne stamme er almindeligt anvendt som baggrund for genetisk manipulation, og kan betragtes som svarende til vild-type<...

<ol>
	<li>Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otoferlin+is+critical+for+a+highly+sensitive+and+linear+calcium-dependent+exocytosis+at+vestibular+hair+cell+ribbon+synapses.">Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).</li><li>Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+pre-+and+post-synaptic+recording+from+the+peripheral+vestibular+calyx+and+its+included+type+I+hair+cell.">Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell.</a> , (2009).</li><li>Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+dependent+currents+in+type+I+and+II+hair+cell+and+calyx+terminals+of+primary+afferents+in+an+intact+in+vitro+mouse+vestibular+crista+preparation.">Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation.</a> , (2009).</li><li>Chatlani, S., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recordings+from+calyx+endings+in+the+turtle+posterior+crista.">Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista.</a> , (2010).</li><li>Songer, J. E., Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+in+the+mammalian+saccule.">Transduction in the mammalian saccule.</a> , (2010).</li><li>Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vestibular+primary+afferent+activity+in+an+in+vitro+preparation+of+the+mouse+inner+ear.">Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear.</a> J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).</li><li>Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+accumulation+between+type+I+hair+cells+and+calyx+terminals+in+mouse+crista.">Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista.</a> Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).</li><li>Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+synaptic+transmission+differs+in+mouse+type+A+and+B+medial+vestibular+nucleus+neurons+in+vitro.">Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro.</a> J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).</li><li>Camp, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+glycine+receptor+function+reduces+excitability+of+mouse+medial+vestibular+nucleus+neurons.">Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons.</a> Neuroscience. 170, 348-360 (2010).</li><li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina.">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li><li>Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+specificity+in+the+direction-selectivity+circuit+of+the+retina.">Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina.</a> Nature. 471, 183-188 (2011).</li><li>Rennie, K. J., Streeter, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+currents+in+isolated+vestibular+afferent+calyx+terminals.">Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals.</a> J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).</li><li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog,+Rana+catesbeiana.">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li><li>Rennie, K. J., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+currents+in+isolated+vestibular+hair+cells+from+the+guinea-pig+crista+ampullaris.">Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris.</a> Hear. Res. 51, 279-291 (1991).</li></ol>

De mekanismer, der ligger til grund vores følelse af balance har fået begrænset opmærksomhed i sammenligning med andre sansesystemer, fx visuelle og auditive systemer. Af de undersøgelser, der har undersøgt ændringer i vestibulære eller balance funktion, har de fleste fokuseret på adfærdsmæssige foranstaltninger, herunder vestibulo-okulær refleks, med ufuldstændig viden om de grundlæggende byggesten for betalingsbalancestatistik, det vestibulære hårceller selv. Disse undersøgelser, der har konc...

På trods af den betydelige bidrag vestibulære system i vores hverdag, er fortsat en klar forståelse af de processer, der er ansvarlige for det konstaterede fald i vestibulære funktion med alderen undvigende. En af grundene til denne mangel på viden er, at faldet i vestibulære funktion er næsten udelukkende blevet undersøgt ved hjælp af adfærdsmæssige assays, herunder vestibulo-okulære refleks (VOR), en præcis indikator for ydre vestibulære funktion, men giver begrænsede indsigt i de ændringer af interne komponenter . Dette er en væsentlig hindring for vores forståelse af vestibulære hår celle funktion i sundhed, sygdom eller aldring. Mens der har været mange undersøgelser af individuelle vestibulære hårceller, har en stor mangel været afhængighed af akutte hår cellepræparationer, hvor hårceller og endda baegerblade afferente terminaler fjernet fra deres normale miljø via mekanisk og / eller enzymatisk behandling. Sådanne tilgange inevitaligt forstyrre den fine mikroarkitektur mellem hår celle og blomsterbægeret, og hår celle og støtte celle. Med udviklingen af semi-intakte præparater 1-5, og en isoleret mus labyrint forberedelse 6, er der nu en mulighed for at undersøge de forskellige former for synaptisk kommunikation under forhold, som i højere grad ligner dem in vivo. Faktisk viste Lim et al. (2011) markante forskelle i helcelle strømninger optaget fra akut isolerede type I vestibulære hårceller i forhold til dem, der forblev indlejret i neuroepithelium. Specifikt kalium menes at akkumulere i det intercellulære rum mellem håret celle og blomsterbægeret afferent og væsentligt ændre hår celle respons 7.. Denne type oplysninger ville være umuligt at opnå uden den semi-intakte forberedelse af vestibulære sensoriske epithel beskrevet her. Vi viser den semi-intakte forberedelse af muse crista 3, Og viser repræsentative resultater opnået fra helcelle-patch elektrofysiologi, og to-foton calcium imaging.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leibovitz medium L-15</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>L4386-10X1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAPTA-1-oregon green</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>O6806 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereo microscope</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>A60S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Upright microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>BX51WI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Two-photon microscope</td>
 <td>Olympus/La Vision</td>
 <td>BX51WI/ TriMScope II</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont #5 SF Forceps</td>
 <td>FST</td>
 <td>11252-00</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
 <td>FST</td>
 <td>16221-14</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Standard Pattern Scissors</td>
 <td>FST</td>
 <td>14001-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>InstraTECH A-D converter</td>
 <td>HEKA</td>
 <td>ITC-18</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sutter Micromanipulator</td>
 <td>Sutter</td>
 <td>MP-225/M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>multiclamp amplifier</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 <td>700B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data acquisition software (electrophysiology)</td>
 <td>Axograph</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imspector Data acquisition software (two-photon)</td>
 <td>Max Planck innovation</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

an isolated semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium for electrophysiology and high-resolution two-photon microscopy

Forståelse vestibulære hårceller fungerer under normale forhold, eller hvordan traumer, sygdom og aldring forstyrre denne funktion er et afgørende skridt i udviklingen af ​​forebyggende tiltag og / eller nye terapeutiske strategier. Imidlertid har de fleste af undersøgelserne ser på unormal vestibulære funktion ikke været på celleniveau, men primært fokuseret på adfærdsmæssige analyser af vestibulære dysfunktion såsom gangart analyser og vestibulo-okular refleks ydeevne. Mens dette arbejde har givet værdifulde data om, hvad der sker, når tingene går galt, er lidt information udledes om de underliggende årsager til dysfunktion. Af de undersøgelser, der fokuserer på cellulære og subcellulære processer, der ligger til grund for vestibulære funktion, har de fleste påberåbt akut isolerede hårceller, blottet for deres synaptiske forbindelser og støtte celle miljø. Derfor har en stor teknisk udfordring været adgang til de udsøgt følsomme vestibulære hårceller i et prepredelsen, der er mindst forstyrret, fysiologisk. Her viser vi en semi-intakt forberedelse af muse vestibulære sensoriske epithel, der bevarer det lokale mikro-miljø, herunder hår celler / primære afferente komplekser.

De elektrofysiologiske egenskaber af vestibulære hårceller er afhængige af komplekse mikroarkitektur, hvori de er indlejret 7.. Figur 5 viser, at den semi-intakte vestibulære epitel præparat kan anvendes til at skelne mellem type I hårceller (figur 5A), type II hårceller (fig. 5B), og Bægeret primære afferente (5C) baseret på karakteristiske helcelle konduktanser. Disse karakteristika omfatter en udtalt &quot;synke&quot; under depol...

Watch this Scientific Journal Video about An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy at JoVE.com

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Analyse af vestibulære hår celle funktion kompliceres af deres placering dybt inde den sværeste del af kraniet, den petrous tindingebenet. De fleste funktionelle hår celle undersøgelser har brugt akut isolerede hårceller. Her beskriver vi en semi-intakt forberedelse af muse vestibulære epitel for elektrofysiologiske og to-foton mikroskopi studier.

En Isoleret Semi-intakt Forberedelse af Mouse vestibulære Sensory epitel for Elektrofysiologi og høj opløsning To-foton mikroskopi

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging af Mouse Spinal Cord ved hjælp af to-foton mikroskopi

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Tissue Forberedelse og immunfarvning af Mouse sensoriske nervefibre innerverer hud og lemmer Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo to-foton billedbehandling af oplevelsesbaseret afhængige molekylære ændringer i kortikal neuroner

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

En<em&gt; In vitro</em&gt; Udarbejdelse af Isolerede Enteriske neuroner og glia fra plexus myentericus af Voksen Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo to-foton mikroskopi af Single nerveender i hud

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

To-foton<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging af dendritiske spidser i Mouse Cortex Ved hjælp af en tyndere-kranium Forberedelse

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

To-foton Imaging for Cellulær Dynamics i Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Kvantificering af cerebral vaskulær arkitektur ved hjælp af to-foton mikroskopi i en musemodel af HIV-induceret Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog (Rana catesbeiana)

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog Rana catesbeiana

Fysiologisk Udarbejdelse af hårceller fra sacculus i American Bullfrog (<em&gt; Rana catesbeiana</em&gt;)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo To-foton billeddannelse af kortikale neuroner i Neonatal mus

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...