Name: an isolated semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium for electrophysiology and high-resolution two-photon microscopy
Uploaded: 2013-06-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy at JoVE.com

Midler til dette arbeidet ble gitt av en Garnett Passe og Rodney Williams Memorial Foundation Prosjekt tilskudd til R. Lim og AJ Camp.

En. Dyr <ol><li> Mus ble hentet fra den australske gnager Centre (ARC, Perth, Australia) og holdt ved University of Sydney Bosch Dyreavdelingen på en normal 12-timers lys / mørke-syklusen med miljøberikelse. Alle eksperimentene som er beskrevet ble godkjent av The University of Sydney Animal Ethics Committee. </li><li> Mannlige og kvinnelige mus (C57/Bl6) ble brukt for alle eksperimenter siden denne belastningen blir ofte brukt som bakgrunn for genetisk manipulasjon, og kan betraktes som tilsvarer hvete <s...

<ol>
	<li>Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otoferlin+is+critical+for+a+highly+sensitive+and+linear+calcium-dependent+exocytosis+at+vestibular+hair+cell+ribbon+synapses.">Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).</li><li>Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+pre-+and+post-synaptic+recording+from+the+peripheral+vestibular+calyx+and+its+included+type+I+hair+cell.">Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell.</a> , (2009).</li><li>Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+dependent+currents+in+type+I+and+II+hair+cell+and+calyx+terminals+of+primary+afferents+in+an+intact+in+vitro+mouse+vestibular+crista+preparation.">Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation.</a> , (2009).</li><li>Chatlani, S., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recordings+from+calyx+endings+in+the+turtle+posterior+crista.">Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista.</a> , (2010).</li><li>Songer, J. E., Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+in+the+mammalian+saccule.">Transduction in the mammalian saccule.</a> , (2010).</li><li>Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vestibular+primary+afferent+activity+in+an+in+vitro+preparation+of+the+mouse+inner+ear.">Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear.</a> J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).</li><li>Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+accumulation+between+type+I+hair+cells+and+calyx+terminals+in+mouse+crista.">Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista.</a> Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).</li><li>Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+synaptic+transmission+differs+in+mouse+type+A+and+B+medial+vestibular+nucleus+neurons+in+vitro.">Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro.</a> J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).</li><li>Camp, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+glycine+receptor+function+reduces+excitability+of+mouse+medial+vestibular+nucleus+neurons.">Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons.</a> Neuroscience. 170, 348-360 (2010).</li><li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina.">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li><li>Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+specificity+in+the+direction-selectivity+circuit+of+the+retina.">Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina.</a> Nature. 471, 183-188 (2011).</li><li>Rennie, K. J., Streeter, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+currents+in+isolated+vestibular+afferent+calyx+terminals.">Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals.</a> J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).</li><li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog,+Rana+catesbeiana.">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li><li>Rennie, K. J., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+currents+in+isolated+vestibular+hair+cells+from+the+guinea-pig+crista+ampullaris.">Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris.</a> Hear. Res. 51, 279-291 (1991).</li></ol>

Mekanismene bak vår følelse av balanse har fått begrenset oppmerksomhet i forhold til andre sensoriske systemer, for eksempel de visuelle og auditive systemer. Av de studier som har undersøkt endringer i vestibular eller balanse funksjon, har mest fokusert på atferdsmessige tiltak, inkludert vestibulo-okulær refleks, med ufullstendig kunnskap om de grunnleggende byggesteinene i balanse-vestibular hårcellene selv. De studier som har konsentrert seg om hårcellene har nesten alltid gjort det ved hjelp av a...

Til tross for betydelig bidrag til det vestibulære system til vår hverdag, en klar forståelse av prosessene som er ansvarlige for den observerte nedgangen i vestibularfunksjonen med alderen forblir unnvikende. En årsak til denne mangelen på kunnskap er at nedgangen i vestibularfunksjonen har nesten utelukkende blitt utforsket ved hjelp av atferdsmessige analyser, inkludert vestibulo-okulær refleks (VOR), en presis indikator på ytre vestibularfunksjonen, men gir begrenset innsikt i endringene av iboende komponenter . Dette er et stort hinder for vår forståelse av vestibulære hår celle funksjon i helse, sykdom eller aldring. Mens det har vært mange studier av individuelle vestibulære hårcellene, har en stor brist vært avhengigheten av akutte hår celle preparater, hvor hårcellene og selv beger afferente terminaler er fjernet fra deres normale miljø via mekanisk og / eller enzymatisk behandling. Slike tilnærminger inevitaBly forstyrre den delikate mikroarkitektur mellom hårcelle og beger, og hår celle og støtte celle. Med utviklingen av halvt-intakte preparater 1-5, og en isolert mus labyrint fremstilling 6, er det nå en mulighet for å studere de forskjellige former av synaptiske kommunikasjon under betingelser som likner mer på de in vivo. Faktisk viste Lim et al. (2011) markerte forskjeller i hele cellen strømmer opp fra akutt isolert type I vestibulære hårcellene sammenlignet med de som forble innebygd i neuroepithelium. Nærmere bestemt er kalium tenkt å akkumulere i det intercellulære rom, mellom hårcelle og beger afferent, og vesentlig endre hårcelle respons 7.. Denne type informasjon vil være umulig å oppnå uten at det semi-intakt fremstilling av den vestibulære sensorisk epitel beskrevet her. Vi viser den halvt intakt utarbeidelse av musen crista 3, Og viser representative resultatene fra hel-celle patch elektrofysiologi, og to-foton kalsium bildebehandling.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leibovitz medium L-15</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>L4386-10X1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAPTA-1-oregon green</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>O6806 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereo microscope</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>A60S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Upright microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>BX51WI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Two-photon microscope</td>
 <td>Olympus/La Vision</td>
 <td>BX51WI/ TriMScope II</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont #5 SF Forceps</td>
 <td>FST</td>
 <td>11252-00</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
 <td>FST</td>
 <td>16221-14</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Standard Pattern Scissors</td>
 <td>FST</td>
 <td>14001-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>InstraTECH A-D converter</td>
 <td>HEKA</td>
 <td>ITC-18</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sutter Micromanipulator</td>
 <td>Sutter</td>
 <td>MP-225/M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>multiclamp amplifier</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 <td>700B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data acquisition software (electrophysiology)</td>
 <td>Axograph</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imspector Data acquisition software (two-photon)</td>
 <td>Max Planck innovation</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

an isolated semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium for electrophysiology and high-resolution two-photon microscopy

Forstå vestibulære hårcellene fungere under normale forhold, eller hvordan traumer, sykdom og aldring forstyrre denne funksjonen er et viktig steg i utviklingen av forebyggende tilnærminger og / eller nye terapeutiske strategier. Imidlertid har de fleste studier som ser på unormal vestibularfunksjonen ikke vært på cellenivå, men fokusert primært på atferdsmessige analyser av øredysfunksjon som ganglag analyser og vestibulo-okulær refleks ytelse. Mens dette arbeidet har gitt verdifulle data om hva som skjer når ting går galt, er lite informasjon hentet om de underliggende årsakene til dysfunksjon. Av de studier som fokuserer på cellulære og subcellular prosessene som ligger bak vestibularfunksjonen, har mest stolt på akutt isolert hårceller, blottet for sine synaptiske forbindelser og støtte celle miljø. Derfor har en stor teknisk utfordring vært tilgang til de utsøkt sensitive vestibulære hårcellene i en preparation som er minst forstyrret, fysiologisk. Her kan vi demonstrere en semi-intakt utarbeidelse av musen vestibular sensorisk epitel som beholder den lokale mikro-miljøet, inkludert hårcelle / primære afferente komplekser.

De elektrofysiologiske egenskaper av vestibulære hårceller er avhengig av den komplekse microarchitecturen innen hvilken de er integrert 7.. Figur 5 viser at den halv-intakt vestibulære epitel preparatet kan benyttes for å skille mellom type I hårceller (figur 5A), type II hårceller (fig. 5B), og begeret primære afferente (figur 5C) er basert på karakteristika helcelle konduktans. Disse egenskapene inkluderer uttales &quot;sag&quot; u...

Watch this Scientific Journal Video about An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy at JoVE.com

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Analyse av vestibulære hår celle funksjon er komplisert av deres plassering dypt i den vanskeligste delen av skallen, den petrous timelige bein. De fleste funksjonelle hår celle studier har brukt akutt isolerte hårcellene. Her beskriver vi en semi-intakt utarbeidelse av mus vestibular epitel for elektrofysiologiske og to-foton mikroskopi studier.

En isolert Semi-intakt Utarbeidelse av Mouse Vestibular Sensorisk Epitel for Electrophysiology og høy oppløsning To-foton mikroskopi

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging av Mouse Spinal Cord Bruke to-foton Mikroskopi

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Tissue Preparering og farging av Mouse Sensoriske nervefibre Innervating Hud og Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

I Vivo to-foton avbildning av erfaring-avhengige molekylære endringer i kortikale Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

En<em&gt; In-vitro</em&gt; Utarbeidelse av Isolerte Enteriske nevroner og gliaceller fra myenteric Plexus av Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo to-foton mikroskopi av Enkeltnerveender i hud

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

To-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av dendrittutløperne i Mouse Cortex Bruke en Tynnet-skalle Forberedelse

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

To-foton Imaging av Cellular Dynamics i Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Kvantifisering av Cerebral Vascular Architecture ved hjelp av to-foton mikroskopi i en musemodell for HIV-indusert nevroinflammasjon

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog (Rana catesbeiana)

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog Rana catesbeiana

Fysiologisk Utarbeidelse av hårceller fra sacculus av den amerikanske Bullfrog (<em&gt; Rana catesbeiana</em&gt;)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

I Vivo To-fotonet avbilding av kortikale nevroner i Neonatal mus

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...