Name: measurement of tension release during laser induced axon lesion to evaluate axonal adhesion to the substrate at piconewton and millisecond resolution
Uploaded: 2013-05-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution at JoVE.

Alberto Guiggiani für die Entwicklung des Echtzeit-Steuersystem, Evelina Chieregatti und Hanako Tsushima für aufschlussreiche Diskussionen, Giacomo Pruzzo und Alessandro Parodi für die Entwicklung von kundenspezifischen Elektronik und Software, und Claudia Chiabrera und Marina Nanni für ihre kompetente Beratung und Unterstützung in der Zellkultur Vorbereitung.

1. Optischer Aufbau Das gesamte optische System wurde zuvor 15 beschrieben. Kurz gesagt, wird die optische Pinzette-System auf einer Ytterbium Dauerstrich (CW)-Faser-Laser, der bei 1064 nm (IPG Laser GmbH) basiert. Räumlicher Lichtmodulator (SLM) (LCOS SLM, Modell X10468-07 - Hamamatsu) variiert die Phase des ankommenden IR Laserstrahl, um die Position der Trapping Brennfleck auf der Kulturschale von computergenerierten Hologrammen steuern. Die frei verfügbaren Blue-Pinzette-Softw...

<ol>
	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Trapping+and+Manipulation+of+Viruses+and+Bacteria.">Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria.</a> Science. 235, 1517-1520 (1987).</li><li>Berns, M. W., Aist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+cell+and+developmental+biology.">Laser microsurgery in cell and developmental biology.</a> Science. 213, 505-513 (1981).</li><li>Nguyen, Q. T., Olson, E. 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J. 94, 2610-2620 (2008).</li><li>Difato, F., Tsushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+actin+waves+during+regeneration+after+axonal+lesion+is+enhanced+by+BDNF.">The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF.</a> Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).</li><li>Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+optical+manipulation+and+electrophysiological+tools+to+modulate+and+record+activity+in+neural+networks.">Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks.</a> International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).</li><li>Guiggiani, A., Torre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+and+long-term+interferometric+tracking+by+static+and+dynamic+force-clamp+optical+tweezers.">Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers.</a> Opt. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decrease+in+membrane+tension+precedes+successful+cell-membrane+repair.">A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair.</a> Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).</li><li>Kress, H., Stelzer, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+act+as+phagocytic+tentacles+and+pull+with+discrete+steps+and+a+load-dependent+velocity.">Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).</li><li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site.">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li><li>Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+mechanotransduction:+pathways,+probes,+and+physiology.">Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).</li><li>Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+surgery+and+optical+trapping+in+a+laser+scanning+microscope.">Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope.</a> Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).</li><li>Carter, A. R., King, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+an+optical+microscope+to+0.1+nm+in+three+dimensions.">Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions.</a> Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).</li><li>Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+strategies+for+control+of+neuronal+cell+adhesion:+A+review.">Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review.</a> Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).</li></ol>

Wir berichten in dieser Arbeit eine quantitative Methode, um die Neuriten Haftung auf dem Substrat Kultur vergleichen, indem Sie gleichzeitig Kraft-Spektroskopie Messung während laserinduzierten Zelle Läsion. Die gemessene Freisetzung von Spannung auf den Grad der Haftung der Zellen an das Substrat bezogen werden: Zellen mit einer höheren Anzahl von fokalen Adhäsionen zu weniger Verspannungen. Die Messung der Freisetzung von Spannungen in Bezug auf Pikonewton bietet eine physikalische Größe, durch die die axonale ...

Optische Mikroskopie ist eine der weniger invasiven bildgebenden System zur Verfügung zu lebenden Zellen zu beobachten. Mit der Nutzung von Effekten wie Strahlungsdruck (wie in einer optischen Pinzette 1) oder hochenergetischen Photonen-Flux (wie im Laser dissector 2) wurde diese Technologie, um Nano-Manipulation erweitert. Die optische Imaging-System liefert eine präzise Steuerung zu visualisieren und zu manipulieren sub zellulären Targets 3. Zur gleichen Zeit, dank der präzisen Kalibrierung des gelieferten Laserleistung, erreichen optischen Werkzeuge entweder weich oder invasive Probenmanipulation mit beispielloser Reproduzierbarkeit. Mehrere Labors integriert, in derselben Versuchsanordnung, optische Pinzetten und Laser Dissektor um Organellen 4, miteinander zu verschmelzen verschiedenen Zellen 5 oder Zellen durch optisch angetrieben Ladungen 6,7 stimulieren abzutragen. Während optische Pinzette, nach der Kalibrierung des optischen Steifigkeit, für erlaubendie Kontrolle der aufgebrachten Kraft auf die Zelle auf einer Skala Pikonewton können Laser Dissektion Systeme modulieren optische Manipulation, die von Membran Foto-ration der Ablation einzelner Organellen oder Dissektion der sub-zellulären Strukturen reicht. Jedoch beruht Laser Dissektion Kalibrierung auf qualitative Beurteilung der Einheit von optischen Manipulation in Bezug auf die Energie, die an die Probe, vor allem auf Bildanalyse veranschaulicht morphologischen Veränderungen verursacht, die dem Muster 8 basiert. In dem vorgestellten Verfahren zeigen wir, wie man Kraft-Spektroskopie Messung während des Laser axonal Dissektion einer sich entwickelnden Neuronen führen, zu quantifizieren, auf Pikonewton Skala, die Kraft durch eine veränderte Gleichgewicht im Zytoskelett-Struktur eines sub-zellulären Fach 9 produziert. Kultivierten Neuronen an dem Substrat haften, und während der Entwicklung zu polarisieren. Die Polarisation Phase tritt während der ersten fünf Tage in vitro. In Stufe zwei der Polarisierung, einer der Extrudering Neuriten länger wird, und es wird zu differenzieren, um das Axon 10 geworden. Axonal Dehnung in Reaktion auf Zugkraft am Wachstum Kegel wurde zuvor von Dennerl-Modell 11 modelliert. Vor kurzem ist dieses Modell 12 verlängert, um die Rolle von Neuriten Adhäsion an die extrazelluläre Matrix Substrate umfassen. Diese biophysikalische Modell nach experimentellen Beobachtungen 13 vorgeschlagen, zeigten, dass Zugkräfte auf das Wachstum Kegel, der sich entlang der Neuriten, moduliert von fokalen Adhäsionen zu dem Substrat. Ebenso produziert axonale Läsion eine lokale Freisetzung von Spannungen hin ausbreiten Zellkörper. So haben wir vorgeschlagen, dass die Messung solcher freigegeben Spannung an einem Ort entlang des Axons zwischen der Verletzung und der Zelle soma bietet die Möglichkeit, die dämpfende Ergebnis unberührt fokalen Adhäsionen zu bewerten. Wir kalibrieren die notwendige Energie Photon-Fluss des Lasers Dissektor, um das Ausmaß des zugefügten axonalen damag steuerne, von der kompletten Durchtrennung einer partiellen Läsion. Nach der Kalibrierung, wiederholten wir partielle Läsion der Axone von mehreren differenzierenden Neuronen und entwickelte das Protokoll, um die Spannung zu lösen quantifizieren und somit erhalten eine quantitative Parameter, um die Haftung der Axon auf das Substrat 14 zu schätzen. In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir im Detail die entwickelte Protokoll, das eine genaue experimentelle Verfahren zu ermitteln und zu vergleichen mit Pikonewton Empfindlichkeit des axonalen Haftung auf dem Substrat in verschiedenen experimentellen Bedingungen wie chemische Behandlung 14, oder verschiedene Arten von Zellkultur Unterstützung darstellt.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer microspheres, &Oslash; 4 &mu;m, COOH coated</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>PC05N/6700</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyLink Protein Coupling Kit</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>19539</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR laser</td>
			<td>IPG Laser GmbH</td>
			<td>YLM-5-SC-LP</td>
			<td>ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatial light modulator</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>LCOS-SLM 10468-07</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue-tweezers software</td>
			<td>Optics group, University of Glasgow</td>
			<td>Free downloadable software</td>
			<td><a href="http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/" target="_blank">http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Free downloadable software</td>
			<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/ </a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPD</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S5980 with C5460SPL 6041 board</td>
			<td>Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD</td>
			<td>Teem Photonics</td>
			<td>PDA100A-EC</td>
			<td>Photodiode to measure z trapped probe displacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nano-Pulse UV laser</td>
			<td>AA-optoelctronics</td>
			<td>PNV-001525-040</td>
			<td>Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acoustic Optic Modulator</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>V887ECSUVB EMCCD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier device</td>
			<td>Physic Instruments</td>
			<td>QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage: micro+piezo stage</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daq</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>NI PCI-6229</td>
			<td>Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of tension release during laser induced axon lesion to evaluate axonal adhesion to the substrate at piconewton and millisecond resolution

Die Bildung von funktionalen Zusammenhänge in einem Entwicklungsland neuronale Netzwerk wird durch extrinsische Cues beeinflusst. Das Neuritenwachstum von sich entwickelnden Neuronen unterliegt chemische und mechanische Signale, und die Mechanismen, durch die er spürt und reagiert auf mechanische Signale werden kaum verstanden. Die Aufklärung der Rolle der Streitkräfte in Zell-Reifung wird das Design von Gerüsten, die Zelladhäsion und Zytoskelett-Kopplung mit dem Substrat zu fördern und damit die Verbesserung der Fähigkeit der verschiedenen neuronalen Typen nach einer Verletzung regenerieren. Hier beschreiben wir eine Methode, um die gleichzeitige Kraft-Spektroskopie-Messungen während der Laser-induzierten Zell-Läsion gelten. Wir messen Spannung Release in der teilweise lädierten Axon durch gleichzeitige interferometrischen Tracking eines optisch gefangen Sonde haftete an der Membran des Axons. Unsere experimentellen Protokoll erkennt die Spannung Release mit Pikonewton Empfindlichkeit und die Dynamik der Spannung Freisetzung beiMillisekunden-Auflösung. Somit ist es ein hochauflösendes Verfahren zu untersuchen, wie die mechanischen Verbindungen zwischen den Zellen und Substrate moduliert werden kann durch medikamentöse Behandlung und / oder durch unterschiedliche mechanische Eigenschaften des Substrats.

Die Zelle erzeugt Zugkräfte auf dem Substrat durch die fokalen Adhäsionen. Kraft durch Zytoskelett Elemente erzeugt werden, sind im Gleichgewicht mit der Gegenkraft der Kultur Substrat. Nach laserinduzierten Läsion des Neuriten, sind einige der gespannten Zytoskelett Kabel gestört und ihre äquilibriert Spannung befreit wird, da die Gegenkraft der Haftung auf dem Substrat eliminiert wird. Das freigesetzte Spannung teilweise auf die nicht betroffenen fokalen Adhäsionen verteilt und die Wulst an der Zellmembran in ei...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution at JoVE.

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Wir messen die Spannung zu lösen in einem Axon, die teilweise mit einem Laser dissector durch gleichzeitige Kraft-Spektroskopie-Messung an einem optisch gefangen Sonde haftete an der Membran des Axons durchgeführt wurde lädierten. Das entwickelte Versuchsprotokoll wertet das Axon Haftung auf dem Kultursubstrat.

Messung der Spannungsstifte Während Laser Induced Axon Läsion Axonal Haftung auf dem Substrat und auswerten zu Pikonewton Millisekundenauflösung

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduktion des neuronalen Wachstums

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Forschung

Biotechnik

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

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Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Der Aufbau eines Low-Budget-Laser Axotomie System, um Axon Regeneration in Study C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

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Mikropipette Aspiration von Substrat-attached Cells zu schätzen Zelle Stiffness

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