Name: measurement of tension release during laser induced axon lesion to evaluate axonal adhesion to the substrate at piconewton and millisecond resolution
Uploaded: 2013-05-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution at JoVE.

वास्तविक समय नियंत्रण प्रणाली, व्यावहारिक विचार विमर्श, गियाकोमो Pruzzo और एलेसैंड्रो Parodi कस्टम इलेक्ट्रॉनिक्स और सॉफ्टवेयर के विकास के लिए, और क्लाउडिया Chiabrera और उनके विशेषज्ञ सलाह और सेल संस्कृति तैयार करने में सहायता के लिए मरीना Nanni के लिए Evelina Chieregatti और ​​Hanako Tsushima के विकास के लिए अल्बर्टो Guiggiani.

1. ऑप्टिकल सेटअप पूरे ऑप्टिकल प्रणाली में पहले 15 में वर्णित किया गया. संक्षेप में, ऑप्टिकल चिमटी प्रणाली 1064 एनएम (IPG लेजर GmbH) पर एक अटर्बियम निरंतर तरंग (CW) लेजर फाइबर परिचालन पर आधारित है. एक स्?...

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	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Trapping+and+Manipulation+of+Viruses+and+Bacteria.">Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria.</a> Science. 235, 1517-1520 (1987).</li><li>Berns, M. W., Aist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+cell+and+developmental+biology.">Laser microsurgery in cell and developmental biology.</a> Science. 213, 505-513 (1981).</li><li>Nguyen, Q. T., Olson, E. 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हम इस काम में लेजर प्रेरित सेल घाव के दौरान एक साथ बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप प्रदर्शन करके, संस्कृति सब्सट्रेट neurite आसंजन तुलना करने के लिए एक मात्रात्मक विधि की रिपोर्ट. तनाव से मापा रिहाई सब्सट्रेट करन?...

ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी जीवित कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए उपलब्ध कम इनवेसिव इमेजिंग प्रणाली में से एक है. ऐसे विकिरण दबाव (ऑप्टिकल चिमटी 1 के रूप में), या उच्च ऊर्जा फोटॉन प्रवाह (लेजर चीड़फाड़ 2 के रूप में) के रूप में प्रभाव के शोषण के साथ, इस तकनीक नैनो हेरफेर के लिए बढ़ा दिया गया था. ऑप्टिकल इमेजिंग प्रणाली 3 कल्पना और उप सेलुलर लक्ष्य हेरफेर करने के लिए एक सटीक नियंत्रण प्रस्तुत. इसी समय, वितरित लेजर शक्ति का सही अंशांकन के लिए धन्यवाद, ऑप्टिकल उपकरण अभूतपूर्व reproducibility के साथ या तो मुलायम या आक्रामक नमूना हेरफेर पूरा. कई प्रयोगशालाओं अलग कोशिकाओं 5 फ्यूज के साथ, या ऑप्टिकली प्रेरित कार्गो 6,7 द्वारा कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए organelles के 4, काटकर अलग करने के क्रम में एक ही प्रयोगात्मक सेटअप, ऑप्टिकल चिमटी और लेजर चीड़फाड़ में, एकीकृत. ऑप्टिकल चिमटी, ऑप्टिकल कठोरता की जांच के बाद, के लिए अनुमतिएक piconewton पैमाने पर सेल को लागू बल के नियंत्रण, लेजर विच्छेदन सिस्टम झिल्ली फोटो poration से उप सेलुलर संरचनाओं के एकल organelles या विच्छेदन की पृथक के बीच है, जो ऑप्टिकल हेरफेर, न्यूनाधिक कर सकते हैं. हालांकि, लेजर विच्छेदन अंशांकन मुख्य रूप से नमूना 8 से कारण morphological परिवर्तन को चित्रित छवि विश्लेषण के आधार पर नमूने लिए दिया ऊर्जा, के संबंध में ऑप्टिकल हेरफेर की इकाई का गुणात्मक मूल्यांकन पर निर्भर करता है. प्रस्तुत पद्धति में, हम piconewton पैमाने पर, यों के लिए, एक विकासशील न्यूरॉन की लेजर axonal विच्छेदन के दौरान बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शन कैसे, एक उप सेलुलर डिब्बे 9 की cytoskeleton संरचना में एक बदल संतुलन द्वारा उत्पादित बल. सभ्य न्यूरॉन्स सब्सट्रेट का पालन करना, और विकास के दौरान फूट डालना. ध्रुवीकरण चरण में इन विट्रो में पहले पांच दिनों के दौरान होता है. स्तर पर ध्रुवीकरण की दो, extrud में से एकआईएनजी neurites के लंबे समय तक हो जाता है, और यह अक्षतंतु 10 बनने के लिए अलग होगा. विकास शंकु में रस्सा बल के जवाब में axonal बढ़ाव पहले Dennerl का मॉडल 11 से मॉडलिंग कर दिया गया है. हाल ही में, इस मॉडल बाह्य मैट्रिक्स substrates के लिए neurite आसंजन की भूमिका में शामिल करने के लिए 12 बढ़ा दिया गया है. प्रयोगात्मक टिप्पणियों के बाद 13 प्रस्तावित इस biophysical मॉडल,,, neurite साथ प्रचार, विकास शंकु पर बलों खींच सब्सट्रेट करने के लिए फोकल adhesions द्वारा संग्राहक हैं कि पता चला है. इसी तरह, axonal घाव सेल शरीर की ओर प्रचार तनाव की एक स्थानीय रिहाई पैदा करता है. इस प्रकार, हम घाव और सेल सोम के बीच अक्षतंतु साथ एक स्थान में इस तरह के जारी तनाव को मापने अप्रभावित फोकल adhesions की कमी लाने के परिणाम का आकलन करने की संभावना प्रदान करता है कि प्रस्ताव रखा. हम प्रवृत्त axonal damag की हद तक नियंत्रित करने के लिए आवश्यक ऊर्जा लेजर चीड़फाड़ के फोटॉन प्रवाह जांचनाई, पूरी transection से आंशिक घाव को. अंशांकन के बाद, हम कई फर्क न्यूरॉन्स के axons को आंशिक घाव दोहराया और तनाव रिहाई यों के लिए प्रोटोकॉल विकसित की है, और इस प्रकार सब्सट्रेट 14 से अक्षतंतु के आसंजन अनुमान लगाने के लिए एक मात्रात्मक पैरामीटर प्राप्त की. वर्तमान काम में, हम विस्तार से इस तरह के रासायनिक उपचार 14, या सेल संस्कृति समर्थन के विभिन्न प्रकार के रूप में विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों में सब्सट्रेट axonal आसंजन मूल्यांकन और piconewton संवेदनशीलता के साथ तुलना करने के लिए एक सटीक प्रयोगात्मक प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है जो विकसित प्रोटोकॉल का वर्णन है.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer microspheres, &Oslash; 4 &mu;m, COOH coated</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>PC05N/6700</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyLink Protein Coupling Kit</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>19539</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR laser</td>
			<td>IPG Laser GmbH</td>
			<td>YLM-5-SC-LP</td>
			<td>ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatial light modulator</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>LCOS-SLM 10468-07</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue-tweezers software</td>
			<td>Optics group, University of Glasgow</td>
			<td>Free downloadable software</td>
			<td><a href="http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/" target="_blank">http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Free downloadable software</td>
			<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/ </a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPD</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S5980 with C5460SPL 6041 board</td>
			<td>Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD</td>
			<td>Teem Photonics</td>
			<td>PDA100A-EC</td>
			<td>Photodiode to measure z trapped probe displacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nano-Pulse UV laser</td>
			<td>AA-optoelctronics</td>
			<td>PNV-001525-040</td>
			<td>Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acoustic Optic Modulator</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>V887ECSUVB EMCCD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier device</td>
			<td>Physic Instruments</td>
			<td>QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage: micro+piezo stage</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daq</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>NI PCI-6229</td>
			<td>Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of tension release during laser induced axon lesion to evaluate axonal adhesion to the substrate at piconewton and millisecond resolution

एक विकासशील neuronal नेटवर्क में कार्यात्मक कनेक्शन के गठन बाह्य संकेतों से प्रभावित है. विकासशील न्यूरॉन्स की neurite विकास रासायनिक और यांत्रिक संकेतों के अधीन है, और जो व्यवस्था के द्वारा यांत्रिक संकेतों को यह होश और प्रतिक्रिया करता है खराब समझ रहे हैं. सेल परिपक्वता में सेना की भूमिका elucidating सब्सट्रेट करने के लिए कोशिका आसंजन और cytoskeletal युग्मन प्रोत्साहित कर सकते हैं कि scaffolds के डिजाइन सक्षम है, और इसलिए चोट के बाद पुनर्जीवित करने के लिए अलग neuronal प्रकार की क्षमता में सुधार होगा. यहाँ, हम लेजर प्रेरित सेल घाव के दौरान एक साथ बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप लागू करने के लिए एक विधि का वर्णन है. हम अक्षतंतु की झिल्ली का पालन एक ऑप्टिकली फंस जांच का एक साथ interferometric ट्रैकिंग द्वारा आंशिक रूप से lesioned अक्षतंतु में तनाव रिहाई के उपाय. हमारे प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल piconewton संवेदनशीलता के साथ तनाव रिहाई का पता लगाता है, और कम तनाव रिहाई के गतिशीलमिलीसेकंड समय संकल्प. इसलिए, यह कोशिकाओं और substrates के बीच यांत्रिक युग्मन औषधीय उपचार और / या सब्सट्रेट के विशिष्ट यांत्रिक गुणों द्वारा ठीक किया जा सकता है कि कैसे अध्ययन करने के लिए एक उच्च संकल्प तरीका प्रदान करता है.

सेल अपने फोकल adhesions द्वारा सब्सट्रेट पर कर्षण बल उत्पन्न करता है. Cytoskeletal तत्वों द्वारा उत्पन्न फोर्स संस्कृति सब्सट्रेट का प्रतिकार बल के साथ संतुलन में हैं. Neurite की लेजर प्रेरित घाव के बाद, तनाव cytoskeleton के तार?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution at JoVE.

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

हम आंशिक रूप से अक्षतंतु की झिल्ली का पालन एक ऑप्टिकली फंस जांच पर प्रदर्शन एक साथ बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप द्वारा एक लेजर चीड़फाड़ साथ lesioned था कि एक अक्षतंतु में तनाव जारी मापा. विकसित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल संस्कृति सब्सट्रेट करने के लिए अक्षतंतु आसंजन मूल्यांकन करता है.

लेजर प्रेरित एक्जॉन घाव के दौरान तनाव रिलीज के मापन piconewton और millisecond संकल्प पर सब्सट्रेट करने Axonal आसंजन का मूल्यांकन करने के लिए

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Axon खींचो ग्रोथ: neuronal विकास के mechanotransduction

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

डिजाइन के लिए एक चक्रीय दबाव bioreactor पूर्व vivo</emमहाधमनी हार्ट वाल्व का> अध्ययन

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

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