Name: induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition
Uploaded: 2013-08-27T12:00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition Video at JoVE.com

De auteurs willen graag Julia Hatler en Martin Ramsden (R &amp; D Systems) erkennen voor nuttige discussie en manuscript beoordeling.

1. Inductie van EMT <ol><li> Warm kweekmedium tot 37 ° C in een waterbad. Het kweekmedium is dezelfde als de media gebruikt voor standaard kweek van de cellen van belang. Zo wordt de humane longcarcinoom A549 cellijn gekweekt in F12 Kaighn&#39;s aangevuld met 10% foetaal runderserum en 2 mM glutamine. </li><li> Oogst cellen van belang het gebruik van een dissociatie oplossing (bijv. TrypLE Express). </li><li> Schorten cellen in voorverwarmde cultuur media in een 15 ml conische buis. </li><li> Centrifugeer de celsuspensie bij 400 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig door gieten in een afvalcontainer. </li><li> Hang de cel pellet in voorverwarmde cultuur media. </li><li> Telling levensvatbare cellen met behulp van trypan blauw. Verwijderen van een steekproef van de celsuspensie en verdund in 0,4% trypaanblauwoplossing. Plaats 10 pi van de verdunde monster op een hemocytometer en tel levensvatbare cellen (cellen die niet blauw niet draaien). Gebruik cel aantallen te bepalen de cel density in uw oplossing. </li><li> Plaat cellen op weefselkweek behandeld platen of kolven op 0,9-1,0 x 10 4 cellen per cm 2. Bijvoorbeeld 0,5 x 10 6 cellen uitgeplaat in een 100 mm plaat in kweekmedium dat 1X EMT opwekken Media Supplement (6 ml media per 100 mm plaat). </li><li> Kweek uitgeplaat cellen in een 37 ° C / 5% CO2 incubator. Monitor cel morfologie dagelijks. </li><li> Drie dagen na de plating, verwijder media en te vervangen door verse voorverwarmde kweekmedium dat 1X EMT opwekken Media Supplement. Blijven aan de cultuur in een 37 ° C / 5% CO 2 incubator. </li><li> Vijf dagen na plateren, cellen klaar voor analyse. Celmorfologie wordt gevisualiseerd door omgekeerde lichtmicroscoop. </li></ol> 2. Analyse van eiwitexpressie door immunocytochemie <ol><li> Bereid steriele 12 mm dekglaasjes voor een 24-wells plaat door het plaatsen dekglaasjes in een petrischaaltje met 95% ethanol. Verwijder voorzichtig dekglaasjes van ethanol onsing een naald en gebogen pincet en vlam steriliseren. Plaats steriele dekglaasje in een putje van een 24-wells plaat. Herhaal met de rest dekglaasjes. </li><li> Bereid de celsuspensie zoals beschreven in paragraaf 1,1-1,7. </li><li> Plaat 1.6 x 10 4 cellen / putje in 0,5 ml voorverwarmde kweekmedium dat 1X EMT opwekken Media Supplement. </li><li> Groeien en voeden cellen zoals beschreven in paragrafen 1,9-1,11. </li><li> Vijf dagen na plateren, verwijdert media en bevestig cellen met 300 ul / putje van 4% paraformaldehyde in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 20 min bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Verwijder fixatief en spoel cellen 2x met 1X PBS, 500 ul / putje. </li><li> Incubeer cellen in 400 ul / putje blokkerende buffer (1X PBS dat 1% runderserumalbumine (BSA), 10% normaal serum ezel, en 0,3% Triton X-100) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Incubeer in het primair antilichaam bij fabrikanten aanbevolen concentratie in 400 ul / putje blokkerende buffer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur temperature of overnacht bij 4 ° C. Bij gebruik van een primair antilichaam rechtstreeks geconjugeerd aan een fluorochroom, incubeer de monsters in het donker. </li><li> Was de cellen drie keer in 500 ul / putje van 1X PBS dat 0,1% BSA gedurende 5 minuten elke wassing. Bij gebruik van een primair antilichaam direct geconjugeerd aan een fluorochroom, ga dan naar stap 2.12. </li><li> Incubeer cellen secundair antilichaam bij aanbevolen concentratie fabrikant is 400 ul / putje van 1X PBS bevattende 1% BSA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Was de cellen drie keer in 500 ul / putje van 1X PBS dat 0,1% BSA gedurende 5 minuten elke wassing. </li><li> Desgewenst tegenkleuring kernen met DAPI oplossing. </li><li> Spoel cellen in gedemineraliseerd water en monteer coverslips gezicht naar beneden op een dia met behulp van montage media. </li></ol>

<ol>
	<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition.">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li><li>Thiery, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions+in+tumour+progression.">Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression.</a> Nature Reviews Cancer. 2, 442-454 (2002).</li><li>Heuberger, J., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+cadherin-mediated+cell+adhesion+and+canonical+Wnt+signaling.">Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 1-23 (2010).</li><li>Onder, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+E-cadherin+promotes+metastasis+via+multiple+downstream+transcriptional+pathways.">Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways.</a> Cancer Research. 68, 3645-3654 (2008).</li><li>Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin/&#946;-catenin+complex+and+the+epithelial+barrier.">E-cadherin/&#946;-catenin complex and the epithelial barrier.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-6 (2011).</li><li>Scheel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+and+autocrine+signals+induce+and+maintain+mesenchymal+and+stem+cell+states+in+the+breast.">Paracrine and autocrine signals induce and maintain mesenchymal and stem cell states in the breast.</a> Cell. 145, 926-940 (2011).</li><li>Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition.">TGF-&#946;-induced epithelial to mesenchymal transition.</a> Cell Research. 19, 156-172 (2009).</li><li>Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;1+induces+human+alveolar+epithelial+to+mesenchymal+cell+transition.">TGF-&#946;1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition.</a> EMT). Respiratory Research. 6, 56-70 (2005).</li><li>Miettinen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+induced+transdifferentiation+of+mammary+epithelial+cells+to+mesenchymal+cells:+involvement+of+type+I+receptors.">TGF-&#946; induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors.</a> Journal of Cell Biology. 127, 2021-2036 (1994).</li><li>Pelton, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+genes+encoding+TGFs+&#946;1,+&#946;2,+and+&#946;3+during+murine+palate+formation.">Differential expression of genes encoding TGFs &#946;1, &#946;2, and &#946;3 during murine palate formation.</a> Dev. Biol. 141, 456-460 (1990).</li><li>Taube, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+epithelial-to-mesenchymal+transition+interactome+gene-expression+signature+is+associated+with+claudin-low+and+metaplastic+breast+cancer+subtypes.">Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes.</a> PNAS. 107, 15449-15454 (2010).</li><li>Roussos, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AACR+special+conference+on+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+progression+and+treatment.">AACR special conference on epithelial-mesenchymal transition and cancer progression and treatment.</a> Cancer Research. 70, 7360-7364 (2010).</li><li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states:+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits.">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9, 265-273 (2009).</li><li>Brown, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+by+transforming+growth+factor-&#946;1+of+epithelial+to+mesenchymal+transition+is+a+rare+event+in+vitro.">Induction by transforming growth factor-&#946;1 of epithelial to mesenchymal transition is a rare event in vitro.</a> Breast Cancer Research. 6, 215-231 (2004).</li><li>De Falco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+proteolysis+increases+CREB+phosphorylation+and+sustains+proliferation+of+thyroid+cancer+cells.">CD44 proteolysis increases CREB phosphorylation and sustains proliferation of thyroid cancer cells.</a> Cancer Research. 72, 1449-1458 (2012).</li><li>Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Erk+pathway+is+required+for+TGF-&#946;1-induced+EMT+in+vitro.">Activation of the Erk pathway is required for TGF-&#946;1-induced EMT in vitro.</a> Neoplasia. 6, 603-610 (2004).</li><li>Bachelder, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase-3+is+an+endogenous+inhibitor+of+Snail+transcription:+implication+for+the+epithelial-mesenchymal+transition.">Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription: implication for the epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Cell Biology. 168, 29-33 (2005).</li><li>Pon, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p70+S6+kinase+promotes+epithelial+to+mesenchymal+transition+through+Snail+induction+in+ovarian+cancer+cells.">p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells.</a> Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).</li><li>Wegner, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+changes+in+receptor+tyrosine+kinase+phosphorylation+using+antibody+arrays.">Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li></ol>

R &amp; D Systems, Inc is een for-profit, publieke onderneming. Productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door R &amp; D Systems, Inc

Vorige werkwijzen voor EMT inductie het algemeen gebruikt TGF-β stimulatie of genetische modificatie. Hoewel TGF-β alleen is aangetoond EMT induceren in sommige celtypen, werd nu aangetoond dat TGF-β noodzakelijk voor EMT, maar het is niet voldoende alle celtypen 6,14. Het gebruik van genetische modificatie voor EMT inductie is tijdrovend en arbeidsintensief. De hier beschreven methode gebruikt een combinatie van factoren, anti-humane E-cadherine, anti-humaan sFRP-1, anti-humaan DKK-1, recombinant humaan Wnt-5a en recombinant humaan TGF-β1 betrouwbaar EMT induceren. Deze combinatie van elementen is ontworpen om E-cadherine basis hechting, een kritische stap voor EMT inductie 4 blokkeren en verbeteren Wnt signalering door toevoeging van de Wnt-5a-eiwit alsmede het gebruik van blokkerende antilichamen tegen de Wnt remmers, sFRP-1 en Dkk -1. Wnt en TGF-β signalering is aangetoond dat zij in een autocriene lus voor inductie en handhaven de mesenchymale cel state 6. Deze inductiemethode voorkomt genetische manipulatie en is effectiever dan het gebruik TGF-β alleen. Belangrijk, kunnen wij inductie van EMT observeren celtypen, waaronder MCF7 en PANC-1 cellen, die eerder aangetoond niet alleen reageren op TGF-β stimulatie (figuur 5) 14. Cellen behandeld met EMT Induceren Media Supplement toon minder compact en meer spoelvormige morfologie (figuur 1). Daarnaast is er een afname in oppervlak E-cadherine gelijktijdig met een verhoging van fibronectine expressie, die kenmerken van EMT (figuren 2 en 3) zijn. Aanvullende mesenchymale merkers zoals vimentine en slak ook opgereguleerd in de EMT geïnduceerde cellen in vergelijking met niet-geïnduceerde controles (Figuur 4). Toegenomen migratie en invasie vaardigheden zijn de belangrijkste functionele kenmerken van mesenchymale cellen. In in vitro </em&gt; Migratie en invasie assays cellen behandeld met EMT Induceren Media Supplement toonde een aanzienlijk verhoogde capaciteit te migreren en binnendringen (figuur 6). Deze eenvoudige werkwijze voor EMT inductie is nuttig voor de studie van EMT signalering zoals aangetoond met het antilichaam-array expressie uit figuur 7. Verschillende celtypes kunnen pre-en post-EMT inductie vergeleken gemeenschappelijk expressie handtekeningen verbonden EMT, zoals de toename van gefosforyleerde CREB en ERK1 / 2 gezien in zowel MCF7 en A549-EMT geïnduceerde cellen te verkrijgen. S133 fosforylatie van CREB stimuleert DNA binding en is getoond stroomafwaarts van TGF-β1-geïnduceerde EMT 15 handelen. ERK1 / 2 fosforylering is ook aangetoond stroomafwaarts van TGF-β1-geïnduceerde EMT 16 handelen. Verschillen in signaalwegen tussen celtypen kan worden toegelicht zoals gezien met de toename van GSK-3β fosforylatie in A549-cellen versus p70S6K fosforylatie in MCF7. GSK-3β fosforylatie bij serine 9 verlaagt functie en GSK-3β is aangetoond dat het pro-EMT transcriptiefactor Snail 17 remmen. Daarentegen induceert p70S6K activiteit Slak en de fosforylering is geassocieerd met activatie van dit eiwit 18. Algemene, eenvoudige en betrouwbare inductie van EMT, met name in de cellen eerder aangetoond niet te reageren uitsluitend TGF-β, is nuttig voor het begrijpen van de biologie van EMT, het identificeren van gemeenschappelijke uitdrukking handtekeningen voor gebruik als prognostische markers, en het ontwikkelen en evalueren van nieuwe therapieën voor kanker en fibrotische ziekten.

Epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) is het proces waarbij een gepolariseerde epitheliale cel ondergaat diverse wijzigingen resulteert in een zeer beweeglijke, fibroblast-achtige mesenchymale cellen. Dit proces treedt op, ondermeer met genexpressie veranderingen en afbraak van contactplaatsen, hetgeen resulteert in een toegenomen vermogen om te migreren en binnendringen. Fysiologisch, EMT speelt een belangrijke rol tijdens de embryonale ontwikkeling en wondheling. Verlies van een goede controle over de EMT kan leiden tot fibrose en metastase van carcinomen 1,2. De reductie van E-cadherine op het oppervlak van epitheelcellen is een kritische stap bij de progressie van een cel door EMT 3,4. E-cadherine is een single-pass transmembraan eiwit dat direct met cadherin eiwitten op aangrenzende cellen. Naast zijn rol bij celadhesie, E-cadherine invloeden cel signalering via interacties tussen de cytoplasmatische staart van E-cadherine eenda verscheidenheid van regulerende eiwitten, met name β-catenine. β-catenine speelt een rol bij de stabilisering van contactplaatsen. Tijdens Wnt signalering, is β-catenine model van E-cadherine en translocatie naar de kern waar het als een stroomafwaartse transcriptiefactor in de Wnt route 3,4,5. In de kern is β-catenine is aangetoond dat de transcriptie van verscheidene EMT-gerelateerde factoren Twist, slak, fibronectine, en een verscheidenheid van matrix metalloproteasen 3,6 te verhogen. Naast Wnts heeft TGF-β signalering blijkt een belangrijke rol spelen bij EMT inductie zowel tijdens normale ontwikkeling en in zieke toestanden 7,8,9. TGF-β betrokken bij de EMT die optreedt tijdens verhemelte en in het ontwikkelen van hart 10. Het is ook betrokken bij fibrose en progressie van kanker metastase 7. De hier beschreven procedure provides consistente inductie van EMT in verschillende celtypen zonder genetische manipulatie. Deze procedure maakt gebruik van een cocktail van E-cadherine, sFRP-1 en DKK-1 blokkerende antilichamen en Wnt-5a en TGF-β1 recombinante eiwitten. Deze cocktail is ontworpen om E-cadherine-gebaseerde hechting te blokkeren terwijl het verbeteren van Wnt en TGF-β signalering. De mogelijkheid voor robuuste EMT inductie is van cruciaal belang voor het begrijpen van de biologie van dit proces en hoe het te manipuleren voor therapeutische doeleinden. Huidige gemeenschappelijke markers van EMT, E-cadherine (downregulated in EMT) en Vimentin (upregulated in EMT), vindt co-expressie bij kanker en dus niet de beste diagnostische markers van mogelijke metastatische cellen 12. Belangrijk is dat de analyse van diverse celtypen die EMT hebben ondergaan nuttig gemeenschappelijke genexpressie handtekeningen die worden gebruikt voor diagnostische doeleinden bij kanker en fibrose 11 ontwikkelen. Daarnaast hebben recente studies aangetoond dat EMT kan een rol spelen bij de vorming van kanker cellen, wat suggereert dat cellen die EMT hebben ondergaan nuttig voor drug screening zijn verbindingen die deze cellen kan richten 13 identificeren.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Epithelial cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT Inducing Media Supplement</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CCM017</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&beta;1</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>240-B</td>
			<td>Used at 10ng/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL648R</td>
			<td>Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin </td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1838</td>
			<td>Used at 0.1 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Fibronectin</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1918</td>
			<td>Used at 10 &mu;g/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>AF5718</td>
			<td>Used at 0.2 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL009</td>
			<td>Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF109</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF007</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>SC026</td>
			<td>Used according to the manufacturer's instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96 Well BME Cell Invasion Assay</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>3455-096-K</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>ARY002B</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations19.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting Media</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CTS011</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15350-061</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>789-704</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fine pointed curved forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>12 mm coverslips</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>633009</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used at 5% in TBST for blocking in western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting blocking and washing</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-20% SDS-page gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plates/flasks, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>24-well plates, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipettes / pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet Aid / pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C/5%CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition

Epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) is essentieel voor een goede morfogenese tijdens ontwikkeling. Misregulation dit proces is betrokken als een belangrijke gebeurtenis in fibrose en progressie van carcinomen een metastatische toestand. Inzicht in de processen die ten grondslag liggen EMT is absoluut noodzakelijk voor de vroege diagnose en klinische controle van deze ziektebeelden. Betrouwbare inductie van EMT in vitro is een nuttig hulpmiddel voor drug discovery alsmede gemeenschappelijke genexpressie handtekeningen identificeren voor diagnostische doeleinden. Hier laten we een eenvoudige werkwijze voor de inductie van EMT in verschillende celtypen. Werkwijzen voor de analyse van cellen voor en na EMT-inductie door immunocytochemie zijn ook inbegrepen. Daarnaast hebben we de effectiviteit van deze werkwijze tonen door antilichamen gebaseerde array analyse en migratie / invasie assays.

. Het EMT inducerende kweekomstandigheden beschreven verschaffen een robuuste werkwijze voor de inductie van EMT in verschillende celtypes figuren 1 en 2 tonen de morfologie van marker expressieniveaus voor 4 verschillende menselijke cellijnen: T98G glioblastoma cellen, HT29-colon-adenocarcinoom cellen , A549 longcarcinoomcellen en MCF10A mammaire epitheelcellen. Cellen die werden behandeld met de EMT Induceren Media Supplement veranderd van een klassieke epitheliale morfologie (Figuren 1A - 1D) een mesenchymale, spoelvormige morfologie (fig. 1E - 1H). EMT-geïnduceerde cellen bleken minder dicht op elkaar gepakt in krappe kolonies in vergelijking met niet-geïnduceerde cellen. Geïnduceerde MCF10A monsters bevatten opeengepakte clusters omringd door meer los verpakt cellen. Deze strak ingepakte clusters waren E-cadherine positieve (figuur 2D) en verdween na behandeling met de EMT inducerende Media Supplement (figuur 2H). EMT werd ook beoordeeld door de downregulatie van epitheliale merkers en opregulatie van mesenchymale markers. De downregulatie van E-cadherine wordt typisch waargenomen na inductie EMT in verschillende celtypes 3,4 Figuur 2 toont oppervlakte-expressie van E-cadherine in de meeste onbehandelde cellen (Figuren 2A - 2D, rood). Ten opzichte van zijn afwezigheid na EMT inductie (figuren 2E - 2H, rood). Een cellijn, T98G, bleek een extreem lage basale niveau van E-cadherine voorafgaand aan EMT inductie, die haar analyse uitgesloten hebben. Opregulatie van de mesenchymale marker, fibronectine, was ook zichtbaar na inductie met de EMT inducerende Media Supplement (Figuren 2A - 2D versus figuren 2E - 2H, groen). De expressieniveaus van E-cadherine en fibronectine zichtbaar immunocytochemiewerden verder bevestigd door Western blotting van de totale cellysaten (Figuur 3). De western blot bevestigd downregulatie van E-cadherine en opregulatie van fibronectine expressie zichtbaar immunocytochemie. De banden werden gekwantificeerd met densitometrie en genormaliseerd op GAPDH relatieve veelvoudverandering volgende EMT inductie te bepalen. E-cadherine waren verlaagd 6,4 en 3,4 maal in A549 en MCF10A cellen. Fibronectine niveaus verhoogd 4.6, 4.1, en 2,3 keer in T98G, A549 en MCF10A cellen. Hoewel de Western blot geen significante vermindering van E-cadherine eiwitniveaus in HT29 cellen na inductie EMT tonen de immunocytochemie resultaten tonen een afname van oppervlakte-expressie van E-cadherine (Fig. 2B versus 2F), die niet kan worden onderscheiden Western blotting van de totale cellysaten. Om EMT-status, aanvullende bekende marker verder te evaluerens voor EMT werden geanalyseerd pre-en post-EMT inductie. In overeenstemming met eerdere resultaten werd E-cadherine downregulated in alle onderzochte cellijnen, wat aangeeft dat EMT werd geïnduceerd. Bovendien, de mesenchymale markers, vimentine en slak, werden opgereguleerd in A549, T98G en MCF10A cellen na behandeling met EMT opwekken Media Supplement (figuur 4). De HT29-cellijn expressie van deze mesenchymale markers met of zonder EMT inductie vertonen (gegevens niet getoond), wat erop kan wijzen dat deze cellen gebruiken alternatieve routes voor EMT inductie. Hoewel TGF-β volstaat EMT induceren in bepaalde cel contexten 7,8,9, geen andere celtypen niet alleen reageren op de toevoeging van TGF-β 14. MCF7 menselijke borstkankercellen en PANC-1 menselijke pancreas carcinoom cellen zijn zowel gemeld niet te reageren op TGF-β signalering alleen 14. Om te bepalen of beide lijnen EMT in Vitr kon ondergaano, cellen werden gekweekt in aanwezigheid van het EMT Induceren Media Supplement. Cellen werden gestimuleerd met recombinant TGF-β1 alleen bij een concentratie binnen het EMT Induceren Media Supplement. Deze cellen behouden hun epitheliale morfologie, bestaande uit dicht opeengepakte kolonies van cellen (gegevens niet getoond) en oppervlak E-cadherine niveaus waren vergelijkbaar met die waargenomen in controlecellen (figuren 5C en 5D versus Figuren 5A en 5B). Daarentegen cellen gestimuleerd met EMT Induceren Media Supplement toonde een drastische afname in oppervlak E-cadherine niveaus (figuren 5E en 5F). Deze cellen verkregen ook een mesenchymale morfologie van cellen werd minder compact en meer spindel-achtige (gegevens niet getoond). Deze resultaten demonstreren dat de EMT inducerende hier beschreven methode kan EMT morfologie en merkerexpressie veranderingen in cellen typisch bestand tegen TGF-β-i bevorderennduced EMT. Naast veranderingen in markerexpressie ander kenmerk van mesenchymale cellen is hun vermogen om te migreren en binnendringen. Migratie en invasie van cellen gekweekt met of zonder EMT Induceren Media Supplement werden geanalyseerd met de 96 putjes BME invasie Assay volgens de instructies van de fabrikant. In het kort werden cellen gezaaid op 96-well platen (50.000 cellen / putje) met filterelementen met 8,0 urn poriën. Na 48 uur werd migratie bepaald door calceïne AM kleuring van cellen die door het filter gemigreerd. Elk monster werd in drievoud getest tweemaal met vergelijkbare resultaten. Representatieve resultaten van een experiment worden getoond in Figuur 6A. Statistisch significante toename (p &lt;0,003) bij celmigratie waargenomen met zowel A549 en PANC-1 cellen na inductie EMT. Om het vermogen van deze cellen binnen te dringen (dwz migreren door extracellulaire matrix) beoordelen, dezelfde test wasuitgevoerd met een basaal membraan-extract gecoate filter. EMT-geïnduceerde cellen vertoonden een statistisch significant (p-waarde &lt;0,001) toename invasie mogelijkheden in vergelijking met onbehandelde cellen zoals te zien in figuur 6B. De robuuste inductie van EMT is bruikbaar voor de analyse van genexpressie veranderingen en signalering die in deze cellen. Antilichaam-gebaseerde array analyse met lysaten van zowel behandelde als onbehandelde cellen is een methode om de expressieniveaus van verschillende moleculen geanalyseerd in een enkel monster. Als voorbeeld analyseerden we de niveaus van gefosforyleerd MAPK familieleden in lysaten van niet-geïnduceerde en geïnduceerde EMT MCF7 en A549-cellen met de Proteome Profiler Human fosfo-MAPK Array Kit. De array werd tweemaal uitgevoerd door onafhankelijke EMT-inductie behandelingen met vergelijkbare resultaten. Figuur 7 toont representatieve gegevens van de ene array. Beide celtypen vertoonden verhoogde fosforylatie van CREB (S133), ERK1 (T2<html> 02/Y204) en ERK2 (T185/Y187) in EMT-geïnduceerde cellen vergeleken met controles. Verschillen in signalering evenementen werden waargenomen tussen de twee soorten cellen alsook. A549-cellen toonde een toename van GSK-3 β (S9) fosforylering, terwijl MCF7 cellen vertoonden verhoogde p70S6K (T421/S424) fosforylering. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1.jpg" alt="Figuur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1highres.jpg" fo:width="6in"/> Figuur 1. Mesenchymale morfologie inductie na stimulatie met de EMT inducerende Media Supplement (A - D). Epitheliaale morfologie in de vier celtypen aangegeven volgende cultuur gedurende 5 dagen in standaard kweekmedium zonder de EMT inducerende Media Supplement (E - H). Mesenchymale morfologie in de vier celtypen aangegeven gekweekt met de EMT inducerende Media Toeslag voor 5 dagen. nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; altijd &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2.jpg" alt="Figuur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2highres.jpg" fo:width="6in"/> Figuur 2. Downregulatie van epitheliale marker expressie en opregulatie van mesenchymale marker expressie in EMT-geïnduceerde cellen. Cellen werden gekleurd door immunofluorescentie om de expressie van de epitheliale marker, E-cadherine (rood) op te sporen, en de mesenchymale marker, fibronectine (groen). (A - D) Controle cellen gekweekt zonder het EMT-inducerende Media Toeslag voor 5 dagen (E -. H) Cellen gekweekt met de EMT inducerende Media Toeslag voor 5 dagen. Alle cellen worden tegengekleurd met DAPI (blauw). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig3.jpg" alt="Figuur 3"/> Figuur 3. Bevestiging van epitheliale en mesenchymale marker expressie met western blot een<html> . ANALYSE Western blot van totale cellysaten van de vier celtypen aangegeven behandeld met (EMT) of zonder (-) het EMT Induceren Media toeslag voor 5 dagen. Bands voor E-cadherine, fibronectine, en de GAPDH laad-controle zijn, zoals aangegeven aan de linkerkant. De grootte marker is zoals aangegeven aan de rechterkant. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig4.jpg" alt="Figuur 4"/> Figuur 4. Opregulatie van de mesenchymale markers, Vimentin en Slak in EMT-geïnduceerde cellen. Cellen werden gekleurd door multicolor immunofluorescentie om de expressie van de epitheliale marker, E-cadherine (grijs) op te sporen, en de mesenchymale markers, Vimentin (groen) en Slak (rood) . (A - C) Controle cellen gekweekt zonder het EMT-inducerende Media supplement voor 5 dagen. (D - F) Cellen gekweekt met de EMT inducerende Media Toeslag voor 5 dagen. ltijd &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5.jpg" alt="Figuur 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5highres.jpg" fo:width="6in"/> Figuur 5. Inductie van EMT in TGF-β1 niet-reactieve cellen. (A en B) Cellen gekweekt met medium alleen gedurende 5 dagen. (C en D) cellen gekweekt in medium dat 10 ng / ml TGF-β1 gedurende 5 dagen. (E en F) Cellen gekweekt in EMT opwekken Media toeslag voor 5 dagen. Alle cellen worden gekleurd voor E-cadherine (rood) en tegengekleurd met DAPI (blauw). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig6.jpg" alt="Figuur 6"/> Figuur 6. EMT-geïnduceerde cellen hebben migratie en invasie capaciteit verhoogd. A. Gemiddeld aantal cellen die migreerden via een 8 urn porie filter na incubatie gedurende 48 uur. B. Gemiddeldcellen die in staat zijn om binnen te vallen via een 8 urn porie filter bekleed met basale membraan extract na incubatie gedurende 48 uur waren. Fout balken geven de standaardafwijking meer dan 3 putten. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig7.jpg" alt="Figuur 7"/> Figuur 7. Antilichaam-gebaseerde reeks expressie analyse van EMT inductie. Lysaten uit A549 (A en C) en MCF7 (B en D) cellen gekweekt met of zonder EMT opwekken Media Supplement werden gebruikt voor array-analyse met behulp van Proteome Profiler menselijk fosfo-MAPK Array Kit. Locaties gemarkeerd A en B werden daarna gekwantificeerd met densitometrie. Vergelijkingen van niet-geïnduceerde naar EMT-geïnduceerde lysaten worden weergegeven in de bijbehorende balk grafieken hieronder (C en D). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50478/50478fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding &lt;bekijken</a>/ A&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition Video at JoVE.com

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition Video (Video) | JoVE

Een eenvoudige werkwijze beschreven voor de inductie van epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) in verschillende celtypen. Methoden voor de analyse van cellen in EMT toestanden met immunocytochemie inbegrepen.

Inductie en analyse van epitheliale naar mesenchymale transitie

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Research

JoVE Journal

Biology

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Light/dark Transition Test for Mice

Light/dark Transition Test for Mice Video (Video) | JoVE

Licht / donker Overgang test voor Muizen

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity Video (Video) | JoVE

Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis Video (Video) | JoVE

Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP Video (Video) | JoVE

Chromatine Isolatie door RNA-zuivering (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration Video (Video) | JoVE

Snelle Genetische analyse van epitheliale-mesenchymale signalering tijdens haar regeneratie

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor Video (Video) | JoVE

Isolatie en Cultuur van Dental epitheliale stamcellen van de volwassen muis Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition Video (Video) | JoVE

Detectie van alternatieve splicing Tijdens-mesenchymale transitie

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Manipulating the Murine Lacrimal Gland Video (Video) | JoVE

Het manipuleren van de muizen traanklier

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa Video (Video) | JoVE

Cryosectioning Methode voor Microdissection van Murine colonslijmvlies

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model Video (Video) | JoVE

Magnetische-geactiveerde cel sorteren van strategieën om te isoleren en zuiveren van de synoviale vloeistof afkomstige mesenchymale stamcellen uit het Model van een konijn

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...