Name: induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition
Uploaded: 2013-08-27T12:00:00
Duration: 10 min 37 s
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Die Autoren bedanken sich bei Julia und Martin Hatler Ramsden (R &amp; D Systems) für hilfreiche Diskussionen und Manuskript Kritik bestätigen.

1. Die Induktion der EMT <ol><li> Warmen Kulturmedium auf 37 º C in einem Wasserbad. Das verwendete Kulturmedium ist das gleiche wie für den Standard-Kultur von den Zellen von Interesse verwendeten Medien. Zum Beispiel wird die A549 humanen Lungenkarzinomzelllinie in Kaighn F12 mit 10% fötalem Rinderserum und 2 mM Glutamin gezüchtet. </li><li> Ernten Sie die Zellen von Interesse mit einem Dissoziation Lösung (zB TrypLE Express). </li><li> Suspend-Zellen in vorgewärmten Kulturmedium in einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren der Zellsuspension bei 400 × g für 5 min. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Eingießen in einen Abfallbehälter. </li><li> Hängen Sie das Zellpellet in vorgewärmten Kulturmedien. </li><li> Count lebensfähiger Zellen mit Trypan-Blau. Entfernen einer Probe der Zellsuspension und 0,4% Trypanblau-Lösung zu verdünnen. Platz 10 ul der verdünnten Probe auf einer Zählkammer und zählen lebensfähigen Zellen (Zellen, die nicht erscheinen, blau). Verwenden Zellzahlen, um die Zelle zu bestimmen, dichte in Ihre Lösung. </li><li> Platten Zellen auf Gewebekultur-behandelten Platten oder Kolben bei 0,9-1,0 × 10 4 Zellen pro cm 2. Beispielsweise 0,5 × 10 6 Zellen in einer 100 mm-Platte in Kulturmedien, enthaltend 1X EMT Induktionsmedium Zusatz (6 ml Medium pro 100 mm-Platte) plattiert. </li><li> Kultur plattierten Zellen in einem 37 ° C / 5% CO 2-Inkubator. Überwachung der Zellmorphologie täglich. </li><li> Drei Tage nach der Plattierung, entfernen Medien und ersetzen mit frischem vorgewärmten Kulturmedien, die 1X EMT Inducing Medien Ergänzung. Weiterhin Kultur in ein 37 ° C / 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Fünf Tage nach der Beschichtung, sind Zellen für die Analyse bereit. Zellmorphologie durch invertierte Lichtmikroskopie sichtbar. </li></ol> 2. Analyse der Proteinexpression durch Immunzytochemie <ol><li> Vorbereitung sterile 12 mm Deckgläsern für eine 24-Well-Platte, indem Deckgläschen in einer Petrischale mit 95% Ethanol. Deckgläser vorsichtig entfernen aus Ethanol unsten einer Nadel und einer gebogenen Pinzette und Flamme sterilisieren. Zeigen sterilen Deckglas in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte. Wiederholen Sie mit den restlichen Deckgläser. </li><li> Bereiten Sie die Zellsuspension, wie in Abschnitt 1.1 beschrieben - 1.7. </li><li> Platte 1,6 x 10 4 Zellen / Vertiefung in 0,5 ml vorgewärmten Kulturmedien, die 1X EMT Inducing Medien Ergänzung. </li><li> Wachsen und ernähren Zellen wie in den Abschnitten 1.9 beschrieben - 1.11. </li><li> Fünf Tage nach dem Ausplattieren, wird das Medium entfernt und die Zellen zu fixieren mit 300 &amp;mgr; l / Vertiefung von 4% Paraformaldehyd in 1 × phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> Fixiermittel entfernen und spülen Zellen 2x mit 1x PBS, 500 ul /. </li><li> Inkubieren Zellen in 400 &amp;mgr; l / Vertiefung Blockierungspuffer (1 × PBS, das 1% Rinderserumalbumin (BSA), 10% normalem Eselserum und 0,3% Triton X-100) für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubation in primären Antikörpers an Hersteller empfohlenen Konzentration in 400 ul / Blocking-Puffer für 3 Stunden bei Raumtemperature oder über Nacht bei 4 ° C. Bei Verwendung eines primären Antikörper direkt an ein Fluorochrom konjugiert ist, inkubiert Proben im Dunkeln. </li><li> In 500 &amp;mgr; l / Vertiefung 1 × PBS mit 0,1% BSA für 5 min bei jedem Waschwäsche Zellen dreimal. Bei Verwendung eines primären Antikörper direkt mit einem Fluorochrom konjugiert, gehen Sie direkt zu Schritt 2.12. </li><li> Zellen in sekundären Antikörper inkubieren bei vom Hersteller empfohlenen Konzentration in 400 ul / Vertiefung 1 × PBS, das 1% BSA für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> In 500 &amp;mgr; l / Vertiefung 1 × PBS mit 0,1% BSA für 5 min bei jedem Waschwäsche Zellen dreimal. </li><li> Wenn gewünscht, Gegenfärbung Kerne mit DAPI-Lösung. </li><li> Spülen Zellen in VE-Wasser und montieren Deck Gesicht nach unten auf einem Objektträger mit Montage Medien. </li></ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+changes+in+receptor+tyrosine+kinase+phosphorylation+using+antibody+arrays.">Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li></ol>

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Bisherige Verfahren zur Induktion EMT haben im Allgemeinen verwendet, TGF-β Stimulation oder genetische Veränderung. Obwohl TGF-β allein hat sich gezeigt, EMT in einigen Zelltypen induzieren, wurde nun gezeigt, dass TGF-β für EMT notwendig ist, aber es genügt nicht in allen Zelltypen 6,14. Mit genetischen Modifikation für EMT Induktion ist zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Das hier beschriebene Verfahren verwendet eine Kombination von Faktoren, einschließlich, Anti-Human-E-Cadherin-, anti-human sFRP-1, Anti-Human-Dkk-1, rekombinantes humanes Wnt-5a und rekombinantes menschliches TGF-β1, zuverlässig herbei EMT. Diese Kombination von Faktoren ist für die E-Cadherin-basierten Haftung, einen entscheidenden Schritt für EMT Induktion 4 zu blockieren, und verbessern Wnt-Signalweg durch Hinzufügen des Wnt-5a-Protein als auch mit blockierende Antikörper gegen den Wnt-Inhibitoren, sFRP-1 und Dkk -1. Wnt-und TGF-β-Signalisierung wurde gezeigt, dass in einer autokrinen Schleife dienen zur Einleitung und Aufrechterhaltung der mesenchymalen Zell state 6. Dieses Verfahren vermeidet Induktions Genmanipulation und ist effektiver als die Verwendung von TGF-β allein. Wichtig ist, dass wir in der Lage, die Induktion der EMT in Zelltypen zu beobachten, einschließlich MCF7 und PANC-1-Zellen, die zuvor gezeigt wurde, nicht nur auf die TGF-β Stimulation reagieren (Fig. 5) 14. Zellen mit EMT-Inducing Medien Supplement zeigen weniger kompakt und erhöhte spindelförmige Morphologie (Abbildung 1) behandelt. Zusätzlich gibt es eine Abnahme der Oberflächen E-Cadherin-Expression gleichzeitig mit einem Anstieg der Fibronektin, das Markenzeichen von EMT (Fig. 2 und 3) sind. Zusätzliche mesenchymalen Marker wie Vimentin und Schnecke sind auch in den EMT induzierten Zellen im Vergleich zu nicht-induzierten Kontrollen (Fig. 4) hochreguliert. Erhöhte Migration und Invasion Fähigkeiten sind die wichtigsten Funktionsmerkmale von mesenchymalen Zellen. In in vitro </em&gt; Migration und Invasion Assays Zellen mit EMT-Inducing Medien Supplement behandelt wurden, zeigten eine deutlich erhöhte Kapazität zur Migration und dringen (Abbildung 6). Diese einfache Methode zur Induktion EMT ist nützlich für die Untersuchung der EMT Signalgebung mit den Antikörperarray-Expressionsdaten in Fig. 7 gezeigt, dargestellt. Verschiedene Zelltypen können pre-und post-EMT Induktions verglichen werden, um gemeinsame Expression Signaturen mit EMT verbunden sind, wie die Erhöhung der phosphorylierte CREB und ERK1 / 2 in sowohl MCF7 und A549 EMT-induzierten Zellen gesehen zu erhalten. S133 Phosphorylierung von CREB stimuliert die DNA-Bindung und hat sich gezeigt, stromabwärts von TGF-β1-induzierten EMT 15 zu wirken. ERK1 / 2 Phosphorylierung wurde auch gezeigt, stromabwärts von TGF-β1-induzierten EMT 16 zu wirken. Unterschiede in der Signalwege zwischen den Zellen-Typen können auch erläutert, wie mit der Zunahme der GSK-3β-Phosphorylierung in A549 Zellen gegenüber p70S6 sehenK-Phosphorylierung in MCF7. GSK-3β-Phosphorylierung an Serin 9 verringert sie Funktion und GSK-3β ist gezeigt worden, um die pro-EMT-Transkriptionsfaktor, Schnecke 17 zu verhindern. Im Gegensatz dazu induziert p70S6K Snail Tätigkeit und deren Phosphorylierung wird mit der Aktivierung dieses Proteins 18 zugeordnet. Insgesamt einfache und sichere Induktion der EMT, insbesondere in bisher nicht gezeigt, um sich ausschließlich auf TGF-β-Zellen reagieren, ist für das Verständnis der Biologie von EMT, Festlegung gemeinsamer Ausdruck Signaturen für die Verwendung als prognostische Marker, und die Entwicklung und Evaluierung neuer Therapeutika für Krebs und fibrotischer Erkrankung.

Epitheliale mesenchymale Transition (EMT) ist der Prozess, durch den eine polarisierte Epithelzelle erfährt eine Vielzahl von Änderungen, die sich in einer sehr beweglich, Fibroblasten-ähnliche Zellen mesenchymalen. Dieser Prozess erfolgt zum Teil durch Veränderungen der Genexpression und der Degradation von Adhärenzverbindungen, was zu einer erhöhten Fähigkeit zu migrieren und zu erobern. Physiologisch EMT spielt eine wichtige Rolle während der embryonalen Entwicklung und Wundheilung. Verlust der Kontrolle über die richtige EMT kann zur Fibrose und Metastasierung von Karzinomen 1,2 führen. Die Reduktion von E-Cadherin auf der Oberfläche der Epithelzellen ist ein kritischer Schritt in der Progression einer Zelle durch EMT 3,4. E-Cadherin ist ein Single-Pass-Transmembranprotein, das direkt mit Cadherin Proteine ​​auf benachbarten Zellen interagiert. Zusätzlich zu seiner Rolle bei der Zelladhäsion, E-Cadherin Einflüsse Zellsignalisierung über Wechselwirkungen zwischen dem zytoplasmatischen Schwanz von E-Cadherin einda Vielzahl von regulatorischen Proteinen, insbesondere β-Catenin. β-Catenin spielt eine Rolle bei der Stabilisierung der Adhärenzverbindungen. Während der Wnt-Signalisierung wird β-Catenin von E-Cadherin freigegeben und an den Kern, wo es als ein Transkriptionsfaktor, der stromabwärts des Wnt-Signalwegs 3,4,5 wirkt transloziert. Im Zellkern ist β-Catenin wurde gezeigt, dass die Transkription von mehreren EMT bezogene Faktoren wie Twist, Slug, Fibronektin, und eine Vielzahl von Matrix-Metalloproteasen 3,6 zu erhöhen. Neben Wnts hat TGF-β Signal gezeigt worden, um eine bedeutende Rolle bei EMT Induktion sowohl während der normalen Entwicklung und bei Krankheitszuständen 7,8,9 spielen. TGF-β ist in der EMT, die während der Gaumen Bildung und in der Entwicklung von Herz 10 tritt beteiligt. Es hat sich auch in Fibrose und in der Krebsprogression zur Metastasierung 7 in Verbindung gebracht. Das hier beschriebene Verfahren provides konsistente Induktion der EMT in einer Vielzahl von Zelltypen ohne genetische Manipulation. Dieses Verfahren verwendet eine Mischung aus E-Cadherin, sFRP-1 und Dkk-1-blockierende Antikörper und Wnt-5a und TGF-β1 rekombinanten Proteinen. Dieser Cocktail ist für die E-Cadherin-basierten Haftung zu blockieren und gleichzeitig die Wnt-und TGF-β-Signalisierung. Die Fähigkeit für robuste EMT Induktion ist entscheidend für das Verständnis der Biologie dieser Prozess und wie man sie für therapeutische Zwecke zu manipulieren. Strom gemeinsam Marker der EMT, E-Cadherin (in EMT herunterreguliert) und Vimentin (in EMT hochreguliert), können gefunden werden in Krebs co-exprimiert und somit nicht bieten die besten Diagnosemarker von potentiellen metastatischen Zellen 12. Wichtiger ist, ist die Analyse von einer Vielzahl von Zelltypen, EMT laufen haben nützliche gemeinsame Genexpression Signaturen, die für diagnostische Zwecke bei Krebs und Fibrose 11 eingesetzt werden können. Zusätzlich haben neuere Studien gezeigt, dass EMT kann eine Rolle bei der Bildung von Krebs-Stammzellen zu spielen, was darauf hindeutet, dass Zellen, die EMT durchlaufen haben kann für Wirkstoff-Screening sein, um Verbindungen, die diese Zielzellen kann 13 zu identifizieren.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Epithelial cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT Inducing Media Supplement</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CCM017</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&beta;1</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>240-B</td>
			<td>Used at 10ng/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL648R</td>
			<td>Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin </td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1838</td>
			<td>Used at 0.1 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Fibronectin</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1918</td>
			<td>Used at 10 &mu;g/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>AF5718</td>
			<td>Used at 0.2 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL009</td>
			<td>Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF109</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF007</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>SC026</td>
			<td>Used according to the manufacturer's instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96 Well BME Cell Invasion Assay</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>3455-096-K</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>ARY002B</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations19.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting Media</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CTS011</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15350-061</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>789-704</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fine pointed curved forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>12 mm coverslips</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>633009</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used at 5% in TBST for blocking in western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting blocking and washing</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-20% SDS-page gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plates/flasks, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>24-well plates, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipettes / pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet Aid / pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C/5%CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition

Epitheliale mesenchymale Transition (EMT) ist für die richtige Morphogenese während der Entwicklung. Fehlregulation dieses Prozesses wurde als ein Schlüsselereignis in der Fibrose und der Progression von Karzinomen zu einem metastasierten Zustand gebracht worden. Das Verständnis der Prozesse, die EMT zugrunde liegen, ist für die Frühdiagnose und klinische Kontrolle dieser Krankheitszustände Imperativ. Zuverlässige Induktion der EMT in vitro ist ein nützliches Werkzeug für die Wirkstoffforschung sowie zur gemeinsamen Genexpressionssignaturen für diagnostische Zwecke zu identifizieren. Hier zeigen wir ein einfaches Verfahren für die Induktion der EMT in einer Vielzahl von Zelltypen. Verfahren zur Analyse von Zellen, prä-und post-EMT-Induktion durch Immunzytochemie sind ebenfalls enthalten. Darüber hinaus zeigen wir die Wirksamkeit dieser Methode durch Antikörper-basierten Array-Analyse und Migration / Invasion Assays.

. EMT Induzieren hier beschriebenen Kulturbedingungen eine robuste Methode zur Induktion von EMT in einer Vielzahl von Zelltypen 1 und 2 zeigen die Morphologie und Markerexpressionsniveaus für 4 verschiedenen menschlichen Zelllinien: T98G-Glioblastomzellen, Kolon-Adenokarzinom-Zellen HT29 , A549-Lungenkarzinomzellen und MCF10A Brustepithelzellen. Zellen, die mit der EMT Inducing Medien Supplement behandelt wurden, änderte sich von einem klassischen epithelialen Morphologie (den 1A - 1D) zu einem mesenchymalen, spindelförmige Morphologie (1E - 1H). EMT-induzierten Zellen erschien im Vergleich zu nicht-induzierten Zellen weniger dicht in engen Kolonien verpackt. Nicht-induzierten MCF10A Proben enthielten dicht gepackten Clustern lockerer gepackten Zellen umgeben. Diese dicht gepackten Clustern waren E-Cadherin-positiven (2D) und verschwanden nach Behandlung mit der EMT Inducing Medien Supplement (2H). EMT wurde auch durch die Herunterregulierung von epithelialen Marker und Hochregulation von mesenchymalen Marker bewertet. Die Herunterregulierung von E-Cadherin-Expression ist in der Regel folgende EMT Induktion in verschiedenen Zelltypen beobachtet 3,4 Abbildung 2 zeigt die Oberflächenexpression von E-Cadherin in der Mehrzahl von unbehandelten Zellen (Fig. 2A - 2D; rot). Im Vergleich zu seiner Abwesenheit nach EMT Induktion (2E - 2H, rot). Eine Zelllinie T98G, wurde festgestellt, einen extrem niedrigen Basisniveau von E-Cadherin vor EMT Induktion, die ihre Analyse ausgeschlossen haben. Hochregulation von mesenchymalen Marker, Fibronektin, war auch nach der Induktion mit der EMT Inducing Medien Supplement (Figuren 2A - 2D gegenüber 2E - 2H, grün) sichtbar. Die Expression von E-Cadherin und Fibronectin durch Immunzytochemie gesehenwurden ferner durch Western-Blot von Gesamtzell-Lysaten (Fig. 3) bestätigt. Der Western-Blot bestätigt Herunterregulierung von E-Cadherin und Hochregulation von Fibronektin-Expression durch Immunzytochemie gesehen. Die Banden wurden mit Densitometrie und normiert auf GAPDH, um die relative Veränderung nach EMT fach Induktion bestimmen quantifiziert. E-Cadherin-Spiegel wurden 6,4 und 3,4 fach in A549 und MCF10A Zellen reduziert sind. Fibronektin-Spiegel wurden um 4,6, 4,1 und 2,3-fach in T98G, A549 und MCF10A-Zellen. Obwohl die Western-Blot keine signifikante Reduktion von E-Cadherin-Protein-Spiegel in HT29-Zellen nach Induktion EMT zeigen die immunzytochemischen Ergebnisse zeigen eine Verringerung in der Oberflächenexpression von E-Cadherin (2B gegen 2F), die nicht in unterscheiden ist Western Blot von Gesamtzell-Lysaten. Um weiter zu evaluieren EMT-Status, weitere bekannte Markers für EMT wurden analysiert, Pre-und Post-EMT-Induktion. In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen wurde E-Cadherin in allen untersuchten Zelllinien herunterreguliert, was darauf hinweist, dass EMT induziert. Darüber hinaus sind die mesenchymalen Marker Vimentin und Schnecke, wurden in A549, T98G und MCF10A Zellen nach der Behandlung mit EMT Inducing Medien Supplement (Abbildung 4) hochreguliert. Die HT29-Zelllinie hat (Daten nicht gezeigt) nicht Ausdruck dieser mesenchymalen Marker entweder mit oder ohne Induktions EMT zeigen, was darauf hindeuten kann, dass diese Zellen nutzen alternative Wege für die EMT-Induktion. Obwohl TGF-β ausreicht, um EMT in bestimmten Kontexten 7,8,9 Zelle induzieren, haben die anderen Zelltypen nicht nur reagieren auf die Zugabe von TGF-β 14. MCF7-Brustkrebszellen und PANC-1-humane Pankreas-Karzinom-Zellen sind sowohl gemeldet nicht auf TGF-β Signal allein 14 reagieren. Um festzustellen, ob die beiden Linien konnte EMT in vitr unterzieheno, wurden die Zellen in Gegenwart des EMT Induktionsmedium kultiviert Supplement. Die Zellen wurden mit rekombinantem TGF-β1 allein angeregt, bei der Konzentration im Medien EMT Inducing Ergänzung. Diese Zellen behielten ihre epitheliale Morphologie, bestehend aus dicht gepackten Kolonien von Zellen (Daten nicht gezeigt) und Oberflächen E-Cadherin-Spiegel wurden ähnlich denen in den Kontrollzellen beobachtet (Fig. 5C und 5D gegenüber den Fig. 5A und 5B). Im Gegensatz dazu zeigten Zellen mit EMT-Induktionsmedium Supplement stimuliert eine drastische Abnahme der Oberflächen E-Cadherin-Ebenen (Fig. 5E und 5F). Diese Zellen erhalten auch eine mesenchymale Morphologie, wie Zellen wurde weniger kompakter und spindelförmigen (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass die hier beschriebenen Verfahren EMT induzieren kann EMT Morphologie und Markerexpression Veränderungen in Zellen typischerweise beständig gegen TGF-β-i Förderungnduced EMT. Zusätzlich zu den Veränderungen in der Marker-Ausdruck ist ein weiteres Markenzeichen von mesenchymalen Zellen ihre Fähigkeit zu wandern und zu erobern. Migration und Invasion von Zellen mit oder ohne Ergänzung EMT induzierenden Medien wurden unter Verwendung des 96-Well-Zellinvasion BME Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert kultiviert. Kurz gesagt wurden die Zellen auf 96-Well-Platten ausgesät (50000 Zellen / Vertiefung), die Filtereinsätze mit 8,0 &amp;mgr; m Poren. Nach 48 h wurde die Migration von Calcein AM-Färbung der Zellen, die durch das Filter gewandert waren, beurteilt. Jede Probe wurde dreifach zweimal mit ähnlichen Ergebnissen getestet. Repräsentative Ergebnisse eines Experiments sind in Fig. 6A gezeigt. Statistisch signifikanter Anstieg (P-Wert &lt;0,003) bei der Zellmigration wurden sowohl mit A549 und PANC-1-Zellen nach Induktion EMT gesehen. Um die Fähigkeit dieser Zellen einzudringen (dh wandern durch extrazelluläre Matrix) zu bewerten, wurde dieselbe Analysemit einer Basalmembran-Extrakt-beschichteten Filter durchgeführt. EMT-induzierten Zellen zeigten eine statistisch signifikante (p-Wert &lt;0,001) Anstieg der Invasion Fähigkeiten im Vergleich zu unbehandelten Zellen, wie in Fig. 6B zu sehen. Die robuste Induktion von EMT ist nützlich für die Analyse von Veränderungen der Genexpression und Signalisierung, die sich in diesen Zellen. Antikörper-basierte Array-Analyse unter Verwendung von Lysaten von beiden behandelten und unbehandelten Zellen ist eine Methode, um die Expressionsniveaus von einer Vielzahl von Molekülen in einer einzelnen Probe zu analysieren. Als ein Beispiel, analysierten wir die Ebenen der phosphorylierten MAPK Familienmitglieder in Lysaten aus nichtinduzierten und EMT-induzierten MCF7 und A549-Zellen unter Verwendung des Proteome Profiler Menschen Phospho-MAPK-Array-Kit. Das Array wurde zweimal aus unabhängigen EMT-Induktion Behandlungen mit ähnlichen Ergebnissen führen. Abbildung 7 zeigt repräsentative Daten von einem Array. Beide Zelltypen zeigten erhöhte Phosphorylierung von CREB (S133), ERK1 (T2<html> 02/Y204) und ERK2 (T185/Y187) in EMT-induzierten Zellen im Vergleich zu Kontrollen. Unterschiede in der Signalereignisse wurden zwischen den beiden Zelltypen ebenso beobachtet. A549-Zellen zeigten einen Anstieg der GSK-3-β (S9) Phosphorylierung, während MCF7-Zellen zeigten erhöhte p70S6K (T421/S424) Phosphorylierung. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1.jpg" alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1highres.jpg" fo:width="6in"/> Fig. 1 ist. Mesenchymale Morphologie Induktion nach Stimulation mit dem EMT Inducing Medien Supplement (A - D). Epitheliale Morphologie in den vier Zelltypen angegeben folgenden Kultur für 5 Tage im Standard-Kulturmedien ohne die EMT Inducing Medien Supplement (E - H). Mesenchymalen Morphologie in der vier Zelltypen angegeben mit der EMT Inducing Medien Ergänzung für 5 Tage kultiviert. nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2.jpg" alt="Figur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2highres.jpg" fo:width="6in"/> 2. Herabregulierung von epithelialen Marker-Expression und Hochregulation von mesenchymalen Marker-Expression in EMT-induzierten Zellen. Zellen wurden durch Immunfluoreszenz angefärbt, um die Expression des epithelialen Marker, E-Cadherin (rot) zu erfassen, und die mesenchymalen Marker, Fibronectin (grün). (A - D) Kontrollzellen ohne die EMT Inducing Medien Ergänzung für 5 Tage kultiviert (E -. H) Zellen mit EMT-Inducing Medien Ergänzung für 5 Tage kultiviert. Alle Zellen sind mit DAPI (blau) gegengefärbt. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig3.jpg" alt="Fig. 3"/> 3. Bestätigung der epithelialen und mesenchymalen Marker Ausdruck mit Western-Blot ein<html> . alysis Western-Blot von Gesamtzell-Lysaten der vier Zelltypen angegeben, mit (EMT) oder ohne behandelt (-) der EMT Inducing Medien Ergänzung für 5 Tage. Bands für E-Cadherin, Fibronektin und GAPDH Ladekontrolle sind auf der linken Seite angezeigt. Die Größenmarker ist auf der rechten Seite angegeben. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig4.jpg" alt="Fig. 4"/> 4. Hochregulation der mesenchymalen Marker Vimentin und Schnecke im EMT-induzierten Zellen. Zellen wurden durch mehrfarbige Immunfluoreszenz angefärbt, um die Expression des epithelialen Marker, E-Cadherin (grau) erkennen und die mesenchymalen Marker Vimentin (grün) und Schnecke (rot) . (A - C) Kontrollzellen ohne die EMT Inducing Medienzusatz für 5 Tage kultiviert. (D - F) Zellen mit EMT-Inducing Medien Ergänzung für 5 Tage kultiviert. mmer &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5.jpg" alt="Figur 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5highres.jpg" fo:width="6in"/> 5. Induktion der EMT in TGF-β1 nicht-ansprechenden Zellen. (A und B) Zellen, die mit Medium allein für 5 Tage kultiviert. (C und D)-Zellen in Medium, enthaltend 10 ng / ml TGF-β1 für 5 Tage kultiviert. (E und F) Zellen in EMT Inducing Medien Ergänzung für 5 Tage kultiviert. Alle Zellen sind für die E-Cadherin-Expression (rot) gefärbt und mit DAPI (blau) gegengefärbt. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig6.jpg" alt="Fig. 6"/> 6. EMT-induzierten Zellen Migration und Invasion Kapazitäten erhöht. A. Anzahl der Zellen, die durch eine 8 um Porenfilter nach Inkubation für 48 h migriert. B. Durchschnittliche Anzahl derZellen, die in der Lage, durch eine 8 um Porenfilter mit Basalmembran-Extrakt nach Inkubation für 48 h beschichtet waren einzudringen. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung über 3 Brunnen. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig7.jpg" alt="Fig. 7"/> Abbildung 7. Antikörper-basierten Array-Expressionsanalyse von EMT-Induktion. Lysate aus A549 (A und C) und MCF7 (B und D) Zellen mit oder ohne EMT Inducing Medien Supplement kultiviert wurden, wurden für die Array-Analyse unter Verwendung der Proteome Profiler Menschen Phospho-MAPK-Array-Kit verwendet. Flecken markiert A und B wurden dann unter Verwendung Densitometrie quantifiziert. Vergleiche der un-induzierte EMT-induzierten Lysate werden in den entsprechenden Balken unten (C und D) gezeigt. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50478/50478fig7large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung &lt;sehen</a>/ A&gt;.

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Ein einfaches Verfahren ist für die Induktion von epithelialen mesenchymale Transition (EMT) in einer Vielzahl von Zelltypen beschrieben. Methoden zur Analyse von Zellen in EMT-Staaten durch Immunzytochemie sind enthalten.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

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