Name: induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition
Uploaded: 2013-08-27T12:00:00
Duration: 10 min 37 s
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저자는 도움이 토론과 원고 검토를 위해 줄리아 Hatler 마틴 Ramsden (R &amp; D 시스템)을 인정하고 싶습니다.

1. EMT 유도 <ol><li> 물을 욕조에 37 ° C 따뜻한 문화 미디어. 사용되는 배양 배지는 관심의 세포의 표준 배양에 사용되는 미디어와 동일합니다. 예를 들어, A549 인간 폐 암종 세포주는 10 % 소 태아 혈청 및 2mM의 글루타민 Kaighn의 F12에서 성장된다. </li><li> 해리 용액 (예를 들어 TrypLE 익스프레스)를 사용하여 그 수확 세포. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 미리 예열 문화 매체에있는 세포를 일시 중단합니다. </li><li> 5 분 동안 400 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 폐기물 용기에 부어 뜨는을 제거합니다. </li><li> 예열 된 배양 배지에서 세포 펠렛을 중지. </li><li> 트리 판 블루를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다. 세포 현탁액의 샘플을 제거하고, 0.4 % 트리 판 블루 용액으로 희석. 혈구에 희석 된 샘플의 10 μl를 놓고 가능한 세포 (파란색 설정하지 않는 세포)를 계산합니다. 셀 D를 결정하는 세포 수를 사용솔루션의 ensity. </li><li> 조직 문화 위에 플레이트 세포는 cm 2 당 0.9-1.0 × 10 4 세포를 플레이트 또는 플라스크를 처리. 예를 들어, 0.5 × 10 6 세포는 1X EMT 유도하는 미디어 보조 식품 (6 ㎖의 미디어 100mm 플레이트 당)를 포함하는 배지에서 100 mm 플레이트에 도금했다. </li><li> 문화는 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에서 세포를 도금했다. 매일 세포 형태를 모니터링합니다. </li><li> 사흘 도금 후, 미디어를 제거하고 1X EMT 유도하는 미디어의 보충을 포함하는 신선한 예열 문화 용지로 교체합니다. 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에서 배양을 계속합니다. </li><li> 닷새 도금 후, 세포 분석을위한 준비가되어 있습니다. 세포 형태는 거꾸로 빛을 현미경으로 시각화됩니다. </li></ol> 2. 면역 세포에 의해 단백질 발현 분석 <ol><li> 95 % 에탄올을 포함하는 배양 접시에 커버 슬립을 배치하여 24 - 웰 플레이트에 살균 12mm 커버 슬립을 준비합니다. 조심스럽게 우리 에탄올에서 커버 슬립을 제거바늘과 곡선 집게와 화염 소독을 보내고. 24 웰 플레이트 잘 하나에 멸균 커버 슬립을 놓습니다. 나머지 커버 슬립으로 반복합니다. </li><li> 1.7 - 1.1 절에 설명 된대로 세포 현탁액을 준비합니다. </li><li> 플레이트 1.6 × 10 4 세포 / 웰 0.5 ML 1X EMT 유도하는 미디어의 보충을 포함 예열 문화 미디어. </li><li> 성장과 섹션 1.9에 설명 된대로 세포를 공급 - 1.11. </li><li> 닷새 도금 후, 미디어를 제거하고 실온에서 20 분 동안 1X 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에 300 μL / 웰의 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정합니다. </li><li> 정착액을 제거하고 세포가 1X PBS 500 μL / 잘으로 2 배 헹군다. </li><li> 차단 완충액 400 μL / 웰에서 세포를 배양한다 실온에서 1 시간 동안 (1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 10 %의 정상 당나귀 혈청, 0.3 % 트리톤 X-100을 포함하는 1X PBS). </li><li> 제조업체에서 일차 항체에 품어 객실 temperatur를에서 3 시간 동안 버퍼를 차단하는 잘 개 / μL의 농도를 추천전자 또는 4 박 ° C에서 직접 형광 색소에 접합 차 항체를 사용하면, 어두운 곳에서 샘플을 배양한다. </li><li> 각 세척 5 분 동안 0.1 % BSA를 포함하는 1X PBS 500 μL / 잘 세포를 세 번 씻으십시오. 직접 형광 색소에 접합 차 항체를 사용하는 경우, 2.12 단계로 바로 진행한다. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 1 % BSA를 포함하는 1X PBS 400 μL / 웰의 제조업체에서 권장하는 농도 차 항체에 세포를 품어. </li><li> 각 세척 5 분 동안 0.1 % BSA를 포함하는 1X PBS 500 μL / 잘 세포를 세 번 씻으십시오. </li><li> 원하는 경우, DAPI 용액 핵 counterstain. </li><li> 탈 이온수에서 세포를 씻어 커버 슬립이 설치 미디어를 사용하여 슬라이드에 얼굴을 아래로 탑재합니다. </li></ol>

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	<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition.">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li><li>Thiery, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions+in+tumour+progression.">Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression.</a> Nature Reviews Cancer. 2, 442-454 (2002).</li><li>Heuberger, J., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+cadherin-mediated+cell+adhesion+and+canonical+Wnt+signaling.">Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 1-23 (2010).</li><li>Onder, T. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+changes+in+receptor+tyrosine+kinase+phosphorylation+using+antibody+arrays.">Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li></ol>

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EMT 유도에 대한 이전의 방법은 일반적으로 TGF-β 자극 또는 유전자 조작을 사용했습니다. 단독으로 TGF-β는 일부 세포 유형에서 EMT를 유도하는 것으로 하였지만, 지금은 TGF-β가 EMT에 필요한 것을 설명 하였지만, 이는 모든 세포 유형 6,14에 충분하지 않다. EMT 유도를 위해 유전자 조작을 사용하면 시간과 노동 집약적이다. 여기서 설명한 방법은 항 - 인간 E-카드 헤린, 항 인간 sFRP-1, 항 인간 DKK-1, 재조합 인간로 Wnt-5A하여 확실 EMT를 유도하는 재조합 인간 TGF-β1 등 요인의 조합을 사용한다. 요소의 조합은 E-카드 헤린 계 접착 EMT 유도 사를위한 중요한 단계를 차단하도록 설계로 Wnt-5A 단백질을 추가 할뿐만 아니라 Wnt의 억제제로 차단하는 항체를 이용하여 Wnt의 시그널링을 보강하고, sFRP-1 DKK -1. 로 Wnt 및 TGF-β 신호가 중간 엽 세포의 합계를 유도하고 유지하기 위해 분비 루프에서 역할을하는 것으로 나타났다전자 6. 이 유도 방식은 유전자 조작을 방지하고 혼자 TGF-β를 사용하는 것보다 더 효과적입니다. 중요한 사실은, 우리는 이전에 (그림 5) 14 TGF-β 자극에만 반응하지 않는 것으로 나타났다 MCF7 및 PANC-1 세포를 포함한 세포 유형에 EMT의 유도를 관찰 할 수 있습니다. EMT 유도하는 미디어 보충 쇼 이하 소형 증가 스핀들 모양의 형태 (그림 1)로 처리 된 세포. 또한 EMT (도 2 및도 3)의 특징입니다 피브로넥틴 발현의 증가와 함께 표면 E-cadherin의 동시 발현의 감소가있다. 이러한 멘틴과 달팽이 등의 추가 중간 엽 마커는 uninduced 컨트롤에 비해 EMT 유도 세포 (그림 4)에서 상향 조절된다. 향상된 이주 및 침윤 능력은 중간 엽 세포의 주요 기능적 특성이다. 체외에서 </em&gt; 마이그레이션 및 침입 분석은 EMT 유도하는 미디어의 보충으로 처리 된 세포는 (그림 6)를 마이그레이션하고 침략 크게 증가 능력을 보여 주었다. 그림 7과 같이 항체 어레이 발현 데이터를 사용하여 설명 된대로 EMT 유도를위한이 간단한 방법은 EMT 신호의 연구에 유용합니다. 상이한 세포 유형은 인산화 된 CREB의 증가 및 MCF7 및 A549의 EMT-유도 된 세포 모두에서 볼 ERK1 / 2와 EMT와 연관된 일반적인 식 서명을 구하는 전후 EMT 유도를 비교할 수있다. CREB의 S133 인산화 바인딩 DNA를 자극하고 TGF-β1에 의한 EMT (15)의 하류 행동을 보였다. ERK1 / 2의 인산화는 TGF-β1에 의한 EMT (16)의 하류 행동을 보였다. p70S6 대 A549 세포에서 GSK-3β 인산화의 증가와 같이 세포 유형 사이에서 신호 전달 경로의 차이도 설명 될 수있다MCF7에서 K 인산화. 세린 9에서 GSK-3β 인산화는 기능을 감소하고, GSK-3β는 프로 EMT 전사 인자, 달팽이 17을 억제하기 위해 표시되었습니다. 반면, p70S6K 달팽이 활동을 유도하고 인산화는이 단백질 18의 활성화와 연결되어 있습니다. 전반적으로, 특히 이전에 단독으로 TGF-β에 응답하지 않는 같이 세포 EMT의 간단하고 신뢰할 수있는 유도, EMT의 생물학을 이해 예후 마커로 사용하기 위해 일반적인 표현의 서명을 확인하고, 암에 대한 새로운 치료제를 개발하고 평가하는 데 유용합니다 및 섬유 성 질병.

중간 엽 전이 (EMT)에 상피는 편광 상피 세포는 높은 운동성, 섬유 아세포와 같은 중간 엽 세포의 결과로 다양한 변화를 겪게되는 과정이다. 이 프로세스는 마이그레이션 침공 증가 능력으로 인해, 유전자 발현 변화하고있는 adherens 접속점의 분해를 통해 부분적으로 발생한다. 생리 학적으로, EMT는 배아 발달과 상처 치유 동안 중요한 역할을한다. EMT에 적절한 제어의 손실 섬유증 및 암 1,2의 전이로 이어질 수 있습니다. 상피 세포의 표면 상에 E-카드 헤린의 감소는 EMT 3,4 통해 셀의 진행에 중요한 단계이다. E-카드 헤린 직접 인접 셀에 카데 단백질과 상호 작용하는 단일 통과 막 횡단 단백질이다. 세포 접착의 역할뿐만 아니라, E-cadherin의 영향을 세포 E-카데 린의 세포질 꼬리 사이의 상호 작용을 통해 신호규제 단백질의 다 다양한, 특히 β-catenin의. β-catenin의가있는 adherens 접속점의 안정화에 중요한 역할을한다. 정규 Wnt 신호 동안, β-catenin의는 E-cadherin의에서 해제하고이 Wnt 경로의 3,4,5의 하류 전사 인자 역할을하는 핵 옭. 핵에서 β-catenin이는 트위스트, 민달팽이, 피브로넥틴, 및 매트릭스 메탈로 3,6의 다양한 포함한 여러 EMT 관련 요인의 전사를 증가시킨다. Wnts 이외에, TGF-β 시그널링은 정상적인 발달 과정 및 질병 상태 모두에서 7,8,9 EMT 유도에 중요한 역할을하는 것으로 밝혀졌다. TGF-β는 구개 형성 과정과 개발 중심 (10)에서 발생하는 EMT에 참여하고있다. 또한 섬유증과 전이 7 암의 진행에 연루되어있다. 홍보는 여기에 설명 된 절차ovides 유전자 조작 없이도 세포 유형의 다양한 EMT의 일관된 유도. 이 절차는 E-cadherin의의 칵테일을 사용 sFRP-1 및 DKK-1 차단 항체로 Wnt-5a 및 TGF-β1 재조합 단백질. 이 칵테일은 Wnt의 및 TGF-β 신호를 강화하면서 E-cadherin의 기반 접착을 차단하도록 설계되어 있습니다. 강력한 EMT 유도하는 능력은이 과정의 생물학 방법과 치료 목적으로이를 조작하는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. EMT의 보통주 현재 마커, E-cadherin의 (EMT에서 하향 조절) 및 (EMT 상향 조절) 멘틴은 암에서 공동으로 표현을 발견 할 수 있으며, 따라서 잠재적 전이성 셀 (12)의 최적의 진단 마커를 제공하지 않습니다. 중요한 것은, EMT를 겪은 세포 유형의 다양한 분석은 암 및 섬유증 11에서 진단 목적으로 이용 될 수있는 공통 유전자 발현 서명을 개발하는 것이 유용하다. 또한, 최근의 연구가 보여준 그 EMT는 EMT를받은 세포는 이러한 세포 13를 표적 수있는 화합물을 확인하는 약물 스크리닝에 유용 할 수 있다는 것을 시사 암 줄기 세포의 형성에 역할을 할 수있다.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Epithelial cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT Inducing Media Supplement</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CCM017</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&beta;1</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>240-B</td>
			<td>Used at 10ng/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL648R</td>
			<td>Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin </td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1838</td>
			<td>Used at 0.1 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Fibronectin</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1918</td>
			<td>Used at 10 &mu;g/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>AF5718</td>
			<td>Used at 0.2 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL009</td>
			<td>Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF109</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF007</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>SC026</td>
			<td>Used according to the manufacturer's instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96 Well BME Cell Invasion Assay</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>3455-096-K</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>ARY002B</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations19.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting Media</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CTS011</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15350-061</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>789-704</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fine pointed curved forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>12 mm coverslips</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>633009</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used at 5% in TBST for blocking in western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting blocking and washing</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-20% SDS-page gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plates/flasks, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>24-well plates, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipettes / pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet Aid / pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C/5%CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
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induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition

중간 엽 전이 (EMT)로 상피를 개발하는 동안 적절한 형태 형성에 필수적이다. 이 과정의 Misregulation 섬유증의 주요 이벤트 및 전이 상태로 암의 진행으로 연루되어있다. EMT 기초가되는 과정을 이해하는 것은 조기 진단과 이러한 질병 상태의 임상 제어를 위해 필수적입니다. 체외 EMT 신뢰성 유도 진단용 공통 유전자 발현 서명을 확인하는 유용한 약물 발견을위한 도구 등이다. 여기에서 우리는 세포 유형의 다양한 EMT의 유도에 대한 간단한 방법을 설명한다. 세포 면역 세포에 의해 사전 및 사후 EMT 유도의 분석을위한 방법도 포함되어 있습니다. 또한, 우리는 항체 기반의 배열 분석 및 마이그레이션 / 침입 분석을 통해이 방법의 효과를 보여줍니다.

. T98G의 아교 모세포종 세포 HT29 결장 선암 세포 : 기재 EMT 유도 배양 조건은 세포 종류의 다양한 EMT의 유도를위한 강력한 방법을 제공하는 것은 (1)과 (2)가 서로 다른 4 개의 인간 세포주의 형태학 및 마커의 발현 수준을 입증 피규어 , A549 폐 암종 세포 및 MCF10A 유방 상피 세포. 중간 엽, 스핀들 모양의 형태 (- 1H도 1E)에 - EMT 유도하는 미디어의 보충으로 치료받은 세포는 고전 상피 형태 (1D도 1a)로 변경되었습니다. EMT-유도 된 세포는 uninduced 세포에 비해 덜 조밀하게 꽉 식민지로 포장 나타났다. Uninduced MCF10A 샘플은 더 느슨하게 포장 세포에 의해 둘러싸여 단단히 포장 된 클러스터를 포함. 이 단단히 포장 된 클러스터 (그림 2D) E-cadherin의 긍정적이었고, EMT 유도하는 미디어 보록과 치료에 사라졌다장담 (그림 2H). EMT는 상피 마커와 중간 엽 마커의 상향 조절의 하향 조절에 의해 평가되었다. E-cadherin의 발현의 하향 조절은 일반적으로 서로 다른 세포 유형 3,4에 EMT 유도를 다음 관찰 2는 처리되지 않은 세포의 대부분 (그림 2A - 2D, 빨간색)에서 E-cadherin의 표면 발현을 보여줍니다 그림. 후 그것의 휴무에 비해 EMT 유도 (그림 2E - 하반기, 빨간색). 하나의 셀 라인, T98G는 이전의 분석을 배제 EMT 유도에 E-cadherin의의 매우 낮은 기저 수준이 밝혀졌다. 중간 엽 마커, 피브로넥틴의 상향 조절은 EMT 유도하는 미디어 보조 식품 (, 녹색 - - 2D도 2E 대 하반기도 2a)와 유도 후도 볼 수 있었다. E-카드 헤린 및 피브로넥틴의 발현 정도는 면역 세포 화학에 의해 본또한 전체 세포 용 해물의 서쪽 블로 팅 (그림 3)을 통해 확인되었다. 서양 얼룩은 E-cadherin의 및 면역 세포 화학 볼 피브로넥틴 표현의 상향 조절의 하향 조절을 확인했다. 밴드는 EMT 유도 다음 상대 배의 변화를 결정하는 농도계 및 GAPDH로 표준화를 사용하여 정량 하였다. E-cadherin의 레벨은 각각 A549 및 MCF10A 세포에서 6.4 및 3.4 배 감소 하였다. 피브로넥틴 수준은 각각 4.1를 4.6 증가, 2.3 T98G의 배, A549 및 MCF10A 세포했다. 서쪽 오점이 HT29 세포 포스트 EMT 유도에서 E-cadherin의 단백질 수준의 상당한 감소를 보여주지 않지만, 면역 세포 화학의 결과는 구별 할 수없는 E-cadherin의 (2 층 대 그림 2B)의 표면 발현의 감소를 보여 주 전체 세포 용 해물의 웨스턴 블로 팅. 더 EMT 상태, 추가로 알려진 마커를 평가하기 위해EMT 용의가 사전 및 사후 EMT 유도 분석 하였다. 이전 결과와 일치, E-cadherin의는 EMT이 유도되었음을 나타내는, 검사의 모든 세포 라인에서 하향 조절했다. 또한, 중간 엽 마커, 멘틴과 달팽이는 EMT 유도하는 미디어 보충 치료 (그림 4) 다음과 같은 A549, T98G, 및 MCF10A 세포에서 발현이 증가되었다. HT29 세포주는 이들 세포가 EMT 유도에 대한 대체 경로를 이용할 것을 나타낼 수있는 (데이터는 미도시)와 함께 또는 EMT 유도 있거나없는 이러한 간충직 마커의 발현을 보여주지 않았다. TGF-β가 특정 셀에 EMT를 유도하기에 충분 7,8,9을 컨텍스트들이지만, 다른 종류의 세포가 TGF-β (14)의 추가에 전적으로 응답하지 않습니다. MCF7 인간 유방암 세포 및 PANC-1 인간 췌장 암종 세포는 모두 단독으로 23 시그널링 TGF-β에 응답하지보고된다. 두 라인이 vitr에서 EMT을받을 수 있는지 여부를 확인하려면오, 세포 EMT 유도하는 미디어 보충의 면전에서 배양 하였다. 세포 EMT 유도하는 미디어 보충 내의 농도에서 혼자 재조합 TGF-β1 자극했다. 이러한 세포는 대조군 세포에서 본 것과 유사한 단단히 포장 세포의 콜로니 (데이터 미도시) 및 표면 E-카드 헤린 레벨 하였다 이루어진 그들의 상피 형태를 유지 (도 5C 및 5D도 5a 대 및 5B). 반면, EMT 유도하는 미디어 보충 자극 세포는 표면에 E-cadherin의 수준의 급격한 감소 (그림 5E 및 5 층)을 보여 주었다. 세포가 적은 컴팩트되었고 더 스핀들 조 (데이터는 도시되지 않음)로 이들 세포는 또한, 더 간엽 형태를 획득. 이러한 결과는 여기에 설명 된 EMT 유도 방법은 EMT의 형태와 TGF-β-I에 일반적으로 저항하는 세포 마커의 발현 변화를 촉진 할 수 있다는 것을 보여nduced EMT. 마커 발현의 변화에​​ 더하여, 중간 엽 세포의 또 다른 특징은 이주 및 침입하는 능력이다. 마이그레이션 및 제조업체의 지침에 따라 96 잘 BME 셀 침공 분석을 사용하여 분석 하였다 또는 EMT 유도하는 미디어의 보충없이 배양 된 세포의 침공. 간단히, 세포는 8.0 μm의 기공 필터 삽입을 포함 (50,000 세포 / 웰) 96 - 웰 플레이트에 접종 하였다. 48 시간 후, 마이그레이션은 필터를 통해 마이그레이션 한 세포의 AM 염색을 칼 세인에 의해 평가되었다. 각 샘플은 유사한 결과로 두 번 중으로 테스트되었습니다. 한 실험에서 대표 결과는 그림 6a에 표시됩니다. 세포 이동에 통계적으로 유의 한 증가 (P-값 &lt;0.003) EMT 유도 다음 두 A549과 PANC-1 세포를 볼 수 있었다. (즉, 세포 외 매트릭스와 마이그레이션)에 침입하는 이러한 세포의 능력을 평가하기 위해 동일한 분석했다지하 막 추출물 코팅 필터를 수행. EMT-유도 된 세포는도 6b에서와 같이 처리되지 않은 세포에 비해 침윤 기능에 통계적으로 유의 한 (P-값 &lt;0.001) 증가 하였다. EMT의 강력한 유도는 이들 세포에서 일어나는 유전자 발현의 변화와 신호의 분석에 유용합니다. 치료 및 치료 모두에서 세포 용 해물을 사용하여 항체 기반 어레이 분석은 단일 샘플에 다양한 분자의 발현을 분석하기위한 하나의 방법이다. 예를 들어, 우리는 유엔 유도 및 프로테옴 프로파일 인간의 인산화 MAPK 어레이 키트를 사용 MCF7 및 A549 세포 EMT 유도에서 해물의 인산화 MAPK의 가족 구성원의 수준을 분석했다. 배열이 유사한 결과를 독립적 인 EMT 유도 치료에서 두 번 실행되었다. 7 하나의 배열 대표 데이터를 보여줍니다. 두 종류의 세포가 CREB ​​(S133)의 인산화 증가를 전시, ERK1 (T2<html> 02/Y204)와 EMT-유도 된 세포에서 ERK2 (T185/Y187는) 컨트롤에 비교했다. 신호 이벤트의 차이가 아니라 두 종류의 세포 사이에서 관찰되었다. MCF7 세포를 증가 p70S6K (T421/S424) 인산화를 보인 반면, A549 세포, GSK-3 β (S9) 인산화의 증가를 보였다. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1highres.jpg" fo:width="6in"/> 그림 1. EMT 유도하는 미디어 보충과 자극 후 중간 엽 형태의 유도 (A - D). 네 종류의 세포에서 상피 형태는 EMT 유도하는 미디어의 보충없이 표준 배양 배지에서 5 일 동안 문화를 다음 표시 (E - H).에있는 중간 엽 형태 네 종류의 세포는 5 일 동안 EMT 유도하는 미디어 보충 배양 지적했다. NT &quot;FO : 유지 - together.within 페이지 =&quot;항상 &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2.jpg" alt="그림 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2highres.jpg" fo:width="6in"/> 그림 2. 상피 마커 발현과 EMT-유도 세포에서 간엽 마커 발현의 상향 조절의 하향 조절은. 세포는 상피 마커, E-카드 헤린 (레드)의 발현을 검출하기 위해 면역 형광에 의해 염색하고, 간엽 마커, 피브로넥틴 (그린). (A - D) 5 일 동안 EMT 유도하는 미디어의 보충없이 배양 제어 세포 (E -. H) 5 일 동안 EMT 유도하는 미디어 보충 배양 세포. 모든 세포는 DAPI (파란색)와 대조된다. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 서양 얼룩의 상피와 중간 엽 마커의 발현 확인<html> . (-) 5 일 동안 EMT 유도하는 미디어 보충 네 종류의 세포의 총 세포 용 해물의 alysis 웨스턴 블롯은 (EMT)와 함께 또는없이 처리, 표시. 왼쪽에 표시된 E-cadherin의, 피브로넥틴 및 GAPDH 부하 제어를위한 밴드입니다. 오른쪽에 표시된 크기 마커입니다. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 간엽 마커, EMT-유도 세포에서 멘틴 달팽이 상향 조절은. 세포는 상피 마커, E-카드 헤린 (그레이)의 발현을 검출하는 다색 면역 형광에 의해 염색하고, 간엽 마커, 비 멘틴 (그린) 및 달팽이 (레드) . (A - C) 5 일 동안 EMT 유도하는 미디어의 보충없이 배양 제어 세포. (D - F) 5 일 동안 EMT 유도하는 미디어 보충 배양 세포. 법이지 &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5.jpg" alt="그림 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5highres.jpg" fo:width="6in"/> 그림 5. 5 일 동안 TGF-β1의 10 겨 / ㎖를 포함하는 배지에서 배양 5 일 동안 형 미디어 배양 TGF-β1 응답하지 않는 세포에서 EMT 유도. (A와 B) 세포. (C와 D) 세포. (E 5 일 EMT 유도하는 미디어 보충 배양 F) 세포. 모든 세포는 E-cadherin의 발현 (적색)에 염색 DAPI (파란색)와 대조된다. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig6.jpg" alt="그림 6"/> 그림 6. EMT-유도 세포 이동과 침윤 용량을 증가하고있다. 48 시간 동안 배양 한 후 8 μm의 기공 필터를 통해 마이그레이션 세포의 A. 평균 수. B. 평균 수48 시간 동안 배양 한 후 지하 막 추출물로 코팅 8 μm의 기공 필터를 통해 침입 할 수 있었다 세포. 오차 막대 3 우물에 표준 편차를 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig7.jpg" alt="그림 7"/> EMT 유도의 그림 7. 항체 기반의 배열 발현 분석. A549 (A 및 C)에서의 용 해물과 함께 또는 EMT 유도하는 프레스 보충없이 배양 MCF7 (B 및 D) 세포는 인간 프로테옴 프로파일 인산화 MAPK 어레이 키트를 사용하여 어레이 분석에 사용 하였다. 반점은 강조하고 B는 다음 농도계를 사용하여 정량 하였다. 유엔 유도하는 EMT 유도 해물의 비교는 (C와 D) 아래에 해당하는 막대 그래프에 표시됩니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50478/50478fig7large.jpg" target="_blank">큰 그림을 &lt;보려면 여기를 클릭하십시오</a>/&gt;.

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간단한 방법은 세포 유형의 다양한 중간 엽 전이 (EMT)에 상피의 유도에 대해 설명한다. 면역 세포에 의한 EMT 상태에있는 세포의 분석 방법이 포함되어 있습니다.

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