Name: induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition
Uploaded: 2013-08-27T12:00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition Video at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Julia Hatler og Martin Ramsden (R &amp; D Systems) for nyttig diskusjon og manuskript vurdering.

En. Induksjon av EMT <ol><li> Varm vekstmedium til 37 ° C i et vannbad. Det dyrkningsmedium som brukes er den samme som det som benyttes for standard kultur av cellene av interesse. For eksempel er human A549 lungekarsinom-cellelinje dyrket i Kaighn &#39;s F12 supplert med 10% føtalt bovint serum og 2 mM glutamin. </li><li> Slakte celler av interesse å bruke en dissosiasjon løsning (f.eks TrypLE Express). </li><li> Suspendere celler i forvarmede kultur media i en 15 ml konisk tube. </li><li> Sentrifuger cellesuspensjonen ved 400 x g i 5 min. </li><li> Fjern supernatanten forsiktig ved å helle inn i en avfallsbeholder. </li><li> Suspendere cellen pellet i forvarmede kultur media. </li><li> Telle levedyktige celler ved hjelp Trypan Blå. Fjerne en prøve av cellesuspensjonen og fortynnes i 0,4% trypanblått-oppløsning. Plasser 10 mL av den fortynnede prøven på en hemocytometer og telle levedyktige celler (celler som ikke blir blå). Bruk celletelling for å bestemme celle density i din løsning. </li><li> Plate celler bort på vev kultur behandlet plater eller kolber på 0,9-1,0 x 10 4 celler per cm 2. For eksempel 0,5 x 10 6 celler belagt i en 100 mm plate i kulturmedier som inneholder 1X EMT Induksjon Media Supplement (6 ml medium per 100 mm plate). </li><li> Kultur belagt celler i en 37 ° C / 5% CO2 inkubator. Monitor cellemorfologi daglig. </li><li> Tre dager etter plating, fjerne media og erstatte med frisk forvarmede kultur media inneholder 1X EMT Induksjon Media Supplement. Fortsett til kultur i en 37 ° C / 5% CO 2 inkubator. </li><li> Fem dager etter plating, cellene er klare for analyse. Cell morfologi blir visualisert ved invertert lysmikroskopi. </li></ol> 2. Analyse av Protein Expression av Immunocytochemistry <ol><li> Forbered sterile 12 mm dekkglass for en 24-brønners plate ved å plassere dekkglass i en petriskål inneholdende 95% etanol. Forsiktig fjerne Dekk fra etanol ossing en nål og buet pinsett og flamme sterilisere. Plasser sterile dekkglass i en brønn av en 24-brønns plate. Gjenta med resten av dekkglass. </li><li> Forbered cellesuspensjonen som er beskrevet i kapittel 1.1 til 1.7. </li><li> Plate 1,6 x 10. 4-celler / brønn i 0,5 ml forvarmet kultur medie inneholder 1X EMT Induksjon Media Supplement. </li><li> Vokse og mate celler som beskrevet i pkt. 1.9 til 1.11. </li><li> Fem dager etter plettering, fjernes mediet og løse cellene med 300 ul / brønn av 4% paraformaldehyd i 1X fosfatbufret saltvann (PBS) i 20 min ved romtemperatur. </li><li> Fjern fiksativ og skyll celler 2x med 1X PBS, 500 mL / brønn. </li><li> Inkuber cellene i 400 pl / brønn av blokkeringsbuffer (1X PBS inneholdende 1% bovint serum albumin (BSA), 10% normal esel serum og 0,3% Triton X-100) i 1 time ved romtemperatur. </li><li> Inkuber i primært antistoff ved produsentens anbefalte konsentrasjon på 400 pl / brønn av blokkeringsbuffer i 3 timer ved romtemperature, eller over natten ved 4 ° C. Ved bruk av et primært antistoff direkte konjugert til et fluorokrom, inkubere prøvene i mørket. </li><li> Vask cellene tre ganger med 500 ul / brønn i 1X PBS inneholdende 0,1% BSA i 5 min hver vask. Når du bruker en primær antistoff direkte konjugert til et fluorokrom, fortsett direkte til steg 2,12. </li><li> Inkuber cellene i sekundære antistoff ved produsentens anbefalte konsentrasjon på 400 pl / brønn av 1X PBS inneholdende 1% BSA i 1 time ved romtemperatur i mørket. </li><li> Vask cellene tre ganger med 500 ul / brønn i 1X PBS inneholdende 0,1% BSA i 5 min hver vask. </li><li> Hvis ønskelig, counterstain atomkjerner med DAPI-løsning. </li><li> Skyll celler i avionisert vann og montere Dekk ansiktet ned på et lysbilde med feste media. </li></ol>

<ol>
	<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition.">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li><li>Thiery, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions+in+tumour+progression.">Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression.</a> Nature Reviews Cancer. 2, 442-454 (2002).</li><li>Heuberger, J., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+cadherin-mediated+cell+adhesion+and+canonical+Wnt+signaling.">Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 1-23 (2010).</li><li>Onder, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+E-cadherin+promotes+metastasis+via+multiple+downstream+transcriptional+pathways.">Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways.</a> Cancer Research. 68, 3645-3654 (2008).</li><li>Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin/&#946;-catenin+complex+and+the+epithelial+barrier.">E-cadherin/&#946;-catenin complex and the epithelial barrier.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-6 (2011).</li><li>Scheel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+and+autocrine+signals+induce+and+maintain+mesenchymal+and+stem+cell+states+in+the+breast.">Paracrine and autocrine signals induce and maintain mesenchymal and stem cell states in the breast.</a> Cell. 145, 926-940 (2011).</li><li>Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition.">TGF-&#946;-induced epithelial to mesenchymal transition.</a> Cell Research. 19, 156-172 (2009).</li><li>Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;1+induces+human+alveolar+epithelial+to+mesenchymal+cell+transition.">TGF-&#946;1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition.</a> EMT). Respiratory Research. 6, 56-70 (2005).</li><li>Miettinen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+induced+transdifferentiation+of+mammary+epithelial+cells+to+mesenchymal+cells:+involvement+of+type+I+receptors.">TGF-&#946; induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors.</a> Journal of Cell Biology. 127, 2021-2036 (1994).</li><li>Pelton, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+genes+encoding+TGFs+&#946;1,+&#946;2,+and+&#946;3+during+murine+palate+formation.">Differential expression of genes encoding TGFs &#946;1, &#946;2, and &#946;3 during murine palate formation.</a> Dev. Biol. 141, 456-460 (1990).</li><li>Taube, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+epithelial-to-mesenchymal+transition+interactome+gene-expression+signature+is+associated+with+claudin-low+and+metaplastic+breast+cancer+subtypes.">Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes.</a> PNAS. 107, 15449-15454 (2010).</li><li>Roussos, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AACR+special+conference+on+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+progression+and+treatment.">AACR special conference on epithelial-mesenchymal transition and cancer progression and treatment.</a> Cancer Research. 70, 7360-7364 (2010).</li><li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states:+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits.">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9, 265-273 (2009).</li><li>Brown, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+by+transforming+growth+factor-&#946;1+of+epithelial+to+mesenchymal+transition+is+a+rare+event+in+vitro.">Induction by transforming growth factor-&#946;1 of epithelial to mesenchymal transition is a rare event in vitro.</a> Breast Cancer Research. 6, 215-231 (2004).</li><li>De Falco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+proteolysis+increases+CREB+phosphorylation+and+sustains+proliferation+of+thyroid+cancer+cells.">CD44 proteolysis increases CREB phosphorylation and sustains proliferation of thyroid cancer cells.</a> Cancer Research. 72, 1449-1458 (2012).</li><li>Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Erk+pathway+is+required+for+TGF-&#946;1-induced+EMT+in+vitro.">Activation of the Erk pathway is required for TGF-&#946;1-induced EMT in vitro.</a> Neoplasia. 6, 603-610 (2004).</li><li>Bachelder, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase-3+is+an+endogenous+inhibitor+of+Snail+transcription:+implication+for+the+epithelial-mesenchymal+transition.">Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription: implication for the epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Cell Biology. 168, 29-33 (2005).</li><li>Pon, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p70+S6+kinase+promotes+epithelial+to+mesenchymal+transition+through+Snail+induction+in+ovarian+cancer+cells.">p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells.</a> Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).</li><li>Wegner, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+changes+in+receptor+tyrosine+kinase+phosphorylation+using+antibody+arrays.">Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li></ol>

R &amp; D Systems, Inc. er en for-profit, offentlig selskap. Produksjon og Fri tilgang til denne artikkelen er sponset av R &amp; D Systems, Inc.

Tidligere metoder for EMT induksjon har generelt brukt TGF-β stimulering eller genetisk modifisering. Selv om TGF-β alene har vist seg å indusere EMT i visse celletyper, er det nå blitt vist at TGF-β er nødvendig for EMT, men det er ikke tilstrekkelig i alle celletyper 6,14. Ved hjelp av genmodifisering for EMT induksjon er tidkrevende og arbeidskrevende. Fremgangsmåten er beskrevet her anvender en kombinasjon av faktorer, inkludert, anti-human E-cadherin, anti-humant sFRP-1, anti-humant Dkk-1, rekombinant human Wnt-5a, og rekombinant human TGF-β1 for pålitelig å indusere EMT. Denne kombinasjon av faktorer som er utformet for å blokkere E-cadherin basert adhesjon, et kritisk trinn for EMT induksjon 4 og forbedre Wnt signalering ved å tilsette Wnt-5a protein, så vel som ved hjelp av blokkerende antistoffer mot Wnt inhibitorer, sFRP-1 og Dkk -1. Wnt og TGF-β-signalering har vist seg å virke på en autokrin sløyfe for å innføre og holde mesenchymale celler statistiskee 6. Denne metode unngår induksjon genmanipulering og er mer effektivt enn å bruke TGF β-alene. Viktigere, er vi i stand til å observere induksjon av EMT i celletyper, inkludert MCF7 og PANC-1-celler, som tidligere har blitt vist seg å ikke svare utelukkende til TGF-β stimulering (figur 5) 14. Celler behandlet med EMT Induksjon Media Supplement vis mindre kompakt og økt spindelformet morfologi (fig. 1). I tillegg er det en reduksjon i overflate E-cadherin ekspresjon samtidig med en økning i Fibronectin uttrykk, som er kjennetegn for EMT (fig. 2 og 3). Ekstra markører mesenchymale som vimentin og Snail er også oppregulert ved EMT induserte celler i forhold til uninduced kontroller (figur 4). Økte migrasjon og invasjon evner er de viktigste funksjonelle egenskapene til mesenchymalceller. I in vitro </em&gt; Migrering og invasjon assays, celler behandlet med EMT Induksjon Media Supplement viste en betydelig økt kapasitet til å migrere og invadere (figur 6). Denne enkle metode for EMT induksjon er anvendelige for studium av EMT signalering som påvist ved hjelp av antistoffmatriseuttrykk data som er vist i figur 7. Forskjellige celletyper kan sammenlignes før og etter-EMT induksjon for å oppnå vanlige ekspresjonssystemer signaturer assosiert med EMT, slik som økning av fosforylert CREB og ERK1 / 2 sett i både MCF7-og A549 EMT-induserte celler. S133 fosforylering av CREB stimulerer DNA binding og har blitt vist å virke på nedstrømssiden av TGF-β1-indusert EMT 15. ERK1 / 2 fosforyleringen har også vist seg å virke på nedstrømssiden av TGF-β1-indusert EMT 16. Forskjeller i signalveier mellom cellene typer kan også bli belyst som sett med økningen i GSK-3β fosforylering i A549-celler versus p70S6K fosforylering i MCF7. GSK 3β-fosforylering ved serin 9 senker det funksjon, og GSK-3β har blitt vist å hemme pro-EMT transkripsjonsfaktor, sneglen 17. I motsetning til dette induserer p70S6K snegle-aktivitet og fosforylering er assosiert med aktivering av dette proteinet 18.. Generelle, enkel og pålitelig induksjon av EMT, spesielt i celler som tidligere vist for ikke å svare bare til TGF-β, er nyttig for å forstå biologien til EMT, identifisere felles uttrykk signaturer for anvendelse og prognostiske markører, og utvikling og evaluering av nye behandlingsformer for cancer , og fibrotisk sykdom.

Epithelial til mesenchymale overgang (EMT) er den prosess hvor en polarisert epitel celle gjennomgår en rekke forandringer som resulterer i en meget bevegelige, fibroblast-lignende mesenchymale celle. Denne prosessen skjer, delvis gjennom genekspresjon endringer og nedbrytningen av adherens knutepunkter, noe som resulterer i en økt evne til å migrere og invadere. Fysiologisk, EMT spiller viktige roller under embryonal utvikling og sårtilheling. Tap av riktig kontroll over EMT kan føre til fibrose og metastase av karsinomer 1,2. Reduksjonen av E-cadherin på overflaten av epitelceller er et kritisk trinn i utviklingen av en celle gjennom EMT 3,4. E-cadherin er en single-pass transmembrane protein som direkte samhandler med cadherin proteiner på tilstøtende celler. I tillegg til sin rolle i celle adhesjon, E-cadherin påvirkninger cellesignalisering via interaksjoner mellom cytoplasma halen av E-cadherin enda rekke regulatoriske proteiner, spesielt β-catenin. β-catenin spiller en rolle i stabilisering av adherens veikryss. Under kanoniske Wnt signalering, er β-catenin løslatt fra E-cadherin og translocated til kjernen hvor det fungerer som en nedstrøms transkripsjonsfaktor i Wnt veien 3,4,5. I kjernen, har β-catenin har vist seg å øke transkripsjon av flere EMT-relaterte faktorer, inkludert Twist, Slug, Fibronectin, og en rekke av matriks-metallproteaser 3,6. I tillegg til Wnts har TGF-β signale vist seg å spille en betydelig rolle i EMT induksjon både under normal utvikling og i syke tilstander 7,8,9. TGF-β er involvert i EMT som oppstår under gane dannelse og i å utvikle hjerte 10.. Det har også vært implisert i fibrosis og cancer i progresjon til metastase 7.. Fremgangsmåten som beskrives her provides konsistent induksjon av EMT i en rekke celletyper, uten behov for genetisk manipulering. Denne fremgangsmåten benytter en blanding av E-cadherin, sFRP-1, og Dkk-1-blokkerende antistoffer og Wnt-5a-og TGF-β1 rekombinante proteiner. Dette cocktail er utformet for å blokkere E-cadherin basert adhesjon og samtidig forbedre Wnt og TGF-β-signalering. Muligheten for robust EMT induksjon er avgjørende for forståelsen av biologien til denne prosessen og å manipulere den for terapeutiske formål. Nåværende vanlig markører av EMT, E-cadherin (downregulated i EMT) og vimentin (oppregulert i EMT), kan bli funnet co-uttrykt i kreft, og dermed ikke gir de beste diagnostiske markører av potensielle metastatisk celler 12. Viktigere er det nyttig å utvikle felles genekspresjon signaturer som kan brukes for diagnostiske formål innen cancer og fibrose 11 analyse av en rekke celletyper som har gjennomgått EMT. I tillegg har nyere studier vist at EMT kan spille en rolle i dannelsen av kreft stamceller, noe som tyder på at celler som har gjennomgått EMT kan være nyttig for legemiddel screening for å identifisere forbindelser som kan målrette disse cellene 13..

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Epithelial cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT Inducing Media Supplement</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CCM017</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&beta;1</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>240-B</td>
			<td>Used at 10ng/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL648R</td>
			<td>Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin </td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1838</td>
			<td>Used at 0.1 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Fibronectin</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1918</td>
			<td>Used at 10 &mu;g/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>AF5718</td>
			<td>Used at 0.2 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL009</td>
			<td>Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF109</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF007</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>SC026</td>
			<td>Used according to the manufacturer's instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96 Well BME Cell Invasion Assay</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>3455-096-K</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>ARY002B</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations19.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting Media</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CTS011</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15350-061</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>789-704</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fine pointed curved forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>12 mm coverslips</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>633009</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used at 5% in TBST for blocking in western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting blocking and washing</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-20% SDS-page gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plates/flasks, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>24-well plates, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipettes / pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet Aid / pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C/5%CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition

Epitelial til mesenchymale overgang (EMT) er avgjørende for riktig morphogenesis under utvikling. Misregulation av denne prosessen har vært implisert som en nøkkel hendelse i fibrose og progresjon av karsinomer til en metastatisk tilstand. Forstå prosessene som ligger til grunn EMT er avgjørende for tidlig diagnostisering og klinisk kontroll av disse sykdomstilstander. Pålitelig induksjon av EMT in vitro er et nyttig verktøy for medisiner, samt å identifisere felles genekspresjonssignaturene for diagnostiske formål. Her vi vise en grei metode for induksjon av EMT i en rekke celletyper. Metoder for å analysere celler pre-og post-EMT induksjon av immunocytokjemi er også inkludert. I tillegg har vi demonstrere effektiviteten av denne fremgangsmåte gjennom antistoffbaserte matriseanalyse og migrering / invasjons assays.

. EMT induserende kulturbetingelser som er beskrevet her gir en robust fremgangsmåte for induksjon av EMT i en rekke celletyper, Figurene 1 og 2 viser morfologi av og markør ekspresjonsnivåer for fire forskjellige humane cellelinjer: T98G glioblastom celler, HT29 kolon adenokarsinom-celler , A549 lungekarsinom-celler, og MCF10A mammary epitelceller. Celler som ble behandlet med EMT Induksjon Media Supplement endret fra en klassisk epitelial morfologi (figur 1A - 1D) til et mesenchymale, spindelformet morfologi (figurene 1E - 1H). EMT-induserte celler dukket mindre tettpakket inn i trange kolonier i forhold til uninduced celler. Uninduced MCF10A prøvene inneholdt tettpakkede klynger omgitt av mer løst pakket celler. Disse tettpakkede klynger var E-cadherin positive (figur 2D) og forsvant ved behandling med EMT Induksjon Media Supplement (Figur 2H). EMT ble også vurdert av downregulation av epiteliale markører og oppregulering av mesenchymale markører. Den downregulation av E-cadherin ekspresjon er vanligvis observert etter EMT induksjon i forskjellige celletyper 3,4 Figur 2 viser overflaten ekspresjon av E-cadherin i flertallet av ubehandlede celler (figurene 2A - 2D-, rød). Sammenlignet med dens fravær etter EMT induksjon (Tall 2E - 2H, rød). En cellelinje, T98G, ble funnet å ha et ekstremt lavt nivå av basal E-cadherin før EMT induksjon, noe som utelukket analysen. Oppregulering av mesenchymale markør, Fibronectin, var også synlig etter induksjon med EMT Induksjon Media Supplement (Tall 2A - 2D versus Tall 2E - 2H, grønn). Uttrykket nivåer av E-cadherin og Fibronectin sett av immunocytochemistryble ytterligere bekreftet gjennom western blotting av totalt cellelysater (figur 3). Den vestlige blot bekreftet nedregulering av E-cadherin og oppregulering av Fibronectin uttrykk sett av immunocytochemistry. Båndene ble kvantifisert ved hjelp densitometry og normalisert til GAPDH å bestemme relativ ganger endring etter EMT induksjon. E-cadherin ble redusert 6,4 og 3,4 ganger hos A549-og MCF10A-celler, respektivt. Fibronektin nivåene ble øket 4.6, 4.1, og 2,3 ganger i T98G, A549, og MCF10A-celler, respektivt. Selv om western blot ikke viser signifikant reduksjon av E-cadherin proteinnivåer i HT29-celler etter induksjon EMT, den immunocytokjemi resultater viser en reduksjon i overflate ekspresjon av E-cadherin (figur 2B versus 2F), som er i stand til å skilles i western blotting av totalt cellelysater. For å evaluere EMT status, ekstra kjent markør videres for EMT ble analysert pre-og post-EMT induksjon. I samsvar med tidligere resultater, ble E-cadherin downregulated i alle cellelinjene undersøkt, noe som indikerer at EMT ble indusert. I tillegg, de mesenchymale markører, vimentin og sneglen, ble oppregulert i A549, T98G, og MCF10A celler etter behandling med EMT Induksjon Media Supplement (figur 4). Den HT29-cellelinjen viste ingen ekspresjon av slike mesenkymale markører, enten med eller uten EMT induksjon (data ikke vist), noe som kan tyde på at disse celler anvender alternative veier for EMT induksjon. Selv om TGF-β er tilstrekkelig til å indusere EMT i viss celle sammenhenger 7,8,9, har andre celletyper svarer ikke bare til tilsetning av TGF-β 14.. Humant MCF7 brystcancerceller og PANC-1 humane pankreatiske karsinom-celler er begge rapportert å ikke svare på TGF-β signale alene 14. For å avgjøre om begge linjene kunne gjennomgår EMT i vitro, cellene ble dyrket i nærvær av EMT Induksjon Media Supplement. Celler ble stimulert med rekombinant TGF-β1 alene i samme konsentrasjon som i den EMT Induksjon Media Supplement. Disse cellene beholdt sin epithelial morfologi, som består av tettpakkede kolonier av celler (data ikke vist) og overflate E-cadherin nivåer var lik de som ble sett i kontrollceller (Figur 5C og 5D i forhold til figur 5A og 5B). I kontrast, celler stimulert med det EMT Induksjon Media Supplement viste en drastisk reduksjon i overflate-E-cadherin-nivåer (figurene 5E og 5F). Disse cellene har også oppnådd en mer mesenchymale morfologi, som celler ble mindre kompakt og mer spindel-lignende (data ikke vist). Disse resultater viser at den EMT induserende metoden som er beskrevet her er i stand til å fremme EMT morfologi og markør uttrykk forandringer i cellene vanligvis bestandige mot TGF-β-induced EMT. I tillegg til endringer i markør uttrykk, er et annet kjennetegn på mesenchymalceller deres evne til å migrere og invadere. Migrasjon og invasjon av celler dyrket med eller uten EMT Induksjon Media Supplement ble analysert ved hjelp av 96 godt BME Cell Invasion analysen i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble cellene sådd ut på 96-brønners plater (50 000 celler / brønn) inneholdende filterinnsatser med 8,0 um porer. Etter 48 timer ble vurdert ved migrering calcein AM farging av celler som hadde migrert gjennom filteret. Hver prøve ble testet i triplikat to ganger med lignende resultater. Representative resultater fra ett eksperiment er vist i figur 6A. Statistisk signifikant økning (P-verdi &lt;0,003) i celle migrasjon ble sett med både A549 og PANC-1 celler etter EMT induksjon. For å vurdere evnen av disse cellene til å invadere (dvs. vandrer gjennom ekstracellulær matrix), den samme analysen varutføres med en basalmembran-ekstrakt-belagte filter. EMT-induserte celler viste en statistisk signifikant (p-verdi &lt;0,001) økning av invasjons kapasiteter sammenlignet med ubehandlede celler som vist på figur 6B. Den robust induksjon av EMT er nyttig for analyse av genekspresjon endringer og signalering som finner sted i disse cellene. Antistoffbasert rekke analyse ved hjelp av lysater fra både behandlede og ubehandlede celler, er en metode for å analysere uttrykket nivåer av en rekke molekyler i en enkelt prøve. Som et eksempel, vi analyserte nivåer av fosforylert MAPK familien i lysatene fra un-indusert og EMT-indusert MCF7 og A549 cellene bruker Proteome Profiler Menneske Phospho-MAPK Array Kit. Matrisen ble kjøres to ganger fra uavhengige EMT-induksjons behandlinger med lignende resultater. Figur 7 viser representative data fra en array. Begge celletyper utstilt økt fosforylering av CREB (S133), ERK1 (T2<html> 02/Y204), og ERK2 (T185/Y187) i EMT-induserte celler sammenlignet med kontroller. Forskjeller i signal hendelser ble observert mellom de to celletypene også. A549-celler viste en økning i GSK-3-β (S9) fosforylering, mens MCF7-celler viste økt p70S6K (T421/S424) fosforylering. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1.jpg" alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1highres.jpg" fo:width="6in"/> Figur 1. Mesenchymale morfologi induksjon etter stimulering med EMT Induksjon Media Supplement (A - D). Epithelial morfologi i løpet av de fire celletypene er angitt nedenfor kultur i 5 dager i standard kulturmedier uten EMT Induksjon Media Supplement (E - H). Mesenchymale morfologi i fire celletyper indikert kultivert med EMT Induksjon Media Tillegg for 5 dager. nt &quot;fo: hold-together.within-side =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2.jpg" alt="Fig. 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2highres.jpg" fo:width="6in"/> Figur 2. Nedregulering av epitelial markør ekspresjon og oppregulering av mesenchymale markør ekspresjon i EMT-induserte celler. Celler ble farget ved immunfluorescens for å detektere ekspresjon av epiteliale markør, E-cadherin (rødt), og mesenchymale markør, Fibronectin (grønn). (A - D) Kontroll celler dyrket uten EMT Induksjon Media Supplement til 5 dager (E - H.) celler dyrket med EMT Induksjon Media Supplement i 5 dager. Alle cellene er kontrafarget med DAPI (blå). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig3.jpg" alt="Fig. 3."/> Figur 3. Bekreftelse av epiteliale og mesenchymale markør uttrykk med western blot en<html> . alysis Western blot av totale cellelysater av de fire celletypene angitt, behandles med (EMT) eller uten (-) EMT Induksjon Media Supplement i 5 dager. Band for E-cadherin, Fibronectin, og GAPDH lasting kontroll er som angitt på venstre. Størrelsen markør er som vist til høyre. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig4.jpg" alt="Figur 4"/> Figur 4. Oppregulering av mesenchymale markører, vimentin og snegle i EMT-induserte celler. Celler ble farget ved immunfluorescens flerfarget for å detektere ekspresjon av epiteliale markør, E-cadherin (grå), og mesenkymale markører, vimentin (grønn) og snegle (rød) . (A - C) Kontroll celler dyrket uten EMT Induksjon Media supplement for 5 dager. (D - F) celler dyrket med EMT Induksjon Media Tillegg for 5 dager. Alltid, &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5.jpg" alt="Figur 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5highres.jpg" fo:width="6in"/> Figur 5. Induksjon av EMT i TGF-β1 non-responsive celler. (A og B) Celler dyrkede med media alene i 5 dager. (C og D) Celler kultivert i medium inneholdende 10 ng / ml TGF-β1 i 5 dager. (E og F) Celler dyrket i EMT Induksjon Media Tillegg for 5 dager. Alle celler er farget for E-cadherin uttrykk (rød) og kontra med DAPI (blå). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig6.jpg" alt="Figur 6"/> Figur 6. EMT induserte cellene har økt migrering og invasjon kapasiteter. A. Gjennomsnittlig antall celler som migrerte gjennom et 8 um pore-filter etter inkubasjon i 48 timer. B. Gjennomsnitt antalletceller som var i stand til å invadere gjennom et 8 um pore-filter belagt med basalmembran-ekstrakt etter inkubasjon i 48 timer. Feilfelt indikerer standardavvik over tre brønner. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig7.jpg" alt="Figur 7"/> Figur 7. Antistoff-baserte matriseuttrykk analyse av EMT induksjon. Lysater fra A549 (A og C) og MCF7 (B og D) celler dyrket med eller uten EMT Induksjon Media Supplement ble anvendt for matriseanalyse ved hjelp av Proteome Profiler Humant Phospho-MAPK Array Kit. Spots uthevet i A og B ble deretter kvantifiseres ved hjelp densitometry. Sammenligninger av un-indusert til EMT-indusert lysatene er vist i de tilsvarende søylediagrammer nedenfor (C og D). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50478/50478fig7large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur &lt;</a>/ A&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition Video at JoVE.com

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition Video (Video) | JoVE

En grei metode er beskrevet for indusering av epiteliale til mesenchymale overgang (EMT) i en rekke celletyper. Metoder for analyse av celler i EMT statene etter immunocytochemistry er inkludert.

Induksjon og analyse av Epiteliale til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Research

JoVE Journal

Biology

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Light/dark Transition Test for Mice

Light/dark Transition Test for Mice Video (Video) | JoVE

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity Video (Video) | JoVE

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis Video (Video) | JoVE

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP Video (Video) | JoVE

Kromatin Isolering av RNA Purification (kvitre)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration Video (Video) | JoVE

Rapid Genetic Analysis of epitelial-mesenchymale signaleringsprotokoll Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor Video (Video) | JoVE

Isolasjon og kultur av Dental Epiteliale stamceller fra voksne musen Fortann

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition Video (Video) | JoVE

Påvisning av alternativ spleising Under epithelial-Mesenchymale Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Manipulating the Murine Lacrimal Gland Video (Video) | JoVE

Manipulere Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa Video (Video) | JoVE

Cryosectioning Metode for mikrodisseksjon av Murine Kolon Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model Video (Video) | JoVE

Magnetisk-aktivert celle sortering strategier for å isolere og rense Synovial Fluid-avledet Mesenchymal stamceller fra en kanin modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...