Name: induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition
Uploaded: 2013-08-27T12:00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition Video at JoVE.com

Författarna vill tacka för Julia Hatler och Martin Ramsden (R &amp; D Systems) för bra diskussioner och manuskript översyn.

1. Induktion av EMT <ol><li> Varm odlingsmedier till 37 ° C i ett vattenbad. De odlingsmedia som används är samma som de media som används för standardodlings av cellerna av intresse. Till exempel är den lungkarcinom cell A549 human linje odlades i Kaighn F12 kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 2 mM glutamin. </li><li> Harvest cellerna av intresse med en dissociation lösning (t.ex. TrypLE Express). </li><li> Häng celler i förvärmda odlingsmedier i en 15 ml koniska rör. </li><li> Centrifugera cellsuspensionen vid 400 x g under 5 min. </li><li> Ta försiktigt bort supernatanten genom att hälla i en avfallsbehållare. </li><li> Suspendera cellpelleten i förvärmda odlingsmedia. </li><li> Räkna livskraftiga celler med användning av trypanblått. Avlägsna ett prov av cellsuspensionen och utspädd i 0,4% Trypan Blue-lösning. Placera 10 l av det utspädda provet på en hemocytometer och räkna livskraftiga celler (celler som inte blir blå). Använd kroppar för att bestämma cell density i din lösning. </li><li> Plate celler på vävnadsodling behandlade plattor eller kolvar vid 0,9-1,0 x 10 4 celler per cm 2. Till exempel, 0,5 x 10 6 celler ströks ut i en 100 mm platta i odlingsmedium innehållande 1X EMT Induktion Media Supplement (6 ml medium per 100 mm platta). </li><li> Kultur pläterade celler i en 37 ° C / 5% CO2 inkubator. Övervaka cellmorfologin dagligen. </li><li> Tre dagar efter plätering, ta bort media och ersätta med färsk förvärmda odlingsmedia som innehåller 1X EMT Induktion Media Supplement. Fortsätt att kultur i en 37 ° C / 5% CO2 inkubator. </li><li> Fem dagar efter plätering, cellerna är redo för analys. Cellmorfologi visualiseras av inverterat ljusmikroskop. </li></ol> 2. Analys av proteinuttryck genom immuncytokemi <ol><li> Förbered sterila 12 mm täckglas för en 24-brunnar genom att placera täckglas i en petriskål med 95% etanol. Ta försiktigt bort täckglas från etanol ossning en nål och böjda pincett och Flamsterilisera. Placera sterila täckglas i en brunn i en 24-brunnsplatta. Upprepa med resterande täckglas. </li><li> Förbered cellsuspensionen som beskrivs i avsnitt 1,1 - 1,7. </li><li> Plate 1.6 x 10 4 celler / brunn i 0,5 ml förvärmda odlingsmedier som innehåller 1X EMT Induktion Media Supplement. </li><li> Väx och foder celler som beskrivs i avsnitt 1,9 till 1,11. </li><li> Fem dagar efter plätering, avlägsna media och fixera cellerna med 300 | il / brunn av 4% paraformaldehyd i 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) under 20 min vid rumstemperatur. </li><li> Ta bort fixativ och skölj celler 2x med 1X PBS, 500 l / brunn. </li><li> Inkubera cellerna i 400 pl / brunn av blockeringsbuffert (1 x PBS innehållande 1% bovint serumalbumin (BSA), 10% normal donkey serum och 0,3% Triton X-100) under 1 timme vid rumstemperatur. </li><li> Inkubera i primär antikropp vid tillverkarens rekommenderade koncentrationen i 400 ^ il / brunn av blockeringsbuffert under 3 h vid rums-temperature eller över natten vid 4 ° C. Vid användning av en primär antikropp som är direkt konjugerad till en fluorokrom, inkubera proverna i mörker. </li><li> Tvätta cellerna tre gånger i 500 | al / brunn av 1 x PBS innehållande 0,1% BSA under 5 min varje tvätt. Vid användning av en primär antikropp direkt konjugerad till en fluorokrom, gå direkt till steg 2.12. </li><li> Inkubera cellerna i sekundär antikropp vid tillverkarens rekommenderade koncentrationen i 400 ^ il / brunn av 1 x PBS innehållande 1% BSA under 1 h vid rumstemperatur i mörker. </li><li> Tvätta cellerna tre gånger i 500 | al / brunn av 1 x PBS innehållande 0,1% BSA under 5 min varje tvätt. </li><li> Om så önskas, motfärga kärnor med DAPI-lösning. </li><li> Skölj celler i avjoniserat vatten och montera täcksidan nedåt på en bild med hjälp av monteringsmedier. </li></ol>

<ol>
	<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition.">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li><li>Thiery, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions+in+tumour+progression.">Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression.</a> Nature Reviews Cancer. 2, 442-454 (2002).</li><li>Heuberger, J., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+cadherin-mediated+cell+adhesion+and+canonical+Wnt+signaling.">Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 1-23 (2010).</li><li>Onder, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+E-cadherin+promotes+metastasis+via+multiple+downstream+transcriptional+pathways.">Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways.</a> Cancer Research. 68, 3645-3654 (2008).</li><li>Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin/&#946;-catenin+complex+and+the+epithelial+barrier.">E-cadherin/&#946;-catenin complex and the epithelial barrier.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-6 (2011).</li><li>Scheel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+and+autocrine+signals+induce+and+maintain+mesenchymal+and+stem+cell+states+in+the+breast.">Paracrine and autocrine signals induce and maintain mesenchymal and stem cell states in the breast.</a> Cell. 145, 926-940 (2011).</li><li>Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition.">TGF-&#946;-induced epithelial to mesenchymal transition.</a> Cell Research. 19, 156-172 (2009).</li><li>Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;1+induces+human+alveolar+epithelial+to+mesenchymal+cell+transition.">TGF-&#946;1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition.</a> EMT). Respiratory Research. 6, 56-70 (2005).</li><li>Miettinen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+induced+transdifferentiation+of+mammary+epithelial+cells+to+mesenchymal+cells:+involvement+of+type+I+receptors.">TGF-&#946; induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors.</a> Journal of Cell Biology. 127, 2021-2036 (1994).</li><li>Pelton, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+genes+encoding+TGFs+&#946;1,+&#946;2,+and+&#946;3+during+murine+palate+formation.">Differential expression of genes encoding TGFs &#946;1, &#946;2, and &#946;3 during murine palate formation.</a> Dev. Biol. 141, 456-460 (1990).</li><li>Taube, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+epithelial-to-mesenchymal+transition+interactome+gene-expression+signature+is+associated+with+claudin-low+and+metaplastic+breast+cancer+subtypes.">Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes.</a> PNAS. 107, 15449-15454 (2010).</li><li>Roussos, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AACR+special+conference+on+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+progression+and+treatment.">AACR special conference on epithelial-mesenchymal transition and cancer progression and treatment.</a> Cancer Research. 70, 7360-7364 (2010).</li><li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states:+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits.">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9, 265-273 (2009).</li><li>Brown, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+by+transforming+growth+factor-&#946;1+of+epithelial+to+mesenchymal+transition+is+a+rare+event+in+vitro.">Induction by transforming growth factor-&#946;1 of epithelial to mesenchymal transition is a rare event in vitro.</a> Breast Cancer Research. 6, 215-231 (2004).</li><li>De Falco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+proteolysis+increases+CREB+phosphorylation+and+sustains+proliferation+of+thyroid+cancer+cells.">CD44 proteolysis increases CREB phosphorylation and sustains proliferation of thyroid cancer cells.</a> Cancer Research. 72, 1449-1458 (2012).</li><li>Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Erk+pathway+is+required+for+TGF-&#946;1-induced+EMT+in+vitro.">Activation of the Erk pathway is required for TGF-&#946;1-induced EMT in vitro.</a> Neoplasia. 6, 603-610 (2004).</li><li>Bachelder, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase-3+is+an+endogenous+inhibitor+of+Snail+transcription:+implication+for+the+epithelial-mesenchymal+transition.">Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription: implication for the epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Cell Biology. 168, 29-33 (2005).</li><li>Pon, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p70+S6+kinase+promotes+epithelial+to+mesenchymal+transition+through+Snail+induction+in+ovarian+cancer+cells.">p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells.</a> Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).</li><li>Wegner, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+changes+in+receptor+tyrosine+kinase+phosphorylation+using+antibody+arrays.">Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li></ol>

R &amp; D Systems, Inc. är ett vinstdrivande, offentliga företag. Produktion och fri tillgång till den här artikeln är sponsrad av R &amp; D Systems, Inc.

Tidigare metoder för EMT induktion har generellt använt TGF-β stimulering eller genetisk modifiering. Fastän TGF-β ensamt har visat sig inducera EMT i vissa celltyper, har det nu visats att TGF-β är nödvändigt för EMT, men det är inte tillräckligt i alla celltyper 6,14. Med hjälp av genetisk modifiering för EMT induktion är tidsödande och arbetsintensivt. Den metod som beskrivs här använder en kombination av faktorer innefattande anti-human-E-cadherin, anti-human sFRP-1, anti-human Dkk-1, rekombinant human Wnt-5a, och rekombinant humant TGF-β1 att tillförlitligt inducerar EMT. Denna kombination av faktorer är utformad för att blockera E-cadherin-baserad adhesion, ett kritiskt steg för EMT induktion 4, och öka Wnt signalering genom att lägga till Wnt-5a-proteinet samt använda blockerande antikroppar till Wnt-hämmare, sFRP-1 och Dkk -1. Wnt-och TGF-β-signalering har visats för att agera i en autokrin loop för att inducera och upprätthålla den mesenkymala cell STATe 6. Denna induktion metod undviker genetisk manipulation och är mer effektivt än att använda TGF-β ensam. Huvudsakligen har vi möjlighet att observera induktion av EMT i celltyper, inklusive MCF7 och PANC-1-celler, som tidigare har visat att inte bara svara på TGF-β stimulering (Figur 5) 14. Celler behandlade med EMT Induktion Media Supplement show mindre kompakt och ökad spindel-formad morfologi (Figur 1). Dessutom finns det en minskning i ytan E-cadherin expression samtidigt med en ökning av Fibronektin uttryck, som är kännetecken för EMT (figurerna 2 och 3). Ytterligare mesenkymala markörer som Vimentin och Snail också uppregleras i EMT inducerade celler jämfört med icke-inducerade kontroller (Figur 4). Ökad migration och invasion förmågor är de viktigaste funktionella egenskaper mesenkymala celler. I in vitro- </em&gt; Migration och invasion analyser, celler som behandlats med tillägget EMT Induktion Media visade en signifikant ökad förmåga att migrera och invadera (Figur 6). Denna enkla metod för EMT induktion är användbar för studium av EMT-signalering såsom visas med hjälp av expressionsdata antikropp array som visas i figur 7. Olika celltyper kan jämföras före och efter-EMT induktion för att få vanliga uttryck signaturer i samband med EMT, exempelvis ökningen av fosforylerad CREB och ERK1 / 2 ses i både MCF7 och A549 EMT-inducerade celler. S133 fosforylering av CREB stimulerar DNA-bindning och har visats verka nedströms av TGF-β1-inducerad EMT 15. ERK1 / 2 fosforylering har även visats verka nedströms av TGF-β1-inducerad EMT 16. Skillnader i signalvägar mellan celltyper kan också belysas såsom ses med ökningen i GSK-3β fosforylering i A549-celler kontra p70S6K fosforylering i MCF7. GSK-3β fosforylering vid serin 9 minskar den funktion och GSK-3β har visats inhibera den pro-EMT transkriptionsfaktör, snigel 17. Däremot p70S6K inducerar Snail aktivitet och dess fosforylering är associerad med aktivering av detta protein 18. Sammantaget, okomplicerad och pålitlig induktion av EMT, särskilt i celler som tidigare visat att inte svara enbart TGF-β, är användbara för att förstå biologin av EMT, identifiera gemensamma uttrycks signaturer för att användas som prognostiska markörer, samt utveckling och utvärdering av nya behandlingar för cancer och fibrotisk sjukdom.

Epitelceller till mesenkymala övergång (EMT) är den process genom vilken en polariserad epitelceller genomgår en rad olika förändringar som resulterar i en mycket rörlig, fibroblast-liknande mesenkymala celler. Denna process sker delvis genom genuttryck förändringar och nedbrytningen av adherensgränssnitten korsningar, vilket resulterar i en ökad förmåga att migrera och invadera. Fysiologiskt, EMT spelar viktiga roller under embryonal utveckling och sårläkning. Förlust av ordentlig kontroll över EMT kan leda till fibros och metastasering av cancer 1,2. Reduktionen av E-cadherin på ytan av epitelceller är ett kritiskt steg i framskridandet av en cell genom EMT 3,4. E-cadherin är en enkelpasstransmembranprotein som direkt interagerar med cadherin proteiner på angränsande celler. Utöver sin roll i celladhesion, E-cadherin influenser cellsignaler via interaktion mellan den cytoplasmatiska svansen av E-cadherin enda olika regulatoriska proteiner, främst β-catenin. β-catenin spelar en roll i stabiliseringen av adherensgränssnitten korsningar. Under canonical Wnt-signalering, är β-catenin frigörs från E-cadherin och translokeras till cellkärnan där den verkar som en nedströms transkriptionsfaktor i Wnt banan 3.4.5. I kärnan, har β-catenin visats öka transkriptionen av flera EMT relaterade faktorer inklusive Twist, Slug, fibronektin, och en mängd matrismetalloproteaser 3,6. Förutom Wnts har TGF-β signalering visats spela en betydande roll i EMT induktion både under normal utveckling och i sjukdomstillstånd 7,8,9. TGF-β är involverad i EMT som inträffar under gommen bildning och i framkallnings hjärta 10. Det har också varit inblandad i fibros och i cancer progression till metastaser 7. Det förfarande som beskrivs här provides konsekvent induktion av EMT i en mängd olika celltyper utan behov av genmanipulation. Denna procedur använder en cocktail av E-cadherin, sFRP-1, och Dkk-1-blockerande antikroppar och Wnt-5a och TGF-β1 rekombinanta proteiner. Denna cocktail är utformad för att blockera E-cadherin-baserade vidhäftning samtidigt förbättra Wnt och TGF-β signalering. Möjligheten för robust EMT induktion är avgörande för att förstå biologin av denna process och hur man manipulerar den för terapeutiska syften. Nuvarande gemensamma markörer för EMT, E-cadherin (nedregleras i EMT) och Vimentin (uppregleras i EMT), finns co-uttrycks i cancer och därmed inte ger den bästa diagnostiska markörer för potentiella metastaserande celler 12. Viktigt är att analysera en mängd olika celltyper som genomgått EMT användbart att utveckla gemensamma genuttryck signaturer som kan användas för diagnostiska ändamål i cancer och fibros 11. Dessutom har nya studier visat att EMT kan spela en roll i bildandet av cancer stamceller, vilket tyder på att celler som har genomgått EMT kan vara användbara för läkemedelsscreening för att identifiera föreningar som kan rikta dessa celler 13.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Epithelial cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT Inducing Media Supplement</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CCM017</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&beta;1</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>240-B</td>
			<td>Used at 10ng/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL648R</td>
			<td>Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin </td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1838</td>
			<td>Used at 0.1 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Fibronectin</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1918</td>
			<td>Used at 10 &mu;g/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>AF5718</td>
			<td>Used at 0.2 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL009</td>
			<td>Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF109</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF007</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>SC026</td>
			<td>Used according to the manufacturer's instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96 Well BME Cell Invasion Assay</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>3455-096-K</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>ARY002B</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations19.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting Media</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CTS011</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15350-061</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>789-704</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fine pointed curved forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>12 mm coverslips</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>633009</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used at 5% in TBST for blocking in western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting blocking and washing</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-20% SDS-page gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plates/flasks, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>24-well plates, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipettes / pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet Aid / pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C/5%CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition

Epitelceller till mesenkymala övergång (EMT) är nödvändig för korrekt morfogenes under utveckling. Felaktig reglering av denna process har varit inblandad som en viktig händelse i fibros och progression av cancer till en metastaserande tillstånd. Att förstå de processer som ligger bakom EMT är absolut nödvändigt för tidig diagnos och klinisk kontroll av dessa sjukdomstillstånd. Pålitlig induktion av EMT in vitro är ett användbart verktyg för läkemedelsutveckling samt att identifiera gemensamma genuttryck signaturer för diagnostiska ändamål. Här visar vi en enkel metod för induktion av EMT i en mängd olika celltyper. Metoder för analys av celler före och efter-EMT induktion genom immuncytokemi ingår också. Dessutom visar vi hur effektiv denna metod genom antikroppsbaserad array analys och migration / invasion analyser.

. EMT inducerande odlingsbetingelser som beskrivs här tillhandahåller en robust metod för induktion av EMT i en mängd olika celltyper Figurerna 1 och 2 visar morfologi och marköruttrycksnivåer för fyra olika humana cellinjer: T98G glioblastomceller, HT29-kolon-adenokarcinomceller , A549 lungkarcinomceller och MCF10A bröstepitelceller. Celler som behandlades med den supplementet EMT Induktion Media ändrades från en klassisk epitelial morfologi (Figurerna 1A - 1D) till en mesenkymal, spindelformad morfologi (fig. 1E - 1 H). EMT-inducerade celler verkade mindre tätt packade i täta kolonier jämfört med icke-inducerade celler. Oinducerad MCF10A proverna innehöll tätt packade kluster omgivna av mer löst packade celler. Dessa tätt packade kluster var E-cadherin positiva (Figur 2D) och försvann efter behandling med EMT Induktion Media Supplement (fig 2H). EMT även bedömas av nedreglering av epiteliala markörer och uppreglering av mesenkymala markörer. Den nedreglering av E-cadherin-uttryck typiskt observeras efter EMT induktion i olika celltyper 3,4 Figur 2 visar ytexpressionen av E-cadherin i majoriteten av obehandlade celler (figurerna 2A - 2D, röd). I jämförelse med dess frånvaro efter EMT induktion (figur 2E - 2H, röd). En cellinje, T98G, befanns ha en extremt låg basal nivå av E-cadherin före EMT induktion, vilket uteslöt sin analys. Uppreglering av mesenkymala markör, fibronektin, var också synlig efter induktion med EMT Induktion Media Supplement (figur 2A - 2D kontra figur 2E - 2H, grön). De uttrycksnivåer av E-cadherin och Fibronectin ses av immuncytokemibekräftades ytterligare genom Western blotting av totala cellysat (figur 3). Den västra blot bekräftade nedreglering av E-cadherin och uppreglering av fibronektin uttryck ses av immunocytokemi. Banden kvantifierades med hjälp av densitometri och normaliseras till GAPDH för att bestämma relativa förändringen veck efter EMT induktion. E-cadherin nivåerna reducerades 6,4 och 3,4-faldigt i A549 och MCF10A celler. Fibronektin nivåer ökades 4,6, 4,1 och 2,3-faldig i T98G, A549, och MCF10A celler. Fastän western blöt inte visar signifikant minskning av E-cadherin-proteinnivåer i HT29-celler efter EMT induktion, de immunocytokemi resultat demonstrerar en reduktion i ytexpression av E-cadherin (Figur 2B versus 2F), som är oförmögen att särskiljas i Western blotting av totala cellysat. För att ytterligare utvärdera EMT status, ytterligare kända markörs för EMT analyserades före och efter-EMT induktion. I överensstämmelse med tidigare resultat, var E-cadherin nedreglerade i alla cellinjer som undersökts, vilket tyder på att EMT inducerades. Dessutom är de mesenkymala markörer, Vimentin och Snail ades uppreglerad vid A549, T98G och MCF10A celler efter behandling med EMT Induktion Media Supplement (Figur 4). Den HT29-cellinjen visade inte uttryck av dessa mesenkymala markörer, antingen med eller utan EMT induktion (data visas ej), vilket kan tyda på att dessa celler utnyttjar alternativa banor för EMT induktion. Fastän TGF-β är tillräcklig för att inducera EMT i vissa cellsammanhang 7,8,9, behöver andra celltyper inte svarar uteslutande på tillsats av TGF-β 14. MCF7 mänskliga bröstcancerceller och PANC-1 humana pankreascancerceller är båda rapporterade inte svara på TGF-β signalering ensam 14. För att avgöra om båda linjerna kan genomgå EMT i VITRo, cellerna odlades i närvaro av tillägget EMT Induktion Media. Celler stimulerades med rekombinant TGF-β1 ensam, vid koncentration Supplement EMT Induktion Media. Dessa celler behöll sin epitelial morfologi, som består av tätt packade kolonier av celler (data visas ej) och yt-E-cadherin nivåerna var liknande de som setts i kontrollceller (figur 5C och 5D kontra fig 5A och 5B). Däremot celler stimuleras med tillägget EMT Induktion Media visade en drastisk minskning av ytan E-cadherin nivåer (figur 5E och 5F). Dessa celler erhölls också en mer mesenkymala morfologi, som celler blev mindre kompakt och mer spindelliknande (data ej visade). Dessa resultat visar att den EMT inducerande metoden som beskrivs här är i stånd att främja EMT morfologi och markörexpressions förändringar i celler som normalt är resistenta mot TGF-β-induced EMT. Förutom förändringar i markör uttryck, är ett annat kännetecken av mesenkymala celler sin förmåga att migrera och invadera. Migration och invasion av celler odlade med eller utan tillägget EMT Induktion Media analyserades med hjälp av 96 väl BME Cell Invasion analys enligt tillverkarens anvisningar. I korthet, cellerna såddes på 96-brunnars plattor (50000 celler / brunn) innehållande filterinsatser med 8,0 um porer. Efter 48 timmar fick migrering bedömdes av kalcein AM-färgning av celler som hade migrerat genom filtret. Varje prov testades i triplikat två gånger med liknande resultat. Representativa resultat från ett experiment visas i figur 6A. Statistiskt signifikanta ökningar (P-värde &lt;0,003) i cell migration sågs med både A549 och PANC-1 celler efter EMT induktion. För att fastställa förmågan hos dessa celler att invadera (dvs. migrera genom extracellulär matris), var samma analysutföras med en basalmembranextrakt belagda filtret. EMT-inducerade celler uppvisade en statistiskt signifikant (p-värde &lt;0,001) ökning i invasionsförmåga jämfört med obehandlade celler, såsom visas i fig. 6B. Den robusta induktion av EMT är användbart för analys av genuttryck förändringar och signalering som sker i dessa celler. Antikroppsbaserade array-analys med användning lysat från både behandlade och obehandlade celler är en metod för att analysera expressionsnivåerna av olika molekyler i ett enda prov. Som ett exempel, analyserade vi halterna av fosforylerade MAPK familjemedlemmar i lysat från un-inducerad och EMT-inducerad MCF7-och A549-celler med hjälp av Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit. Arrayen kördes två gånger från oberoende EMT-induktions behandlingar med liknande resultat. Figur 7 visar representativa data från en matris. Båda celltyper uppvisade ökad fosforylering av CREB (S133), ERK1 (T2<html> 02/Y204) och ERK2 (T185/Y187) i EMT-inducerade celler jämfört med kontroller. Skillnader i signaleringshändelser observerades mellan de två celltyper som väl. A549-celler visade en ökning av GSK-3-β (S9) fosforylering, medan MCF7-celler uppvisade ökad p70S6K (T421/S424) fosforylering. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1.jpg" alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1highres.jpg" fo:width="6in"/> Figur 1. Mesenkymala morfologi induktion efter stimulering med tillägget EMT Induktion Media (A - D). Epitelial morfologi i de fyra celltyper som anges efter kultur i 5 dagar i standardodlingsmedier utan tillägget EMT Induktion Media (E - H). Mesenkymala morfologi i fyra celltyper indikerade odlade med EMT Induktion Media Tillägg för 5 dagar. nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; alltid &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2.jpg" alt="Figur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2highres.jpg" fo:width="6in"/> Figur 2. Nedreglering av epitelial markör uttryck och uppreglering av mesenkymal markör expression i EMT-inducerade celler. Celler färgades genom immunfluorescens för att detektera uttrycket av den epiteliala markör, E-cadherin (röd) och mesenkymala markör, fibronektin (grön). (A - D) Kontroll celler odlade utan EMT Induktion Media Tillägg för 5 dagar (E -. H) Celler odlade med EMT Induktion Media Tillägg för 5 dagar. Alla cellerna motfärgades med DAPI (blå). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig3.jpg" alt="Figur 3"/> Figur 3. Bekräftelse av epitel och mesenkymala markör uttryck med Western blot en<html> . ALYS Western blöt av totala cellysat av de fyra celltyper indikeras, behandlades med (EMT) eller utan (-) EMT Induktion Media Tillägg för fem dagar. Band för E-cadherin, fibronektin, och GAPDH-laddningskontroll blir den som anges till vänster. Storleken markör är som visas till höger. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig4.jpg" alt="Figur 4"/> Figur 4. Uppreglering av de mesenkymala markörer, Vimentin och Snail i EMT-inducerade celler. Cellerna färgades genom multicolor immunofluorescens för att detektera uttryck av den epiteliala markör, E-cadherin (grå), och de mesenkymala markörer Vimentin (grön) och Snail (röd) . (A - C) Kontroll celler odlade utan EMT Induktion Media tillägg i 5 dagar. (D - F) Celler odlade med EMT Induktion Media Tillägg för 5 dagar. lways &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5.jpg" alt="Figur 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5highres.jpg" fo:width="6in"/> Figur 5. Induktion av EMT i TGF-β1 icke-responsiva celler. (A och B) Celler odlade med enbart medium under 5 dagar. (C och D) celler odlade i medium innehållande 10 ng / ml av TGF-β1 i 5 dagar. (E och F)-celler odlade i EMT Induktion Media Tillägg för fem dagar. Alla celler färgades med avseende på E-cadherin-uttryck (röd) och motfärgades med DAPI (blå). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig6.jpg" alt="Figur 6"/> Figur 6. EMT-inducerade celler har ökat migration och invasion kapaciteter. A. Genomsnittlig antal celler som migrerade genom 8 | im por-filter efter inkubation i 48 timmar. B. Medeltalceller som kunde invadera genom en 8 | im por-filter belagda med basalmembranextraktet efter inkubering under 48 tim. Felstaplar anger standardavvikelse över tre brunnar. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig7.jpg" alt="Figur 7"/> Figur 7. Antikroppsbaserade samling uttrycksanalys av EMT induktion. Lysat från A549 (A och C) och MCF7 (B och D) celler odlade med eller utan EMT Induktion Media Supplement användes för array-analys med användning av Proteome Profiler Human fosfo-MAPK Array Kit. Fläckar markerade i A och B därefter kvantifieras med hjälp av densitometri. Jämförelser av un-inducerade att EMT-inducerade lysat visas i motsvarande stapeldiagram nedan (C och D). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50478/50478fig7large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild &lt;</a>/ A&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition Video at JoVE.com

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition Video (Video) | JoVE

Ett enkelt förfarande beskrivs för induktion av epitelial till mesenkymala övergång (EMT) i en mängd olika celltyper. Metoder för analys av celler i EMT stater genom immuncytokemi ingår.

Induktion och Analys av Epithelial till mesenkymala övergång

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Research

JoVE Journal

Biology

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Light/dark Transition Test for Mice

Light/dark Transition Test for Mice Video (Video) | JoVE

Ljus / mörk Transition Test för möss

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity Video (Video) | JoVE

En Neuronal och astrocyternas Co-Kultur-analys för High innehållsanalys av Neurotoxicitet

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis Video (Video) | JoVE

Live-cell imaging och kvantitativ analys av embryonala epitelceller i Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP Video (Video) | JoVE

Kromatin Isolering av RNA Rening (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration Video (Video) | JoVE

Snabb genetisk analys av Epithelial-mesenkymala Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor Video (Video) | JoVE

Isolering och kultur av Dental epitelceller stamceller från vuxen mus Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition Video (Video) | JoVE

Upptäckt av alternativ splits Under Epithelial-Mesenkymala Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Manipulating the Murine Lacrimal Gland Video (Video) | JoVE

Manipulera Murin tårkörteln

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa Video (Video) | JoVE

Cryosectioning Förfarande för Microdissection av murin kolonslemhinna

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model Video (Video) | JoVE

Magnetisk-aktiverad Cell sortering strategier för att isolera och rena Synovial vätska-Derived mesenkymala stamceller från en kanin-modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...