Name: differentiation of newborn mouse skin derived stem cells into germ-like cells in vitro
Uploaded: 2013-07-16T13:00:00
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PWD wird von einem kanadischen Institutes of Health Research Fellowship (CIHR) und einen Zuschuss für CIHR Gerald M. Kidder bei Western University unterstützt. Der Autor möchte auch Julang Li an der University of Guelph bestätigen für die Hilfe bei der Entwicklung des hier vorgestellten Protokoll.

1. Nährmedienzubereitung <ol><li> Bereiten Medien 2-3 Stunden im Voraus über die Verwendung und Ort mit einem gelockerten Kappe in der Zellkulturbrutschrank wo das Experiment stattfindet. Medien in der vorliegenden Protokoll verwendet: <ol><li> Bereiten Stammzellen, das aus DMEM/F12 mit 1 x B27, 40 ng / ml bFGF und 20 ng / ml EGF ergänzt. </li><li> Bereiten Keim Zelldifferenzierungsmedium bestehend aus M199 mit 0,05 IU FSH, LH 0,03 IU, 3 mg / ml BSA, 5 ul / ml ITS, 0,23 mM Natriumpyruvat, 1 mg / ml Fetuin und 1 ng ...

<ol>
	<li>van den Hurk, R., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+mammalian+oocytes+and+their+growth,+differentiation+and+maturation+within+ovarian+follicles.">Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles.</a> Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).</li><li>Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+analysis+of+living+mouse+germ+cell+migration.">Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration.</a> Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).</li><li>Lawson, K. A., Hage, W. 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W., Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+germ+line+potential+of+stem+cells+derived+from+newborn+mouse+skin.">In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin.</a> PLoS One. 6, e20339 (2011).</li><li>Linher, K., Dyce, P., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primordial+germ+cell-like+cells+differentiated+in+vitro+from+skin-derived+stem+cells.">Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells.</a> PLoS One. 4, e8263 (2009).</li><li>Hayashi, K., Ogushi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Offspring+from+Oocytes+Derived+from+in+Vitro+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+in+Mice.">Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice.</a> Science. , (2012).</li></ol>

Um funktionelle OLCs bisher nicht entwickelt worden, mit einer komplett in-vitro-Assay. Vor kurzem wurde eine Studie von Hayashi et al. Konnte Nachkommen von PGC-ähnlichen Zellen in vitro gebildet und übertragen in vivo für die weitere Entwicklung 14 produzieren. Beginnend mit ES-Zellen oder induzierten pluripotenten Zellen konnten sie PGC wie Zellen, die, wenn nach in vivo Transplantation erholt bilden konnten gereift, befruchtet werden, und verwendet werden, u...

Während der frühen Embryogenese kommt Gametogenese durch eine Reihe von Stufen einschließlich Urkeimzelle (PGC) Bildung, Migration und schließlich Kolonisierung der Gonaden Grate. Während dieser Zeit PGCs unterziehen Proliferation und Differenzierung in immer mehr reifen Gameten 1. Die Tatsache, dass PGCs von der Basis der Allantois in den Embryo Enddarm und schließlich entlang der dorsalen Wand schließlich Kolonisierung der Gonaden Grate migrieren macht sie außerordentlich schwierig, 2 studieren. Trotz der Fortschritte in diesem Bereich, haben Studien versuchen, PGC Bildung und Differenzierung zu verstehen durch ihre begrenzte Anzahl, Lage und wandernde 3,4 behindert worden. In den letzten Jahren embryonalen Stammzellen haben gezeigt, dass das Potential, Keimzellen in vitro 5,6 bilden. In ähnlicher Weise wurden verschiedene somatische Stammzellen auch gezeigt, dass das Potential zur Bildung von Keimzellen foll habenwegen in vitro Kultivierung 7-11. Kürzlich Stammzellen aus der Haut von Mäusen isoliert Neugeborenen wurden in vitro in Keim-ähnlichen Zellen und frühen Oozyten 12 differenziert. Während der Differenzierung die Teilmenge der Stammzellen exprimiert Oct4 erhöht und ähnlichen Strukturen Cumulus-Oozyten-Komplexe gebildet wurden. Die Oozyten-ähnliche Zellen (OLC) aus den Kulturen aufgenommen und im Vergleich zu natürlichen Oozyten. Mit dieser Kultur Verfahren OLCs Messung 40-45 um erhalten, dass express ähnliche Markierungen, um Eizellen wie Gdf9b, VASA und DAZL. Bis heute bleiben die resultierenden OLCs nicht fällig oder befruchtete 12. Obwohl die OLCs bleiben nicht in der Lage zu funktionieren, das Protokoll verwendet, um diese OLCs bilden können noch Nutzen als Test, um die Entstehung und Entwicklung des früheren Stadium Keimzellen innerhalb studieren ein in vitro System geschlossen. Die ursprüngliche Veröffentlichung diskutieren die Bildung von so OLCsmatic Stammzellen genutzt fetalen Schweinehaut als Stammzell-Quelle 8. Aufbauend auf dieser Studie die PGC-ähnlichen Zellen früh während induzierte Differenzierung gebildet wurde gezeigt, dass die Vorstufen der OLCs und Eil wie PGC Marker als OCT4, VASA, STELLA, C-KIT und DAZL 13. Diese Daten unterstützen das Potenzial der Verwendung dieses Systems zu Keimzellbildung und Differenzierung in vitro zu untersuchen. Das Protokoll verwendet werden, um OLCs aus neugeborenen Maus Haut bilden wird in diesem Video-Artikel gezeigt werden. Dieses Protokoll bietet ein in vitro Modell zur Keimzelle Entwicklung, die ein Mittel zur Aufklärung wichtige Faktoren für die Proliferation und Differenzierung bieten kann studieren.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0266</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ITS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-6003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetuin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3385</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FSH</td>
			<td>Sioux Biochemicals</td>
			<td>915</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LH</td>
			<td>Sioux Biochemicals</td>
			<td>925</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>M199</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31100-035</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>144530</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 cm dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

differentiation of newborn mouse skin derived stem cells into germ-like cells in vitro

Studieren Keimzellbildung und Differenzierung ist traditionell sehr schwierig aufgrund der geringen Zellzahlen und ihre Lage tief in sich entwickelnden Embryonen. Die Verfügbarkeit eines &quot;geschlossenen&quot; in vitro System könnte von unschätzbarem Wert für unser Verständnis der Gametogenese. Die Bildung der Eizelle-ähnlichen Zellen (OLC) von somatischen Stammzellen, aus neugeborenen Maus Haut isoliert, hat sich gezeigt und visualisiert werden in diesem Video-Protokoll. Die resultierenden OLCs auszudrücken verschiedenen Markern im Einklang mit Eizellen wie Oct4, Vasa, BMP15 und SCP3. Allerdings bleiben sie nicht in der Lage, um die Reifung oder Befruchtung aufgrund eines Fehlers zu vervollständigen Meiose durchlaufen. Dieses Protokoll wird ein System, das nützlich für die Untersuchung der frühen Bildung und Differenzierung von Keimzellen in reifer Keimzellen ist. Während der frühen Differenzierung die Anzahl der Zellen, die Oct4 (potentiellen Keim-ähnlichen Zellen) erreicht ~ 5%, jedoch derzeit die formation von OLCs bleibt relativ ineffizient. Das Protokoll ist relativ geradlinig, aber auch besondere Vorsicht geboten, um sicherzustellen, dass die ab-Zell-Population ist gesund und in einer frühen Passage werden.

Zunächst werden die Zellen auf der Kulturschale Boden anlagern und ausbreiten. Bei 42-72 h in Differenzierung kleine suspendiert OCT4 positive Zellen zu bilden und vermehren (Abbildung 1A). Kurz nach der Visualisierung dieser Zellen die Mehrheit wird verschwinden und die anhaftenden Zellen entsteht dichter Kolonie Aggregate auf die Kultur Boden zu bilden. Nach ein paar Tagen wird diese Aggregate aus der Kultur Oberfläche lösen. In einigen dieser Aggregate eine große Zelle zu beobachten (Abb....

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Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In den letzten Jahren ist die Bildung von Keimzellen mit in-vitro-Kultur Methoden nachgewiesen wurde mit mehreren verschiedenen Arten von somatischen Stammzellen. Dieser Artikel wird visuell präsentieren die Differenzierung der neugeborenen Maus-Stammzellen zu frühen Oozyten-ähnlichen Zellen.

Differenzierung von Newborn Mäusehaut Derived Stem Cells in Germ-like Cells<em&gt; In-vitro-</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

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