Name: trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model
Uploaded: 2013-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Society for forebyggelse af blindhed (JCC, AAF), frie midler til Department of Ophthalmology fra forskning til at forebygge blindhed (RPB), NY og RPB Medical Student Fellowship Grant (JCC).

1.. Retinal Forberedelse <ol><li> Enucleate musen øjet. Brug den ene hånd, åbne øjenlåg, så øjet er synligt. Med den anden hånd, ved hjælp af en buet pincet (buede opad) lægge pres på overlegne og ringere aspekter af kredsløb, før globussen stikker. Luk forsigtigt pincet på den bageste del af øjet og løfte i en kontinuerlig bevægelse for at enucleate øjet. </li><li> Lave øje med 10% neutral bufret formalin i mindst 24 timer. </li><li> Sted øje i PBS-opløsning i en lille petriskål. </li><li> Disse...

<ol>
	<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture.">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).</li><li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+patterns.+VII.+Acellular+change.">Retinal vascular patterns. VII. Acellular change.</a> Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).</li><li>Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathologic+and+trypsin+digestion+studies+of+the+retina+in+incontinentia+pigmenti.">Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti.</a> Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).</li><li>Danis, R. P., Wallow, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRP/trypsin+technique+for+studies+of+the+retinal+vasculature.">HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).</li><li>Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+studies+of+the+retina+in+a+new+diabetic+model;+SHR/N:Mcc-cp+rat.">Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat.</a> Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).</li><li>Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+mouse+retina.+Endothelial+cell-pericyte+ratio+and+capillary+distribution.">Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).</li><li>Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+procedures+for+isolating+intact+retinal+vascular+beds+from+diabetic+humans+and+animal+models.">Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).</li><li>Midena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+retina+of+the+diabetic+db/db+mouse.+I.+Endothelial+cell-pericyte+ratio.">Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio.</a> Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+30.">Chapter 30.</a> Diabetic Retinopathy. , (2005).</li><li>Rosenblatt, B., Benson, W. E., Yannoff, M., Duker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6.19+Diabetic+Retinopathy.">Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy.</a> Ophthalmology. , (2008).</li><li>Friedenwald, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+some+problems+of+retinal+vascular+disease.">A new approach to some problems of retinal vascular disease.</a> Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).</li><li>Podesta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bax+is+increased+in+the+retina+of+diabetic+subjects+and+is+associated+with+pericyte+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro.</a> Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).</li><li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy.">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).</li><li>Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-term+siRNA+strategy+regulates+fibronectin+overexpression+and+improves+vascular+lesions+in+retinas+of+diabetic+rats.">A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats.</a> Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+eNOS-knockout+mice+develop+accelerated+retinopathy.">Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).</li></ol>

Trypsin fordøjelse er en standardmetode til vurdering vaskulaturen af ​​nethinden. Desværre er det teknisk udfordrende og kan resultere i høj prøve tab, hvis ikke udført korrekt. Desuden procedure er særlig vanskelig i mus, hvilket kan begrænse anvendelsen af ​​denne teknik i de almindeligt anvendte genetiske dyremodeller for øjensygdomme. Dette papir giver vejledning om, hvordan du udfører proceduren effektivt og konsekvent i mus øjne. Der er flere kritiske trin i protokol...

Visualisere vaskulaturen af ​​nethinden er en ekstremt vigtig at dissekere de mekanismer af forskellige øjensygdomme, såsom diabetisk retinopati. Det tillader en at vurdere de tidligste vaskulære abnormiteter, herunder mikroaneurismer, kapillær degeneration og pericyt tab 8,9. Til dato har der været flere teknikker udviklet til at analysere den retinale vaskulatur. Perfusion af forskellige farvestoffer er blevet brugt til at fremhæve de skibe, men alle har delt lignende begrænsninger. Injektion sjældent fremhæver hele retinal vaskulatur medmindre gives på et højt pres, hvilket risikerer brud og beskadige fartøjer 1.. Immunofarvning af vaskulær endotel med fluoroforen-mærket G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 konjugeret, I21413, Invitrogen, 1:100 fortynding) og nethinde flade mounts kan fremhæve den overordnede arkitektur af skibene, men uden nærmere visualisering af kapillærer, kælderen membraner og pericytter . Det blev bemærket afFriedenwald at fartøjer kan fremhæves ved farvning flat-mounts af nethinden med periodisk syre-Schiff (PAS), eller hematoxylin og eosin (H &amp; E) farvning 10.. Men farvning var ikke-specifik for skibene og fremhævede den ikke-vaskulære væv samt, hvilket gør det vanskeligt at skelne skibene. I 1960&#39;erne udviklede Cogan og Kuwabara trypsin fordøje teknik, der gjorde det nemmere at visualisere den retinale kar ved at fordøje nonvascular komponenter af nethinden 1.. Siden dengang er trypsin fordøje blevet den gyldne standard metode til at analysere kar i nethinden 2-5. Men det er vigtigt at bemærke, at andre alternative teknikker til at isolere vaskulaturen er blevet beskrevet. Anvendelsen af osmotiske lysis er blevet anvendt til at isolere vaskulaturen og tillade biokemiske undersøgelser af væv 11,12, men proceduren er ikke blevet anvendt som en primær metode til anatomisk undersøgelse. Vævet print-metoden har væretanvendt til at isolere store segmenter af mikrovaskulaturen og giver mulighed for at studere electrotonic arkitektur karrene 13.. I teorien kunne denne teknik også anvendes til at studere anatomiske ændringer, da kvaliteten af ​​de fartøjer, er høj. Men det er kun i stand til at isolere segmenter af hele vaskulatur netværket. Selv om disse metoder ikke kan erstatte trypsin fordøjelse, er det vigtigt at bemærke, at de har forskellige fordele og ulemper og er komplementære i denne henseende. Trypsin Digest metode er teknisk udfordrende og er vanskelig at udføre konsekvent 6,7. Desuden er det blevet bemærket, at trypsin fordøjelse er særlig svært på en musemodel, især hvis man ønsker at bevare den samlede vaskulære arkitektur af nethinden 6,7. Udfordringer omfatter (1) over-fordøjelse af nethinden, der forårsager tab af både kar såvel som ikke-vaskulært væv, (2) under-fordøjelse, kræveromfattende mekanisk dissektion, som kunne føre til en beskadigelse af fartøjet seng, (3) dårlig adskillelse af den ikke-vaskulære væv fra vaskulaturen fører til ikke-specifik farvning. Adskillige håndskrifter har fremhævet disse udfordringer, men ingen har givet et detaljeret og konsekvent protokol at overvinde dem 14,15. Dette håndskrift vil indføre en trin-for-trin metode beskriver teknikken til at udføre trypsin fordøje på mus og rotter nethinder med specifikke tips om håndtering af de særligt vanskelige skridt. En skematisk oversigt er vist i figur 1..

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (1:250)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0458-50G</td>
			<td>Make 3% trypsin in 0.1 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td>Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 &deg;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253-500G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop sterile vacuum bottle</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td>Create filtered water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td>Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Forceps (Inox)</td>
			<td>Dumont #5</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forcepts (Dumostar)</td>
			<td>Dumont #7</td>
			<td>11297-10</td>
			<td>Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubnoff Metabolic Shaker Incubator</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>BDG59442</td>
			<td>Shaker optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-132</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model

Trypsin digest er guld standard metode til at analysere den retinale kar 1-5. Den tillader visualisering af hele netværket af komplekse tredimensionale retinale blodkar og kapillærer ved at skabe en todimensional flade-mount sammenkoblede vaskulære kanaler efter fordøjelse af ikke-vaskulære komponenter af nethinden. Dette gør det muligt at undersøge forskellige patologiske vaskulære ændringer, såsom mikroaneurismer, kapillær degeneration og abnorm endotel til pericyt forhold. Men den metode er teknisk udfordrende, især i mus, som er blevet den mest udbredte dyremodel til at studere nethinden på grund af den lette genetiske manipulationer 6,7. Hos mus øje, er det særligt vanskeligt helt at fjerne ikke-vaskulære komponenter, samtidig med at den samlede opbygning af retinale blodkar. Til dato er der en mangel på litteratur, der beskriver trypsin digest teknikken i detaljer in musen. Dette håndskrift giver en detaljeret trin-for-trin metode af trypsin digest i muse nethinden, og samtidig give tips om fejlfinding vanskelige skridt.

Det endelige produkt af en vellykket procedure er en flad-mount af hele nettet af muse nethinden vaskulatur med arkitekturen bevares, farvet med enten PAS / hematoxylin eller H &amp; E, som vist i figurerne 2-4. Klar differentiering af endotelceller og pericytter kan ses som vist i figur 3. I nethinden, er kernerne af endotelceller ovale eller aflange og ligge helt inden for karvæggen. Pericyt kerner er små, sfæriske, bejdse tæt og har generelt en udstående position langs kapillær...

Watch this Scientific Journal Video about Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model at JoVE.com

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsin fordøjelse er en af ​​de mest almindeligt anvendte metoder til at analysere retinal vaskulatur. Dette håndskrift beskrives metoden i detaljer, herunder centrale ændringer for at optimere teknikken og fjerne ikke-vaskulære væv og samtidig bevare den overordnede arkitektur af skibene.

Trypsin Digest protokol Analyser Retinal kar en musemodel

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morfometriske Analyser af Retina Sektioner

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

En visuel beskrivelse af dissektion af cerebral Surface vaskulatur og associerede meninges og choroid plexus fra rottehjerne

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Gennemførelse Dynamic Clamp med Synaptic og Artificial konduktanser i Mus retina-ganglieceller

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Hornhindens Micropocket assay: En model af angiogenese i mus Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomeraseaktivitet i de forskellige regioner i Mouse Brain: Ikke-radioaktivt Telomerase Gentag Amplifikationsprotokol (TRAP) Indhold

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

Video Imaging og Maps Spatiotemporal at analysere gastrointestinale motilitet i mus

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

Protokol til isolering af Mouse Circle of Willis

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...