Name: trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model
Uploaded: 2013-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Vereniging voor Preventie van Blindheid (JCC, AAF), onbeperkte middelen om de afdeling Oogheelkunde van het Onderzoek om Blindheid (RPB) voorkomen, NY en RPB Medical Student Fellowship Grant (JCC).

1. Retinale Voorbereiding <ol><li> Ophelderen van de muis oog. Met een hand, opent de oogleden zodat het oog zichtbaar is. Bij de andere kant, met een gebogen pincet (gebogen naar boven), druk uitoefenen op superieure en inferieure aspecten van de baan tot de wereld uitsteekt. Sluit tang op het achterste deel van het oog en til in een continue beweging voor het oog ophelderen. </li><li> Bevestig oog met 10% neutraal gebufferde formaline gedurende tenminste 24 uur. </li><li> Plaats eye in PBS oplossing in een kleine pe...

<ol>
	<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture.">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).</li><li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+patterns.+VII.+Acellular+change.">Retinal vascular patterns. VII. Acellular change.</a> Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).</li><li>Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathologic+and+trypsin+digestion+studies+of+the+retina+in+incontinentia+pigmenti.">Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti.</a> Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).</li><li>Danis, R. P., Wallow, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRP/trypsin+technique+for+studies+of+the+retinal+vasculature.">HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).</li><li>Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+studies+of+the+retina+in+a+new+diabetic+model;+SHR/N:Mcc-cp+rat.">Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat.</a> Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).</li><li>Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+mouse+retina.+Endothelial+cell-pericyte+ratio+and+capillary+distribution.">Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).</li><li>Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+procedures+for+isolating+intact+retinal+vascular+beds+from+diabetic+humans+and+animal+models.">Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).</li><li>Midena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+retina+of+the+diabetic+db/db+mouse.+I.+Endothelial+cell-pericyte+ratio.">Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio.</a> Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+30.">Chapter 30.</a> Diabetic Retinopathy. , (2005).</li><li>Rosenblatt, B., Benson, W. E., Yannoff, M., Duker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6.19+Diabetic+Retinopathy.">Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy.</a> Ophthalmology. , (2008).</li><li>Friedenwald, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+some+problems+of+retinal+vascular+disease.">A new approach to some problems of retinal vascular disease.</a> Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).</li><li>Podesta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bax+is+increased+in+the+retina+of+diabetic+subjects+and+is+associated+with+pericyte+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro.</a> Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).</li><li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy.">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).</li><li>Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-term+siRNA+strategy+regulates+fibronectin+overexpression+and+improves+vascular+lesions+in+retinas+of+diabetic+rats.">A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats.</a> Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+eNOS-knockout+mice+develop+accelerated+retinopathy.">Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).</li></ol>

Trypsine digest is een standaardmethode om de vasculatuur van het netvlies te beoordelen. Helaas, het is technisch uitdagend en kan leiden tot een hoge mate van specimen verlies indien niet correct uitgevoerd. Verder is de bijzonder moeilijk in muizen, waarin de toepassing van deze techniek in het algemeen gebruikte genetische diermodellen van oogziekten kunnen beperken. Dit document geeft richtlijnen over hoe de procedure doeltreffend en consequent uit te voeren in de muis ogen. Er zijn een...

Visualiseren van de vasculatuur van het netvlies is een zeer belangrijke aanpak de mechanismen van verschillende oogziekten zoals diabetische retinopathie ontleden. Het maakt het mogelijk om de vroegste vasculaire afwijkingen, waaronder microaneurysms, capillaire degeneratie, en pericyte verlies 8,9 beoordelen. Tot op heden zijn er diverse technieken ontwikkeld om de retinale vasculatuur analyseren geweest. Perfusie van verschillende kleurstoffen is gebruikt om de schepen te markeren, maar ze hebben allemaal dezelfde beperkingen als gedeeld. Injectie zelden benadrukt het gehele retinale vasculatuur indien gegeven bij een hoge druk, welke risico scheuren en beschadiging van de vaten 1. Immunokleuring van vasculaire endotheel met fluorofoor-gelabelde G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 geconjugeerd; I21413, Invitrogen, 1:100 verdunning) en retinale platte mounts kan de algemene architectuur van de schepen te markeren, maar zonder gedetailleerde visualisatie van haarvaten, basaalmembranen en pericytes . Het werd opgemerkt doorFriedenwald dat schepen door kleuring flatscreen-mounts van het netvlies met periodieke zuur-Schiff (PAS) of hematoxyline en eosine (H &amp; E) kleuring 10 kan worden gemarkeerd. Echter, kleuring was niet specifiek voor de vaartuigen en wezen niet-vasculaire weefsels alsmede, waardoor het moeilijk om de schepen differentiëren. In de jaren 1960, en Cogan Kuwabara ontwikkelde de trypsine digestie techniek die het gemakkelijker gemaakt om de retinale vasculatuur visualiseren digereren de vasculaire componenten van de retina 1. Sinds die tijd heeft het trypsine digest uitgegroeid tot de gouden standaard methode in het analyseren van het vaatstelsel van het netvlies 2-5. Het is echter belangrijk op te merken dat andere alternatieve technieken voor de vasculatuur isoleren zijn beschreven. Het gebruik van osmotische lysis is gebruikt om de vasculatuur te isoleren en laat biochemische studies van het weefsel 11,12, maar de procedure niet is gebruikt als een primaire methode voor anatomische studie. Het weefsel print-methode is geweestgebruikt om grote segmenten van capillairen isoleren en laat de mogelijkheid om de elektrotone architectuur van de vasculatuur 13 bestuderen. In theorie zou deze techniek ook gebruikt worden om anatomische veranderingen te bestuderen, aangezien de kwaliteit van de vaten hoog. Het is echter alleen in staat om delen van het gehele vaatstelsel netwerk isoleren. Hoewel deze methoden niet kan vervangen trypsine verteren, is het belangrijk op te merken dat ze verschillende voordelen en tekortkomingen en zijn complementair in dit verband. De trypsine digest methode is technisch uitdagend en moeilijk om consequent 6,7 voeren. Voorts is geconstateerd dat trypsine digestie bijzonder moeilijk een muismodel, vooral wanneer men wenst de algemene vasculaire architectuur van de retina 6,7 bewaren. Uitdagingen omvatten (1) over-digestie van het netvlies dat het verlies van zowel de vasculatuur en niet-vasculair weefsel veroorzaakt, (2) onder-digestie, waarbijuitgebreide mechanische dissectie hetgeen weer leiden tot beschadiging van het membraan bed, (3) slechte scheiding van de niet-vasculair weefsel van het vaatstelsel leidt tot niet-specifieke kleuring. Verschillende handschriften hebben gewezen op deze uitdagingen, maar niemand heeft een gedetailleerde en consistente protocol om ze te overwinnen 14,15. Dit manuscript zal een stap-voor-stap methode waarin de techniek om de trypsine digest uitvoeren op muizen en ratten netvliezen met concrete tips over het omgaan met de bijzonder moeilijke stappen te introduceren. Een schematisch overzicht in figuur 1.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (1:250)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0458-50G</td>
			<td>Make 3% trypsin in 0.1 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td>Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 &deg;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253-500G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop sterile vacuum bottle</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td>Create filtered water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td>Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Forceps (Inox)</td>
			<td>Dumont #5</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forcepts (Dumostar)</td>
			<td>Dumont #7</td>
			<td>11297-10</td>
			<td>Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubnoff Metabolic Shaker Incubator</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>BDG59442</td>
			<td>Shaker optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-132</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model

Trypsine digest is de gouden standaard methode voor het analyseren van de retinale vaatstelsel 1-5. Het maakt visualisatie van het gehele netwerk van complexe driedimensionale retinale bloedvaten en haarvaten door een tweedimensionale platte bevestiging van de verbonden vasculaire kanalen na digestie van de niet-vasculaire componenten van de retina. Hierdoor kan men verschillende pathologische vasculaire veranderingen, zoals microaneurysms, capillaire degeneratie en abnormale endotheliale te pericyte verhoudingen bestuderen. De methode is technisch moeilijk, vooral muizen, die de meest beschikbare diermodel om retina studie vanwege het gemak van genetische manipulaties 6,7 geworden. In de muis oog, is het bijzonder moeilijk de niet-vasculaire componenten volledig verwijderen terwijl de algehele architectuur van de retinale bloedvaten. Tot op heden is er een gebrek aan literatuur die de trypsine digest techniek beschrijft in detail in de muis. Dit manuscript bevat een gedetailleerde stap-voor-stap methode van de trypsine digest in muisretina, terwijl het ook tips over het oplossen van problemen moeilijke stappen.

Het eindproduct van een succesvolle procedure is een platte montage van het gehele netwerk van de muis retinale vasculatuur, met de architectuur behouden, gekleurd met ofwel PAS / hematoxyline of H &amp; E, zoals getoond in figuren 2-4. Duidelijke differentiatie van endotheliale cellen en pericyten te zien zoals weergegeven in figuur 3. In de retina, de kernen van endotheelcellen ovaal of langwerpig en liggen geheel binnen de vaatwand. Pericyte kernen zijn kleine, bolvormige, vlek dicht...

Watch this Scientific Journal Video about Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model at JoVE.com

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsine digest is een van de meest gebruikte methoden voor retinale vasculatuur analyseren. Dit manuscript beschrijft de methode in detail, met inbegrip van belangrijke wijzigingen aan de techniek te optimaliseren en te verwijderen van de niet-vaatweefsel met behoud van de algehele architectuur van de schepen.

Trypsine Digest Protocol bij het netvlies Vasculature van een muismodel Analyseer

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Patch Clamp Opnamen van Mouse Retinal Neuronen in een donker aangepaste Slice Voorbereiding

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Ontleding van een muis Oog voor een hele berg van de retinaal pigment epitheel

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Een Optic Nerve Crush letsel muismodel om retinale ganglion cel Survival Study

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morfometrische analyses van het netvlies secties

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

Een visuele beschrijving van de dissectie van de Cerebral Surface vaatstelsel en de geassocieerde hersenvliezen en het Choroid Plexus van Rat Brain

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Uitvoering Dynamic Klem met Synaptic en kunstmatige geleidingen Mouse in retinale ganglioncellen

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

De Cornea micropocket Analyse: Een model van angiogenese in de muis Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase activiteit in de verschillende regio&#39;s van de hersenen van muizen: Non-Radioactive Telomerase Herhaal Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

Video Imaging en Maps Spatiotemporal om gastro-intestinale motiliteit analyseren in Muizen

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

Protocol voor het isoleren van de muis Cirkel van Willis

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...