Name: trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model
Uploaded: 2013-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model at JoVE.com

Ce travail a été partiellement financé par le NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Société pour la Prévention de la Cécité (JCC, AAF), les fonds non affectés au Département d&#39;ophtalmologie de la recherche pour prévenir la cécité (RPB), New York et RPB étudiant en médecine Fellowship Grant (JCC).

1. Préparation rétinienne <ol><li> Énucléer l&#39;oeil de la souris. En utilisant une main, ouvrir les paupières de sorte que l&#39;œil est visible. Avec l&#39;autre main, à l&#39;aide d&#39;une pince courbes (courbes vers le haut), appliquer une pression sur les aspects supérieurs et inférieurs de l&#39;orbite jusqu&#39;à ce que les dépasse globe. Fermez doucement forceps à la partie postérieure de l&#39;œil et de soulever dans un mouvement continu pour énucléer l&#39;œil. </li><li> Corrigez les yeux...

<ol>
	<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture.">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).</li><li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+patterns.+VII.+Acellular+change.">Retinal vascular patterns. VII. Acellular change.</a> Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).</li><li>Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathologic+and+trypsin+digestion+studies+of+the+retina+in+incontinentia+pigmenti.">Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti.</a> Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).</li><li>Danis, R. P., Wallow, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRP/trypsin+technique+for+studies+of+the+retinal+vasculature.">HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).</li><li>Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+studies+of+the+retina+in+a+new+diabetic+model;+SHR/N:Mcc-cp+rat.">Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat.</a> Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).</li><li>Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+mouse+retina.+Endothelial+cell-pericyte+ratio+and+capillary+distribution.">Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).</li><li>Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+procedures+for+isolating+intact+retinal+vascular+beds+from+diabetic+humans+and+animal+models.">Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).</li><li>Midena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+retina+of+the+diabetic+db/db+mouse.+I.+Endothelial+cell-pericyte+ratio.">Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio.</a> Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+30.">Chapter 30.</a> Diabetic Retinopathy. , (2005).</li><li>Rosenblatt, B., Benson, W. E., Yannoff, M., Duker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6.19+Diabetic+Retinopathy.">Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy.</a> Ophthalmology. , (2008).</li><li>Friedenwald, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+some+problems+of+retinal+vascular+disease.">A new approach to some problems of retinal vascular disease.</a> Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).</li><li>Podesta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bax+is+increased+in+the+retina+of+diabetic+subjects+and+is+associated+with+pericyte+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro.</a> Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).</li><li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy.">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).</li><li>Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-term+siRNA+strategy+regulates+fibronectin+overexpression+and+improves+vascular+lesions+in+retinas+of+diabetic+rats.">A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats.</a> Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+eNOS-knockout+mice+develop+accelerated+retinopathy.">Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).</li></ol>

Trypsine digest est une méthode standard pour évaluer la vascularisation de la rétine. Malheureusement, il est techniquement difficile et peut entraîner des taux de perte de spécimen s&#39;il n&#39;est pas effectué correctement. En outre, la procédure est particulièrement difficile chez la souris, ce qui peut limiter l&#39;application de cette technique dans les modèles animaux génétiques couramment utilisés de maladies oculaires. Ce document fournit des conseils sur la façon d&#39;exécuter de manière eff...

Visualiser la vascularisation de la rétine est une approche extrêmement important de disséquer les mécanismes de diverses maladies oculaires comme la rétinopathie diabétique. Il permet d&#39;évaluer les anomalies vasculaires premières, y compris les micro-anévrismes, la dégénérescence et la perte capillaire pericyte 8,9. À ce jour, il ya eu plusieurs techniques mises au point pour analyser la vascularisation rétinienne. Perfusion de divers colorants a été utilisé pour mettre en évidence les vaisseaux, mais tous ont partagé les mêmes limites. Injection met rarement toute la vascularisation rétinienne moins donné à une haute pression, ce qui risque de rupture et d&#39;endommager les navires 1. Immunocoloration de l&#39;endothélium vasculaire avec fluorophore marqué G isolectine B4 (Alexa Fluor 594 conjugué; I21413; Invitrogen; dilution 1:100) et les supports plats rétine peut mettre en évidence l&#39;architecture globale des vaisseaux, mais sans visualisation détaillée des capillaires, les membranes basales et pericytes . Il a été noté parFriedenwald que les navires peuvent être mis en évidence par coloration plate-monts de rétine avec de l&#39;acide périodique Schiff (PAS) ou hématoxyline et l&#39;éosine (H &amp; E) coloration 10. Cependant, la coloration était non spécifique aux vaisseaux et a souligné le tissu non vasculaire ainsi, il est difficile de différencier les vaisseaux. Dans les années 1960, Cogan et Kuwabara développé la technique la trypsine digest qui a rendu plus facile de visualiser la vascularisation rétinienne en digérant les composantes non vasculaires de la rétine 1. Depuis ce temps, la trypsine digest est devenue la méthode de référence dans l&#39;analyse de la vascularisation de la rétine 2-5. Cependant, il est important de noter que d&#39;autres alternatives techniques pour isoler le système vasculaire ont été décrits. L&#39;utilisation de lyse osmotique a été utilisée pour isoler le système vasculaire et permettre des études biochimiques du tissu 11,12, mais la procédure n&#39;a pas été utilisé comme méthode principale pour l&#39;étude anatomique. Procédé d&#39;impression de tissu estutilisée pour isoler de larges segments de microvascularisation et permet la possibilité d&#39;étudier l&#39;architecture électrotonique de la vascularisation 13. En théorie, cette technique pourrait également être utilisée pour étudier les changements anatomiques, comme la qualité des vaisseaux est élevé. Cependant, il est seulement capable d&#39;isoler les segments de l&#39;ensemble du réseau vasculaire. Bien que ces méthodes ne peuvent pas remplacer la trypsine digérer, il est important de noter qu&#39;ils ont des avantages et des inconvénients et sont complémentaires à cet égard. La méthode digest trypsine est techniquement difficile et il est difficile de performer de façon constante 6,7. En outre, il a été noté que la trypsine digest est particulièrement difficile sur un modèle de souris, en particulier si l&#39;on veut préserver l&#39;architecture vasculaire global de la rétine 6,7. Les défis incluent (1) sur-digestion de la rétine qui entraîne une perte à la fois du système vasculaire ainsi que le tissu non vasculaire, (2) sous-digestion, exigeantdissection étendue mécanique qui pourrait à son tour conduire à des lésions de la chambre de cuve (3), une mauvaise séparation des tissus non vasculaires du système vasculaire qui conduit à une coloration non spécifique. Plusieurs manuscrits ont mis en évidence ces défis, mais aucune n&#39;a fourni un protocole détaillé et cohérent pour les surmonter 14,15. Ce manuscrit va introduire une méthodologie étape par étape décrivant la technique pour effectuer la trypsine digest sur la souris et le rat rétines avec des conseils spécifiques sur la manipulation des étapes particulièrement difficiles. Un aperçu schématique est illustré à la figure 1.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (1:250)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0458-50G</td>
			<td>Make 3% trypsin in 0.1 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td>Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 &deg;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253-500G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop sterile vacuum bottle</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td>Create filtered water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td>Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Forceps (Inox)</td>
			<td>Dumont #5</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forcepts (Dumostar)</td>
			<td>Dumont #7</td>
			<td>11297-10</td>
			<td>Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubnoff Metabolic Shaker Incubator</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>BDG59442</td>
			<td>Shaker optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-132</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model

Trypsine digest est la méthode de référence pour analyser la vascularisation rétinienne 1-5. Il permet de visualiser l&#39;ensemble du réseau de vaisseaux complexes tridimensionnels sanguins et des capillaires rétiniens en créant une plate-montage en deux dimensions des canaux vasculaires interconnectés après digestion des composants non-vasculaires de la rétine. Cela permet d&#39;étudier diverses modifications pathologiques vasculaires, tels que les micro-anévrismes, la dégénérescence capillaire et anormal endothéliales des ratios pericyte. Cependant, la méthode est techniquement difficile, surtout chez la souris, qui sont devenus le modèle animal le plus largement disponible pour étudier la rétine en raison de la facilité de manipulations génétiques 6,7. Dans l&#39;oeil de la souris, il est particulièrement difficile de supprimer complètement les composants non-vasculaires tout en conservant l&#39;architecture globale des vaisseaux sanguins de la rétine. À ce jour, il ya une pénurie de littérature qui décrit la technique de digérer la trypsine en détail in la souris. Ce manuscrit fournit une méthodologie détaillée de la trypsine digest dans la rétine de souris, étape par étape, tout en fournissant des conseils sur les étapes de dépannage difficiles.

Le produit final d&#39;une procédure réussie est une plate-montage de l&#39;ensemble du réseau de la vascularisation rétinienne de la souris, avec l&#39;architecture maintenu, colorées avec soit PAS / hématoxyline ou H &amp; E, comme indiqué dans les figures 2-4. Effacer la différenciation des cellules endothéliales et des péricytes peut être considéré comme le montre la figure 3. Dans la rétine, les noyaux des cellules endothéliales sont de forme ovale ou allongée et se...

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Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsine digest est l&#39;une des méthodes les plus couramment utilisées pour analyser la vascularisation rétinienne. Ce manuscrit décrit la méthode en détail, y compris les modifications clés pour optimiser la technique et retirer le tissu non vasculaire tout en préservant l&#39;architecture d&#39;ensemble des navires.

Trypsine protocole Digest pour analyser la vascularisation rétinienne d&#39;un modèle de souris

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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