Name: trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model
Uploaded: 2013-06-13T13:00:00
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この作品は、部分的にNIH RO1-EY019951（AAF）、失明予防のためのイリノイ学会（JCC、AAF）、盲目（RPB）を防止するための研究から眼科への無制限の資金、NYとRPB医学生フェローシップグラントによってサポートされていました（JCC）。

1。網膜準備<ol><li>マウスの目を摘出。片手を使用して、目が見えるようにまぶたを開く。もう一方の手で、湾曲した鉗子（湾曲した上向き）を使用して、軌道の優れたと劣る面に圧力を適用する地球儀突出まで。ゆっくり目の後部側面に鉗子を閉じ、目を摘出するための連続動作で持ち上げます。 </li><li>中性の10％は、少なくとも24時間緩衝ホルマリンで目を修正。 </li><li>小さなペトリ皿?...

<ol>
	<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture.">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).</li><li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+patterns.+VII.+Acellular+change.">Retinal vascular patterns. VII. Acellular change.</a> Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).</li><li>Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathologic+and+trypsin+digestion+studies+of+the+retina+in+incontinentia+pigmenti.">Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti.</a> Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).</li><li>Danis, R. P., Wallow, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRP/trypsin+technique+for+studies+of+the+retinal+vasculature.">HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).</li><li>Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+studies+of+the+retina+in+a+new+diabetic+model;+SHR/N:Mcc-cp+rat.">Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat.</a> Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).</li><li>Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+mouse+retina.+Endothelial+cell-pericyte+ratio+and+capillary+distribution.">Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).</li><li>Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+procedures+for+isolating+intact+retinal+vascular+beds+from+diabetic+humans+and+animal+models.">Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).</li><li>Midena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+retina+of+the+diabetic+db/db+mouse.+I.+Endothelial+cell-pericyte+ratio.">Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio.</a> Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+30.">Chapter 30.</a> Diabetic Retinopathy. , (2005).</li><li>Rosenblatt, B., Benson, W. E., Yannoff, M., Duker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6.19+Diabetic+Retinopathy.">Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy.</a> Ophthalmology. , (2008).</li><li>Friedenwald, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+some+problems+of+retinal+vascular+disease.">A new approach to some problems of retinal vascular disease.</a> Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).</li><li>Podesta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bax+is+increased+in+the+retina+of+diabetic+subjects+and+is+associated+with+pericyte+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro.</a> Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).</li><li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy.">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).</li><li>Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-term+siRNA+strategy+regulates+fibronectin+overexpression+and+improves+vascular+lesions+in+retinas+of+diabetic+rats.">A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats.</a> Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+eNOS-knockout+mice+develop+accelerated+retinopathy.">Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).</li></ol>

トリプシン消化は、網膜の血管系を評価するための標準的な方法です。残念ながら、それは技術的に困難であると正しく実行されていない場合、試料の損失率の高さになることがあります。また、手順は眼疾患の一般的に使用される遺伝子動物モデルにおいて、この技術の適用を制限することができる、マウスでは特に困難である。本稿では、マウスの目に効果的かつ一貫して手順を実行す?...

網膜の血管系を可視化することは、糖尿病性網膜症などの様々な眼疾患のメカニズムを分析するための極めて重要なアプローチである。それは1つが瘤、毛細血管変性、および周皮細胞損失8,9含めて早い血管の異常を、評価することができます。現在までに、網膜血管構造を分析するために開発されたいくつかの手法がありました。種々の染料の灌流は、血管を強調するために使用されてきたが、すべてが同様の制限を共有している。船舶1を破裂し、損傷リスクが高い圧力で与えられない限り、注射はめったに全体網膜血管構造を強調していません。蛍光色素で標識されたGのB4イソレクチン（; I21413、インビトロジェン、共役アレクサフルーア594 1:100希釈）と血管内皮の免疫染色と網膜のフラットマウントすると、血管の全体的なアーキテクチャを強調するが、毛細血管の詳細な可視化、基底膜と周皮なしですることができます。それはによって指摘されたFriedenwaldその容器はヨウ素酸シッフ（PAS）またはヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色10と網膜のフラットマウントを染色することによって強調することができます。しかし、染色は血管に非特異的であったと同様に、非血管組織を強調し、それが困難な血管を区別すること。 1960年代に、コーガンと桑原は、簡単に網膜1の非血管の成分を消化することによって網膜の血管系を可視化するために作られたトリプシン消化法を開発しました。その時以来、トリプシン消化は、網膜2-5の血管系を分析する中で、金の標準的な方法となっています。しかしながら、脈管構造を分離する他の代替技術が記載されていることに留意することが重要である。浸透圧溶解の使用は脈管構造を分離し、組織11,12の生化学的研究を可能にするために使用されてきたが、手順は、解剖学的研究のための主要な方法として使用されていない。組織プリント方法がされている微小血管系の大きなセグメントを分離するために使用され、血管系13の電気緊張アーキテクチャを研究する能力を可能にします。理論的に、この技術はまた、容器の品質が高いほど、解剖学的変化を研究するために使用することができる。しかし、それだけで血管系ネットワーク全体のセグメントを単離することができる。これらの方法はトリプシン消化を置き換えることはできないが、それは、異なる利点および欠点を持っており、この点で相補的であることに注意することが重要である。 トリプシン消化方法は技術的に困難であり、常に6,7を行うことが困難である。さらに、それは、一欲望網膜6,7の全体的な血管のアーキテクチャを維持する場合は特に、トリプシン消化は、マウスモデルでは特に困難であることが指摘されている。課題は必要とする（1）脈管構造ならびに非血管組織の両方の損失を引き起こす網膜の過剰消化、（2）下の消化を含むにおける血管床の損傷にリードを回すことができる大規模な機械的な解剖、非特異的染色につながる血管系から非血管組織（3）貧しい分離。いくつかの原稿では、これらの課題を強調しているが、どれも彼らに14,15を克服するための詳細かつ一貫性のあるプロトコルを提供していない。本稿では、特に難しい手順の取り扱い上の特定のヒントを、マウスとラットの網膜にトリプシン消化を実行するための手法を詳述し、ステップバイステップの方法論を紹介します。概略図を図1に示されている。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (1:250)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0458-50G</td>
			<td>Make 3% trypsin in 0.1 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td>Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 &deg;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253-500G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop sterile vacuum bottle</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td>Create filtered water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td>Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Forceps (Inox)</td>
			<td>Dumont #5</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forcepts (Dumostar)</td>
			<td>Dumont #7</td>
			<td>11297-10</td>
			<td>Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubnoff Metabolic Shaker Incubator</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>BDG59442</td>
			<td>Shaker optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-132</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model

トリプシン消化は、網膜血管系1-5を分析するための金標準的な方法です。これは、網膜の非血管成分の消化後に相互接続された脈管の二次元の平らなマウントを作成することによって複雑な三次元網膜血管および毛細血管のネットワーク全体の可視化を可能にする。これは、1つは、このような瘤などの様々な病的血管の変化、キャピラリー変性、および周皮細胞の比率に異常な内皮を勉強することができます。しかし、この方法は、原因遺伝子操作の容易6,7の網膜を研究するために最も広く利用できる動物モデルとなってきた、特にマウスでは、技術的に困難である。マウスの眼では、網膜血管の全体的なアーキテクチャを維持しながら、完全に非血管性成分を除去することが特に困難である。現在までに、詳細にトリプシンダイジェスト技術が記載文学の不足があるInのマウス。また困難な手順のトラブルシューティングに関するヒントを提供しながら、本稿では、マウス網膜におけるトリプシン消化物の詳細なステップバイステップの方法論を提供します。

成功した手順の最終製品は、 図2-4に示すようなアーキテクチャは、PAS /ヘマトキシリンまたはH＆Eのどちらかで染色し、維持したまま、マウスの網膜血管系のネットワーク全体のフラットマウントです。 図3に示すように、内皮細胞および周皮細胞の明確な区別が分かる。網膜では、内皮細胞の核は楕円形または細長いあり、血管壁内に完全にうそをつく。周皮細胞?...

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Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

トリプシン消化は、網膜血管系を分析するために最も一般的に使用される方法の1つである。本稿では、技術を最適化し、船舶の全体的なアーキテクチャを維持しながら、非血管組織を除去するための重要な変化を含めて詳細に方法を説明します。

トリプシン消化プロトコルモデルマウスの網膜血管系を分析する

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

暗順応スライス標本におけるマウス網膜神経細胞からパッチクランプ記録

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

網膜色素上皮の全マウントするためのマウスの眼の解剖

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

網膜神経節細胞の生存を研究するために視神経挫滅モデルマウス

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

網膜切片の形態学的解析

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

ラットの脳から脳表面血管系および関連髄膜の解剖と脈絡叢のビジュアル解説

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

マウスの網膜神経節細胞におけるシナプスと人工コンダクタンスによるダイナミッククランプの実装

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

角膜マイクロアッセイ：マウス眼における血管新生のモデル

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

マウス脳のさまざまな領域におけるテロメラーゼ活性：非放射性テロメラーゼリピート増幅プロトコル（TRAP）アッセイ

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

マウスにおける胃腸の運動を分析するためにビデオ画像と時空間マップ

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

ウィリスのマウスサークルを単離するためのプロトコル

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...