Name: trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model
Uploaded: 2013-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Society for Prevention of Blindness (JCC, AAF), frie midler til Institutt for Ophthalmology fra forskning for å forhindre blindhet (RPB), NY og RPB Medical Student Fellowship Grant (JCC).

En. Retinal Forberedelse <ol><li> Enucleate musen øyet. Ved hjelp av en hånd, åpnes øyelokkene, slik at øyet er synlig. Med den andre hånden, ved hjelp av en buet pinsett (buede vendt oppover), press på øvre og nedre sider av den bane inntil jordkloden stikker. Lukk forsiktig tang ved den bakre del av øyet og løft i en kontinuerlig bevegelse til enucleate øyet. </li><li> Fix øyet med 10% nøytral bufret formalin i minst 24 timer. </li><li> Plasser øye i PBS-løsning i en liten petriskål. </li><li> Dissek...

<ol>
	<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture.">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).</li><li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+patterns.+VII.+Acellular+change.">Retinal vascular patterns. VII. Acellular change.</a> Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).</li><li>Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathologic+and+trypsin+digestion+studies+of+the+retina+in+incontinentia+pigmenti.">Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti.</a> Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).</li><li>Danis, R. P., Wallow, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRP/trypsin+technique+for+studies+of+the+retinal+vasculature.">HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).</li><li>Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+studies+of+the+retina+in+a+new+diabetic+model;+SHR/N:Mcc-cp+rat.">Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat.</a> Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).</li><li>Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+mouse+retina.+Endothelial+cell-pericyte+ratio+and+capillary+distribution.">Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).</li><li>Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+procedures+for+isolating+intact+retinal+vascular+beds+from+diabetic+humans+and+animal+models.">Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).</li><li>Midena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+retina+of+the+diabetic+db/db+mouse.+I.+Endothelial+cell-pericyte+ratio.">Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio.</a> Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+30.">Chapter 30.</a> Diabetic Retinopathy. , (2005).</li><li>Rosenblatt, B., Benson, W. E., Yannoff, M., Duker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6.19+Diabetic+Retinopathy.">Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy.</a> Ophthalmology. , (2008).</li><li>Friedenwald, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+some+problems+of+retinal+vascular+disease.">A new approach to some problems of retinal vascular disease.</a> Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).</li><li>Podesta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bax+is+increased+in+the+retina+of+diabetic+subjects+and+is+associated+with+pericyte+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro.</a> Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).</li><li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy.">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).</li><li>Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-term+siRNA+strategy+regulates+fibronectin+overexpression+and+improves+vascular+lesions+in+retinas+of+diabetic+rats.">A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats.</a> Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+eNOS-knockout+mice+develop+accelerated+retinopathy.">Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).</li></ol>

Trypsin digest er en standard metode for å vurdere vaskulatur av netthinnen. Dessverre er det teknisk utfordrende og kan resultere i høye frekvensen av prøven tap dersom ikke riktig utført. Videre er fremgangsmåten spesielt vanskelig i mus, noe som kan begrense anvendelsen av denne teknikk i vanlig brukte genetiske dyremodeller av øyesykdommer. Denne artikkelen gir veiledning om hvordan du skal utføre prosedyren effektivt og konsekvent i mus øyne. Det er flere viktige skritt i protok...

Visualisere blodkar i netthinnen er en ekstremt viktig tilnærming for å dissekere mekanismene for ulike øyesykdommer som diabetisk retinopati. Det gjør det mulig å vurdere de tidligste karlidelser, inkludert microaneurysms, kapillær degenerasjon, og pericyte tap 8,9. Hittil har det vært flere teknikker utviklet for å analysere retinal blodkar. Perfusjon av ulike fargestoffer har blitt brukt til å markere skipene, men alle har delt samme begrensninger. Injeksjon fremhever sjelden hele retinal blodkar mindre gitt på et høyt trykk, som risikerer sprekker og skader på skipene en. Farging av blodåreendotelets med fluorophore-merket G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 konjugert; I21413, Invitrogen, 1:100 fortynning) og netthinnens flate mounts kan markere den generelle arkitekturen av skipene, men uten detaljert visualisering av kapillærene, kjelleren membraner og pericytes . Det ble bemerket avFriedenwald at fartøy kan bli markert ved farging flat-beslag av netthinnen med periodiske syre-Schiff (PAS) eller hematoxylin og eosin (H &amp; E) farging 10. Imidlertid var flekker uspesifikk til skipene og fremhevet den ikke-vaskulære vev i tillegg, noe som gjør det vanskelig å skille skipene. I 1960, utviklet Cogan og Kuwabara trypsin fordøye teknikk som gjorde det lettere å visualisere retinal blodkar ved å fordøye de nonvascular komponentene i netthinnen en. Siden den gang har trypsin fordøye blitt gullstandarden metode i å analysere blodkar i netthinnen 2-5. Det er imidlertid viktig å merke seg at andre alternative teknikker for å isolere blodkar er blitt beskrevet. Bruken av osmotisk lysering har blitt brukt for å isolere blodkar og tillate biokjemiske studier av vevet 11,12, men fremgangsmåten er ikke benyttet som en primær fremgangsmåte for anatomisk undersøkelse. Vevet print metoden har værtanvendt for isolering av store segmenter av mikrosirkulasjon og tillater evnen til å studere den electrotonic arkitekturen av vaskulaturen 13.. I teorien kunne denne teknikk også anvendes til å studere anatomiske forandringer, som kvaliteten av fartøyene er høy. Det er imidlertid bare i stand til å isolere deler av blodkar hele nettverket. Selv om disse metodene ikke kan erstatte trypsin fordøye, er det viktig å merke seg at de har forskjellige fordeler og svakheter, og er komplementære i denne forbindelse. Det trypsin-digest metoden er teknisk krevende og er vanskelig å utføre gjennomgående 6,7. Videre har det blitt bemerket at trypsin digest er spesielt vanskelig på en musemodell, særlig hvis man ønsker å bevare den totale vaskulær arkitekturen av netthinnen 6,7. Utfordringene omfatter (1) over-fordøyelse av retina som forårsaker tap av både blodkar samt ikke-vaskulært vev, (2) under-fordøyelse, som kreveromfattende mekanisk disseksjon som igjen kan føre til skader på fartøyet sjikt, (3) dårlig separering av den ikke-vaskulære vev fra det vaskulære karet som fører til ikke-spesifikk farging. Flere manuskripter har fremhevet disse utfordringene, men ingen har gitt en detaljert og konsistent protokollen for å overvinne dem 14,15. Dette manuskriptet vil innføre en trinn-for-trinn metode detaljering teknikk for å utføre trypsin fordøye på mus og rotter netthinne med konkrete tips om håndtering av spesielt vanskelige trinn. En skjematisk oversikt er vist i figur 1..

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (1:250)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0458-50G</td>
			<td>Make 3% trypsin in 0.1 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td>Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 &deg;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253-500G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop sterile vacuum bottle</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td>Create filtered water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td>Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Forceps (Inox)</td>
			<td>Dumont #5</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forcepts (Dumostar)</td>
			<td>Dumont #7</td>
			<td>11297-10</td>
			<td>Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubnoff Metabolic Shaker Incubator</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>BDG59442</td>
			<td>Shaker optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-132</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model

Trypsin fordøye er gullstandarden metode for å analysere retinal blodkar 1-5. Den tillater visualisering av hele nettverket av komplekse tredimensjonale retinale blodkar og kapillærer ved å skape en todimensjonal flate-montering av de sammenkoblede vaskulære kanaler etter oppslutning av de ikke-vaskulære komponenter av netthinnen. Dette gjør det mulig å studere ulike patologiske vaskulære endringer, for eksempel microaneurysms, kapillær degenerasjon og unormal endotelceller til pericyte forholdstall. Imidlertid er fremgangsmåten teknisk krevende, særlig hos mus, som er blitt den mest tilgjengelige dyremodell for å studere retina på grunn av den enkle genetiske manipulasjoner 6,7. I mus øyet, er det spesielt vanskelig å fjerne ikke-vaskulære komponenter og samtidig opprettholde den generelle arkitekturen av de retinale blodkar. Til dags dato, er det en mangel på litteratur som beskriver trypsin fordøye teknikken i detalj in musen. Dette manuskriptet gir en detaljert steg-for-trinn metode for trypsin fordøye i mus netthinnen, samtidig gir tips om feilsøking vanskelige trinn.

Det endelige produkt av en vellykket prosedyre er en flat-montering av hele nettverket av musen retinal vaskulatur, med arkitekturen opprettholdt, farget med PAS / hematoxylin eller H &amp; E, som vist i figurene 2-4. Klar differensiering av endoteliale celler og pericytes kan sees som vist i figur 3.. I netthinnen kjerner av endotelcellene er oval eller langstrakt og ligge helt innenfor karveggen. Pericyte atomkjerner er små, kuleformede, beis tett og generelt har en utstående stilli...

Watch this Scientific Journal Video about Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model at JoVE.com

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsin fordøye er en av de mest brukte metodene for å analysere retinal blodkar. Dette manuskriptet beskriver metoden i detalj, inkludert viktige endringer for å optimalisere teknikken og fjerne ikke-vaskulære vev samtidig bevare den generelle arkitekturen av skipene.

Trypsin Digest protokollen til Analyser Retinal blodkar av en mus modell

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morfometriske Analyser av netthinnens Seksjoner

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

A Visual Beskrivelse av Dissection av Cerebral Surface blodkar og Associated hjernehinnene og årehinnen plexus fra Rat Brain

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Implementering Dynamic Clamp med Synaptic og kunstig conductances i mus retinal ganglion celler

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Hornhinnen Micropocket analysen: En modell av Angiogenese i Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase aktivitet i de ulike regionene i Mouse Brain: ikke-radioaktive Telomerase Gjenta Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

Video Imaging og Spatiotemporal Maps for å analysere gastrointestinal motilitet i Mus

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

Protokoll for isolere Mouse Circle of Willis

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...