Name: trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model
Uploaded: 2013-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model at JoVE.com

Este trabajo fue parcialmente apoyado por el NIH RO1-EY019951 (AAF), Sociedad de Illinois para la Prevención de la Ceguera (JCC, AAF), los fondos de libre disposición para el Departamento de Oftalmología de la investigación para prevenir la ceguera (RPB), Nueva York y RPB Medical Student Fellowship subvención (JCC).

1. Preparación de retina <ol><li> Enucleación del ojo del ratón. Uso de un lado, abrir las tapas del ojo para que el ojo es visible. Con la otra mano, usando unas pinzas curvas (curvas mirando hacia arriba), aplique presión en los aspectos superior e inferior de la órbita hasta que sobresalga el globo. Cierre suavemente fórceps en el aspecto posterior del ojo y levantar en un movimiento continuo a enucleación del ojo. </li><li> Fijar ojo con 10% formalina tamponada neutra durante al menos 24 horas. </li><li> Lu...

<ol>
	<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture.">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).</li><li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+patterns.+VII.+Acellular+change.">Retinal vascular patterns. VII. Acellular change.</a> Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).</li><li>Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathologic+and+trypsin+digestion+studies+of+the+retina+in+incontinentia+pigmenti.">Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti.</a> Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).</li><li>Danis, R. P., Wallow, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRP/trypsin+technique+for+studies+of+the+retinal+vasculature.">HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).</li><li>Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. 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Endothelial cell-pericyte ratio.</a> Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+30.">Chapter 30.</a> Diabetic Retinopathy. , (2005).</li><li>Rosenblatt, B., Benson, W. E., Yannoff, M., Duker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6.19+Diabetic+Retinopathy.">Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy.</a> Ophthalmology. , (2008).</li><li>Friedenwald, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+some+problems+of+retinal+vascular+disease.">A new approach to some problems of retinal vascular disease.</a> Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).</li><li>Podesta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bax+is+increased+in+the+retina+of+diabetic+subjects+and+is+associated+with+pericyte+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro.</a> Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).</li><li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy.">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).</li><li>Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-term+siRNA+strategy+regulates+fibronectin+overexpression+and+improves+vascular+lesions+in+retinas+of+diabetic+rats.">A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats.</a> Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+eNOS-knockout+mice+develop+accelerated+retinopathy.">Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).</li></ol>

Digestión con tripsina es un método estándar para evaluar la vasculatura de la retina. Por desgracia, es técnicamente difícil y puede dar lugar a alta tasa de pérdida de muestra si no se realiza correctamente. Además, el procedimiento es especialmente difícil en ratones, lo cual puede limitar la aplicación de esta técnica en los modelos animales genéticos comúnmente utilizados de enfermedades de los ojos. Este documento proporciona una guía sobre cómo llevar a cabo con eficacia y coherencia del procedimien...

Visualización de la vasculatura de la retina es un enfoque extremadamente importante para diseccionar los mecanismos de diversas enfermedades oculares tales como retinopatía diabética. Esto permite evaluar las anormalidades vasculares tempranas, como microaneurismas, degeneración capilar, y la pérdida de pericitos 8,9. Hasta la fecha, se han realizado varias técnicas desarrolladas para analizar la vasculatura de la retina. La perfusión de varios tintes se ha utilizado para resaltar los vasos, pero todos han compartido las mismas limitaciones. Inyección rara vez se pone de relieve toda la vasculatura de la retina a menos dado a una alta presión, lo que corre el riesgo de romperse y dañar los vasos 1. La inmunotinción del endotelio vascular con fluoróforo marcado con T isolectina B4 (Alexa Fluor 594 conjugado; I21413; Invitrogen; dilución 1:100) y montajes planos de retina puede resaltar la arquitectura general de los vasos, pero sin visualización detallada de los capilares, la membrana basal y pericitos . Se tomó nota deFriedenwald que los barcos se pueden destacar por tinción planas montes de retina con ácido periódico de Schiff (PAS) o hematoxilina y eosina (H &amp; E) tinción 10. Sin embargo, la tinción no era específica para los vasos y pone de relieve el tejido no vascular, así, por lo que es difícil de diferenciar de los vasos. En la década de 1960, Cogan y Kuwabara desarrollaron la técnica de digestión con tripsina que hace más fácil la visualización de la vasculatura de la retina mediante la digestión de los componentes no vasculares de la retina 1. Desde ese momento, la digestión con tripsina se ha convertido en el método estándar de oro en el análisis de la vasculatura de la retina 2-5. Sin embargo, es importante señalar que se han descrito otras técnicas alternativas para aislar la vasculatura. El uso de la lisis osmótica se ha utilizado para aislar la vasculatura y permitir estudios bioquímicos del tejido 11,12, pero el procedimiento no se ha utilizado como un método principal para el estudio anatómico. El método de impresión tejido ha sidoutilizado para aislar grandes segmentos de la microvasculatura y permite la posibilidad de estudiar la arquitectura electrotónico de la vasculatura 13. En teoría, esta técnica podría utilizarse también para estudiar los cambios anatómicos, como la calidad de los vasos es alta. Sin embargo, sólo es capaz de aislar segmentos de toda la red de vasculatura. Aunque estos métodos no pueden sustituir a digestión con tripsina, es importante tener en cuenta que tienen diferentes ventajas y desventajas y son complementarias a este respecto. El método de digestión con tripsina es técnicamente difícil y es difícil de realizar consistentemente 6,7. Por otra parte, se ha observado que la digestión con tripsina es especialmente difícil en un modelo de ratón, en particular si se desea preservar la arquitectura vascular general de la retina 6,7. Los desafíos incluyen (1) sobre la digestión de la retina que causa la pérdida tanto de la vasculatura así como el tejido no vascular, (2) bajo la digestión, lo que requiereamplia disección mecánica que podría a su vez conducir a un daño de la cama buque, (3) pobre separación del tejido no vascular de los vasos principales de la tinción inespecífica. Varios manuscritos han destacado estos desafíos, pero ninguno ha proporcionado un protocolo detallado y consistente para superarlos 14,15. Este manuscrito introducirá una metodología paso a paso que detalla la técnica para realizar la digestión con tripsina en ratón y rata retinas con consejos específicos sobre el manejo de los pasos particularmente difíciles. Una visión general esquemática se muestra en la Figura 1.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (1:250)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0458-50G</td>
			<td>Make 3% trypsin in 0.1 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td>Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 &deg;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253-500G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop sterile vacuum bottle</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td>Create filtered water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td>Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Forceps (Inox)</td>
			<td>Dumont #5</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forcepts (Dumostar)</td>
			<td>Dumont #7</td>
			<td>11297-10</td>
			<td>Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubnoff Metabolic Shaker Incubator</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>BDG59442</td>
			<td>Shaker optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-132</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model

Digestión con tripsina es el método estándar de oro para analizar la vasculatura de la retina 1-5. Se permite la visualización de la totalidad de la red de vasos complejas tridimensionales retina y capilares sanguíneos mediante la creación de un plano de montaje en dos dimensiones de los canales vasculares interconectados después de la digestión de los componentes no-vasculares de la retina. Esto permite estudiar varios cambios patológicos vasculares, tales como microaneurismas, degeneración capilar, y anormal endoteliales a las relaciones de pericitos. Sin embargo, el método es técnicamente difícil, especialmente en los ratones, que se han convertido en el modelo animal más ampliamente disponible para estudiar la retina debido a la facilidad de manipulaciones genéticas 6,7. En el ojo del ratón, que es particularmente difícil de eliminar por completo los componentes no vasculares, mientras que el mantenimiento de la arquitectura general de los vasos sanguíneos de la retina. Hasta la fecha, hay una escasez de literatura que describe la técnica de digestión con tripsina en detalle in el ratón. Este manuscrito ofrece una metodología detallada de la digestión con tripsina en la retina del ratón, paso a paso, mientras que también proporciona consejos para la solución de problemas difíciles pasos.

El producto final de un procedimiento exitoso es un montaje plana de toda la red de la vasculatura de la retina del ratón, con la arquitectura mantiene, se tiñeron con cualquiera de PAS / hematoxilina o H &amp; E, como se muestra en las Figuras 2-4. Claro diferenciación de las células endoteliales y los pericitos se puede ver como se muestra en la Figura 3. En la retina, los núcleos de las células endoteliales son oval o alargada y situada completamente dentro de la pared del vaso...

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Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Digestión con tripsina es uno de los métodos más comúnmente utilizados para analizar vasculatura de la retina. Este manuscrito describe el método en detalle, incluyendo alteraciones clave para optimizar la técnica y eliminar el tejido no vascular, mientras que la preservación de la arquitectura general de los vasos.

Tripsina Protocolo Resumen Para analizar la vasculatura de la retina de un modelo de ratón

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Investigación

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